青霉素?；傅姆蛛x純化

關(guān)于青霉素?；傅姆蛛x純化第一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四青霉素青霉素是常見抗生素之一。來源于點(diǎn)青霉、產(chǎn)黃青霉等真菌。對革蘭氏陽性菌的生長有抑制作用青霉素第二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四青霉素的分類第三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四青霉素的代謝途徑α-氨基己二酸半胱氨酸纈氨酸α-氨基己二酰半胱氨酰纈氨酸異青霉素N青霉素ACVSIPNSAT第四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四AT是一系列不同的酶。不同的AT催化不同的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成不同的青霉素添加苯乙酸相應(yīng)的AT催化它與異青霉素N反應(yīng)生成青霉素G添加苯氧乙酸時(shí)，相應(yīng)的AT催化它與異青霉素N反應(yīng)生成青霉素V第五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四青霉素酰化酶1950年，日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉和米曲霉的菌絲可以分解青霉素得苯乙酸和另一種有機(jī)物（后被證實(shí)為6-APA）經(jīng)研究，這一反應(yīng)由青霉素?；复呋私z狀真菌外，一些細(xì)菌和酵母中也檢測到青霉素?；傅幕钚缘诹?，共九十七頁，編輯于2023年，星期四青霉素酰化酶的結(jié)構(gòu)青霉素?；傅慕Y(jié)構(gòu)差異較大。大腸桿菌（Escherichiacoli）青霉素G?；赣幸粋€(gè)α亞基和一個(gè)β亞基球形芽胞桿菌（Bacillussphaericus）的青霉素酰化酶是一個(gè)四聚體第七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四第八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四第九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四催化的反應(yīng)青霉素?；窻COOH+青霉素6-APA第十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四分類按照底物的不同，可以將青霉素酰化酶分為青霉素G酰化酶、青霉素V酰化酶和氨芐西林?；傅谑豁?，共九十七頁，編輯于2023年，星期四應(yīng)用制備β-內(nèi)酰胺類抗生素中間體（6-APA）半合成新的β-內(nèi)酰胺抗生素手性藥物基團(tuán)保護(hù)第十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四當(dāng)前青霉素?；傅囊恍┭芯糠较虻鞍踪|(zhì)工程固定化分離純化第十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四傳統(tǒng)的分離純化方法硫酸銨沉降葡聚糖凝膠色譜離子交換色譜電泳第十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四據(jù)我們組閱讀的文獻(xiàn)，傳統(tǒng)方法分離青霉素?；傅幕厥章蚀蟛糠衷?0%至50%有必要開發(fā)新型提純工藝第十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四新型分離純化方法一、色譜法1.擴(kuò)張床吸附色譜2.整體柱色譜3.疏水性電荷誘導(dǎo)色譜4.一步離子交換色譜完成分離純化第十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四二、固定化金屬親和膜分離法三、其它方法1.雙水相萃取2.高通量篩選輔助設(shè)計(jì)分離純化工藝第十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四新方法提純青霉素?；傅幕厥章士蛇_(dá)到90%第十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四讓我們一起分享這些奇妙的分離純化方法第十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四膜分離膜分離技術(shù)是指在分子水平上不同粒徑分子的混合物在通過半透膜時(shí)，實(shí)現(xiàn)選擇性分離的技術(shù)第二十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四傳統(tǒng)的膜分離包括：微濾膜（MF）、超濾膜（UF）、納濾膜（NF）、反滲透膜（RO）等第二十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四親和膜分離親和膜（affinitymembrane）：利用親和配基（染料、烷基、金屬離子等）修飾的濾膜。親和膜分離原理：是以親和膜為親和吸附介質(zhì)純化目標(biāo)產(chǎn)物的分離方法，是親和色譜的變型，又稱膜親和色譜第二十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四親和膜的優(yōu)勢具備膜分離和親和色譜雙重功能，提高了分離純化能力可以支持高流速操作，解決了色譜太耗時(shí)間的缺點(diǎn)易于放大第二十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四親和膜的制備方法一般方法膜材料→成膜→活化→配基偶聯(lián)，膜材料→活化→配基偶聯(lián)→成膜，第二十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四分離過程親和吸附→洗脫→親和膜再生

第二十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四固定化金屬親和膜用固定于膜上的金屬離子（如Cu2+）為配基的親和膜即固定化金屬親和膜。如果金屬離子為Cu2+

