從全血和體液中提取基因組DNA的操作步驟精

#50ul已溫?zé)岬?8C的彌散液，輕輕放入濾膜的表面，濾器在水浴58C保溫10分鐘。離心8000rpm,1min.,DNA彌散液便濾入到干凈的1.5ml離心管內(nèi)。此DNA彌散液可即時(shí)作PCR實(shí)驗(yàn)用。提取完畢。附：從100ul全血或體液中提取基因組DNA⑴裂解1：取100ul全血，血槳，血清或淋巴細(xì)胞放入到1.5ml的離心管中，加入100ul的裂解液1。上下翻轉(zhuǎn)，使沉淀物分散，旋轉(zhuǎn)脈動(dòng)15秒后放入離心機(jī)中離心，離心速率為14000rpm，1min.。倒掉上層液，可見離心管底部有微量沉淀。重復(fù)此裂解步驟一次，這次也是加100ul裂解液1。最后用移液管吸凈所有上清液棄去,以使離心管底部的沉淀不再殘留有裂解液1。⑵裂解2:在上面離心管中加入100ul的裂解液2。上下翻轉(zhuǎn)，務(wù)必使沉淀物分散，旋轉(zhuǎn)脈動(dòng)15秒后放入離心機(jī)中離心，14000rpm，1min.。倒掉上清液，重復(fù)此裂解步驟一次，這次仍然是加入100ul裂解液2,最后用移液管吸凈所有上清液棄去，以使離心管底部的沉淀不再殘留有裂解液2。⑶消化：吸取蛋白酶K5ul(=0.1mg)加入到上面的離心管中，用移液管尖頭反復(fù)吹打，使蛋白酶K與沉淀物均勻接觸后，加入60ul消化液，上下翻轉(zhuǎn)離心管，務(wù)必使沉淀物分散于消化液中。放入到58Co水浴中消化15分鐘。最后可見澄明的消化液體。⑷純化：在上面的消化液體中加入20ul純化液，上下翻轉(zhuǎn)離心管幾下后，離心，速率為14000rpm,1min，把上清液吸出放入到裝有160ul無水乙醇的1.5ml離心管中，輕輕上下翻轉(zhuǎn)10次，可見溶液稍有混濁就是絮狀DNA析出。⑸收集：把有絮狀DNA的溶液倒入微型柱過濾器(包括濾柱和收集管)中，濾器放入離心機(jī)內(nèi)離心，離心速率8000rpm,1min..DNA便附著在濾漠上，棄去濾液,把柱濾器放回收集管上。⑹吸取50ul70%乙醇于濾柱內(nèi)，離心800rpm，1min，棄去濾液。把濾柱放回收集管上，再離心15000rpm，1min..使吸附在濾膜上的DNA不再附有乙醇。⑺回收DNA:把上面附著DNA的濾柱放入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中。吸取50ul已溫?zé)岬?8C的彌散液，輕輕放入濾膜的表面，濾器在水浴58oC保溫10分鐘。離心8000rpm，1min.，DNA彌散液便濾入到干凈的1.5ml離心管內(nèi)。此DNA彌散液可即時(shí)作PCR實(shí)驗(yàn)用。提取完畢。三.從10ml全血中提取基因組DNA的操作步驟設(shè)備要求：離心機(jī)能放入50ml的離心管。由于離心速率低，因而離心時(shí)間長(zhǎng)一些。⑴裂解1：取10ml抗凝的全血放入到50ml的離心管中，加入10ml裂解液1。上下翻轉(zhuǎn),使沉淀物分散,在振搖機(jī)中振搖10分鐘,放入離心機(jī)中離心,離心速率為2200rpm,10min..可見離心管底部有血色沉淀.倒掉上層液，重復(fù)此裂解步驟一次，這次仍然是加入10ml裂解液1。最后用移液管吸凈所有上清液棄去,以使離心管底部的血色沉淀不再殘留有裂解液1。