，那么該膜稱為固定化Cu2+親和膜固定化金屬親和膜可以用于許多物質(zhì)的分離。青霉素?；甘瞧渲兄?。目前研究較多的是以Cu2+為配基的親和膜。第二十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四固定化Cu2+親和膜的分離原理具有選擇透過性的膜可截留大分子，都過小分子固定于膜上的Cu2+可以通過和青霉素?；副砻娴慕M氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等帶負(fù)電荷殘基的相互作用使其被吸附于膜上，再通過解析獲得被提純的青霉素?；傅诙唔摚簿攀唔?，編輯于2023年，星期四固定化Cu2+親和膜的制備Yi-MiaoKe等人以亞氨基二乙酸（IDA）為螯合劑，Cu2+為被螯合的離子制成親和膜。制備工藝第二十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四結(jié)果1.對Cu2+的螯合量增加至75.5±0.25μmol/disc2.提純后酶活增加至1.8U/disc第二十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四膜表面共價(jià)結(jié)合的物質(zhì)對膜效能的影響膜表面與膜共價(jià)結(jié)合的材料對分離效能也有影響Yung-ChuanLiu等研究了間隔臂（）的數(shù)量對膜效能的影響，即n值對膜效能的影響第三十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四第三十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四結(jié)果表明，用1,8-diaminooctane做間隔臂，即n=8時(shí)，青霉素?；讣兓谋然疃忍岣?.73倍，回收率為70.27%第三十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四青霉素?；阜蛛x過程Yung-ChuanLiu等研究發(fā)現(xiàn)，最佳上樣條件為：4℃,pH=8.5，0.5MNaCl,每單位區(qū)域上含32.04μmolCu2+最佳的洗脫條件為：pH=6.8，1MNH4Cl,0.5MNaCl。第三十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四PGA原液100ml1.2ml/min72mlwashingbuffer63mlelutionbuffer不能被吸附的蛋白質(zhì)被吸附蛋白質(zhì)被吸附蛋白質(zhì)；不能被吸附的蛋白質(zhì)；Cu2+；配位鍵第三十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四結(jié)果第三十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四該操作工藝使青霉素?；讣兓谋然疃忍岣吡?.11倍該操作工藝的回收率為90.25%第三十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四雙功能膜純化和固定PGAChih-IChen等通過實(shí)驗(yàn)，將吸附于固定化Cu2+親和膜的青霉素?；概c膜表面物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，制備成固定化酶第三十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四工藝流程PGA18℃12hpH10.0,18℃,76hEDTA

青霉素酰化酶；Cu2+；配位鍵；共價(jià)鍵第三十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四第三十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四原初膜與固定化酶后的膜表面電鏡結(jié)構(gòu)第四十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四結(jié)果結(jié)果表明，在2個(gè)月內(nèi)，在使用26次內(nèi)酶活可以保留96.3%第四十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四色譜原理：色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動(dòng)相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配系數(shù)會不同，這使其隨流動(dòng)相運(yùn)動(dòng)速度各不相同，隨著流動(dòng)相的運(yùn)動(dòng)，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。

第四十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四色譜分類色譜可分為傳統(tǒng)色譜和新型色譜，傳統(tǒng)色譜有：1.吸附色譜2.離子交換色譜3.疏水色譜4.親和色譜5.反向色譜6.凝膠色譜第四十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四新型色譜包括以下3種色譜擴(kuò)張床吸附色譜整體柱色譜疏水性電荷誘導(dǎo)色譜第四十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四擴(kuò)張床吸附色譜流化床：將大量固體顆粒懸浮于運(yùn)動(dòng)的流體之中，從而使顆粒具有流體的某些表觀特征，這種流固接觸狀態(tài)稱為固體流態(tài)化，即流化床。固定床：在進(jìn)行多相過程的設(shè)備中，若有固相參與，且處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，則設(shè)備內(nèi)的固體顆粒物料層，稱為固定床擴(kuò)張床：一種特殊的流化床。該流化床中液相、固相返回程度低第四十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四第四十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四流化床固定床擴(kuò)張床流化床、擴(kuò)張床、固定床之間的關(guān)系第四十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四擴(kuò)張床吸附色譜的原理當(dāng)料液從色譜柱下端流入時(shí)，填料上浮。至上浮速度與沉降速度一致時(shí)，填料最終處于懸浮狀態(tài)。此時(shí)能被填料吸附的物質(zhì)附著于填料上，不被吸附的隨著料液從色譜柱上端流出。當(dāng)所有不被吸附的物質(zhì)都流出后，開始從上向下對填料進(jìn)行洗脫，將被吸附物質(zhì)解吸。第四十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四擴(kuò)張床吸附色譜的操作平衡上樣洗滌洗脫再生第四十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四擴(kuò)張床吸附色譜操作示意圖第五十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四擴(kuò)張床吸附色譜圖第五十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四擴(kuò)張床吸附色譜純化青霉素?；窵.M.Pinotti等以陰離子樹脂StreamlineSPXL為填料，利用擴(kuò)張床吸附色譜分離大腸桿菌（E.coli）培養(yǎng)液和勻漿中的青霉素?；?。結(jié)論培養(yǎng)液中青霉素?；富厥章蕿?1.0%勻漿中青霉素?；富厥章?5.0%第五十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四整體柱色譜傳統(tǒng)色譜柱：色譜柱中的填料為大孔球形填料整體柱：又稱為棒狀柱、連續(xù)床層，是一種用有機(jī)或無機(jī)聚合方法在色譜柱內(nèi)進(jìn)行原位聚合的連續(xù)床固定相第五十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四ABA傳統(tǒng)色譜柱；B整體柱第五十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四在形態(tài)上，整體柱與電泳凝膠類似第五十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四整體柱的優(yōu)勢介質(zhì)均勻，分辨率高可在高流速下操作可直接在柱內(nèi)聚合、交聯(lián)（與SDS凝膠配制類似）使用壽命長，穩(wěn)定性好分辨率、吸附容量、使用流速可以通過改變制備過程中單體溶液組成來調(diào)節(jié)（類似于配制不同濃度的電泳凝膠）第五十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四整體柱分類無機(jī)介質(zhì)整體柱：硅膠等有機(jī)聚合物整體柱：聚丙烯酰胺類、聚苯乙烯類等第五十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四整體柱色譜分離青霉素?；窻ustemKecili等構(gòu)建poly(EGDMA-MAAP）整體柱純化Penicillium