⑵裂解2:在上面離心管中加入10ml裂解液2。在振搖機(jī)中振搖10分鐘，務(wù)必使沉淀物分散，放入離心機(jī)中離心，離心速率為2200rpm,10min..可見離心管底部有少量灰色沉淀.倒掉上層液,留下沉淀.。重復(fù)此提取步驟一次,這次仍然是加入10ml裂解液2。最后用移液管吸凈所有上清液棄去，以使離心管底部的灰白色沉淀不再殘留有裂解液2。⑶消化：吸取蛋白酶K100ul(=2mg)加入到上面的離心管中，用移液管尖頭反復(fù)吹打，使蛋白酶K與沉淀物均勻接觸后，加入1.6ml消化液，振搖3分鐘，放入58C水浴中消化1小時(shí)。消化其間，要取出離心管用手拍打一下，幫助內(nèi)容物均勻消化。最后可見澄明的消化液體。⑷純化：在上面的消化液體中加入600ul純化液，混勻后，離心，速率為2800rpm,15min把上清液吸出放入到裝有5ml無水乙醇的帶蓋的管中，輕輕上下翻轉(zhuǎn)10次，可見絮狀DNA析出。用帶鉤的玻璃棒挑起絮狀DNA放入到1000ul的70%乙醇中耒回漂洗20次，鉤出DNA,在空氣中涼干一下后放入到500ul彌散液中。把DNA彌散液保存于4oC，過夜，使之充分彌散。提取完畢。如要立即用此DNA做PCR實(shí)驗(yàn)，把DNA彌散液放在58C水浴中，保溫30分鐘，用手指拍打離心管子，使DNA彌散后使用。提取完畢。附：如從5ml全血中提取DNA，只需按比例減少各步驟的試劑用量。四.從口腔兩頰刮物提取DNA的操作步驟DNA的濃度一般是3-23ug/ml,OD值為1.7-1.9。⑴裂解1:吸取600ulPBS到1.5ml離心管中，剪入刮頰刷.旋轉(zhuǎn)脈動(dòng)15秒.加入400ul裂解液1.旋轉(zhuǎn)脈動(dòng)15秒后放入離心機(jī)中離心,8000rpm,1min..倒掉上層液。重復(fù)此提取步驟一次，這次是加入1000U1裂解液1。最后用移液管吸凈所有上清液棄去,以使離心管底部的沉淀不再殘留有裂解液1。⑵裂解2:在上面離心管中加入1000ul裂解液2.旋轉(zhuǎn)脈動(dòng)15次后放入離心機(jī)中離心,8000rpm,1min..可見離心管底部有微量沉淀.倒掉上層清液。重復(fù)此裂解步驟一次，這次仍是加入1000ul裂解液2。最后用移液管吸凈所有上清液棄去,以使離心管底部的沉淀不再殘留有裂解液2。刮刷留在離心管內(nèi)。⑶消化：吸取20ul蛋白酶液（=0.4mg）加入到上面的離心管中，旋轉(zhuǎn)脈動(dòng)一下,再加入160ul消化液，又旋轉(zhuǎn)脈動(dòng)一下后，放入58oC水浴中消化15分鐘.取出后可見澄清的消化液。離心8000rpm,20秒，把蓋上的液滴回落到管中.然后輕輕取出刮刷去掉.⑷純化：加入60ul純化液到上面離心管中，旋轉(zhuǎn)脈動(dòng)一下，放入離心機(jī)中離心，15000rpm,1min。把上清液吸出放入到240ul無水乙醇中輕輕上下翻轉(zhuǎn)10次,可見云狀DNA析出，并浮于液面..⑸收集:把上液倒入微型過濾器中,濾器放入離心機(jī)內(nèi)離心:8000rpm,1min..DNA便附著在濾漠上.棄去收集管中的濾液。⑹吸取50ul70%.乙醇于濾柱內(nèi).離心8000rpm,1min.棄去收集管中的濾液。再次離心，離心速率為15000rpm,1min.，使吸附在濾膜上的DNA不再附有乙醇。⑺