chrysogenum(NRRL)的青霉素酰化酶和PenicilliumPurpurogenum的青霉素?；?。第五十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四整體住填料的分子結(jié)構(gòu)第五十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四填料的電鏡圖第六十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四結(jié)論第六十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四疏水性電荷誘導(dǎo)色譜疏水性電荷誘導(dǎo)色譜：疏水性電荷誘導(dǎo)色譜是一種通過可離子化的對偶式配基對pH依賴性，來分離生物大分子的新型液-固吸附性色譜技術(shù)。其吸附是通過溫和疏水作用，并在近生理?xiàng)l件下發(fā)生，不需郵寄溶劑或其他鹽類的加入。解吸是通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，使配基與目的產(chǎn)物帶上相同電荷，當(dāng)靜電斥力大于疏水性相互作用時(shí)，洗脫便開始了。第六十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四第六十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四疏水性電荷誘導(dǎo)色譜純化青霉素?；窪.Coulon等以4-MEP為填料，利用疏水性電荷誘導(dǎo)色譜分離青霉素?；傅诹捻?，共九十七頁，編輯于2023年，星期四傳統(tǒng)色譜在分離青霉素?；钢械膽?yīng)用與新型色譜一樣，從傳統(tǒng)色譜出發(fā)可以開發(fā)出好的分離青霉素酰化酶的工藝第六十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四擬親和色譜擬親和層析法：指用固定的配體選擇性吸附一些酶或其它蛋白的層析技術(shù)。第六十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四擬親和色譜分離青霉素?；窻ustemKecili等以Poly(EGDMA-MAAP)為配基，進(jìn)行擬親和色譜純化青霉素酰化酶。結(jié)論青霉素?；讣兓稊?shù)為23.2青霉素酰化酶回收率為93%第六十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四一步離子交換純化青霉素酰化酶傳統(tǒng)的分離純化工藝一般需要兩步或兩步以上操作。而每次操作都會有產(chǎn)物損傷，因此如何減少分離步驟是提高產(chǎn)率的一條思路。ValerieOrr等提出了一個(gè)只需一步離子交換色譜即可完成對青霉素?；阜蛛x純化的工藝。如下表，他們采用一種電導(dǎo)率低的培養(yǎng)基培養(yǎng)能產(chǎn)生青霉素?；傅拇竽c桿菌第六十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四實(shí)驗(yàn)方法開發(fā)合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌至適當(dāng)時(shí)間后取出適量培養(yǎng)基，離心除去細(xì)胞。將適量上清液上樣于離子交換柱（QSepharoseTMFastFlowColumn）探索最佳工藝。用280nm紫外檢測。收集各區(qū)段進(jìn)行SDS檢測。第六十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四有圖可見，青霉素酰化酶沒有吸附到色譜柱上而雜蛋白大部分被色譜柱吸附第七十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四結(jié)論純化的青霉素?；傅拿富顬?6.3U/mg青霉素酰化酶的純度提高了3倍第七十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四其它方法離子交換膜色譜雙水相萃取高通量篩選輔助設(shè)計(jì)分離純化工藝第七十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四膜色譜技術(shù)膜色譜是將液相色譜與膜分離融合于一起的新型生化分離技術(shù)，具有選擇性高、分離速度快、能耗低、易放大等特點(diǎn)。膜色譜可分為四類：親和膜色譜，離子交換膜色譜，疏水作用膜色譜，多級膜色譜。第七十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四離子交換膜色譜離子交換膜色譜：離子交換膜色譜主要是利用膜介質(zhì)表面的離子交換基團(tuán)與目標(biāo)蛋白之間的離子交換作用進(jìn)行分離的根據(jù)離子交換基團(tuán)的性質(zhì)，可分為強(qiáng)陽離子型、弱陽離子型、強(qiáng)陰離子型、弱陰離子型。第七十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四離子交換膜色譜的特點(diǎn)操作條件較溫和使用壽命長選擇性差第七十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四離子交換膜色譜分離青霉素?；竀alerieOrr等開發(fā)了集膜分離與離子交換色譜于一體的離子交換膜，用來分離青霉素酰化酶。第七十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果A離子交換膜的洗脫曲線；B各洗脫區(qū)段的SDS檢測第七十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四結(jié)論青霉素?；傅漠a(chǎn)量達(dá)到19U/mg青霉素酰化酶的回收率達(dá)到72%第七十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四雙水相萃取原理：某些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可以形成兩相，并且在兩相中水分均占很大比例，即形成雙水相系統(tǒng)（aqueoustwo-phasesystem,ATPS）?？尚纬呻p水相的雙聚合物體系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纖維素/葡聚糖。生物分子的分配系數(shù)取決與溶質(zhì)于雙水相系統(tǒng)間的各種相互作用，其中主要有靜電作用、疏水作用和生物親和作用第七十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四雙水相萃取的優(yōu)勢含水量高（70%～90%），適合分離水溶性的蛋白質(zhì)，不易引起變性易于放大無有機(jī)溶劑殘留第八十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四雙水相萃取分離青霉素?；窸scarAguilar等研究了雙水相萃取提取青霉素?；秆芯堪l(fā)現(xiàn)，在PEG1450-phosphate,TLL48.5%(w/w),Vr=1.0,pHof7.0and35%(w/w)條件下，青霉素酰化酶的回收率達(dá)到97%，純化了3.5倍。第八十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四高通量篩選高通量篩選(Highthroughputscreening，HTS)技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在同一時(shí)間檢測數(shù)以千萬的樣品，并以得到的相應(yīng)數(shù)據(jù)庫支持運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系，它具有微量、快速、靈敏和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。簡言之就是可以通過一次實(shí)驗(yàn)獲得大量的信息，并從中找到有價(jià)值的信息第八十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四現(xiàn)在的高通量檢測儀器兼容的微孔板密度已經(jīng)由最初的96孔增加到384孔,部分儀器甚至可以使用1536孔板進(jìn)行測量,大幅度提高了篩選通量。光學(xué)檢測技術(shù)也由單一的紫外-可見光檢測擴(kuò)大到化學(xué)發(fā)光檢測、熒光檢測和各種光學(xué)傳感技術(shù),為高通量檢測開辟了較廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域.第八十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四高通量篩選分析主要包括均相分析和細(xì)胞分析,均相分析技術(shù)中應(yīng)用較多的有親合閃爍分析(SPA)、熒光分析(FA)等技術(shù)。第八十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期四

熒光檢測(FA)熒光材料在一定條件下每個(gè)分子能釋放數(shù)千個(gè)光子,使理論上的單一分子水平檢測成為可能。這種特性以及可采用多種熒光模式,使得熒光檢測技術(shù)(FA,FluorescenceAssay)成為高通量篩選必不可少的方法第八