實(shí)驗(yàn)二醋酸纖維樹脂

實(shí)驗(yàn)二醋酸纖維樹脂第1頁/共13頁[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的基本原理和操作方法。掌握電泳鑒定血清白蛋白的方法。第2頁/共13頁[實(shí)驗(yàn)原理]電泳——帶電質(zhì)點(diǎn)(分子、離子、膠體顆粒)在電場(chǎng)作用下向帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。除了電荷情況外，帶電質(zhì)點(diǎn)的重量、形狀等也對(duì)它的移動(dòng)產(chǎn)生一定的影響。各種蛋白質(zhì)分子在不同的pH條件下的帶電情況不同，這取決于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI值——pI＞pH時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷；pI＜pH時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。在這次實(shí)驗(yàn)的pH條件(8.6)下，樣品蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷———在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。醋酸纖維薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法。醋酸纖維薄膜由二乙酸纖維素制成，具有均一泡沫樣結(jié)構(gòu)，有強(qiáng)滲透性，對(duì)分子移動(dòng)無阻力。作為區(qū)帶電泳的支持物進(jìn)行蛋白電泳有簡便、快速，樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。第3頁/共13頁實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持物，分離血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場(chǎng)中遷移速度不同。分子量小、等電點(diǎn)低，在相同堿性pH緩沖體系中，帶負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中遷移速度快。如以醋酸纖維薄膜為支持物，正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳1h左右，染色后可顯示5條區(qū)帶。清蛋白泳動(dòng)最快，其余依次為α1-、α2-、β-、γ-球蛋白。這些區(qū)帶經(jīng)洗脫后可用分光光度法定量，也可直接進(jìn)行光吸收掃描，自動(dòng)繪出區(qū)帶吸收峰及相對(duì)百分比，臨床醫(yī)學(xué)常用它們間相對(duì)百分比的改變或異常區(qū)帶的出現(xiàn)作為臨床鑒別診斷的依據(jù)。第4頁/共13頁器材：①醋酸纖維薄膜（2×8cm）②常壓電泳儀③點(diǎn)樣器④培養(yǎng)皿（染色及漂洗用）⑤粗濾紙⑥玻璃板⑦竹鑷試劑：①巴比妥緩沖液（pH=8.6）：巴比妥2.76克，巴比妥納15.45克，加水至1000ml。②染色液：（可重復(fù)使用）。含氨基黑10B0.5克，甲醇50ml，冰醋酸10ml，加蒸餾水至水100ml。③漂洗液：含甲醇或乙醇45ml，冰醋酸5ml，水50ml。④透明液：含無水乙醇7份，冰醋酸3份。⑤健康人血清。[實(shí)驗(yàn)器材及試劑]第5頁/共13頁1.

薄膜與電泳槽的準(zhǔn)備：薄膜的準(zhǔn)備：用鑷子取醋酸纖維薄膜1張（識(shí)別出光澤面與無光澤面，在無光澤面上點(diǎn)樣，并在角上做記號(hào)），放到巴比妥緩沖液中浸泡20min。電泳槽的準(zhǔn)備：在兩個(gè)電極槽中，各倒人等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩個(gè)膜支架上各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對(duì)齊，另一端浸入電極緩沖液內(nèi)。當(dāng)濾紙條全部潤濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)逐氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個(gè)電極槽聯(lián)系醋酸纖維素薄膜的橋梁，故稱為濾紙橋。[實(shí)驗(yàn)操作步驟]第6頁/共13頁2.

點(diǎn)樣：把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸去多余的液體，然后平鋪在玻璃板或?yàn)V紙上，將點(diǎn)樣器在血清中沾一下，再在膜條一端2~3cm處輕輕地水平落下并迅速提起，即在膜條上點(diǎn)上了細(xì)條狀的血清樣品。第7頁/共13頁圖1電泳裝置示意圖第8頁/共13頁3.

電泳：用竹夾將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上(點(diǎn)樣面朝下)、另一端平貼在陽極端支架上(如圖所示)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。用導(dǎo)線將電泳槽的正、負(fù)極與電泳儀的正、負(fù)極分別連接，在室溫下電泳，調(diào)節(jié)電壓到90～110V，電流強(qiáng)度0.4~0.6mA/cm膜寬，電泳時(shí)間1～1.5h。4.

染色和漂洗：電泳完畢立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min，然后取出，先用自來水沖洗，再用漂洗液漂洗，連續(xù)更換3次漂洗液，可使顏色脫去，得到色帶清晰的電泳圖譜。[實(shí)驗(yàn)操作步驟]第9頁/共13頁5.

定量（可采用下面兩種方法）將膜條用濾紙壓平，吸干，按區(qū)帶分段剪開，分別浸在5ml0.4mol/l的NaOH溶液中，并剪取相同大小的無色帶膜條作空白對(duì)照，進(jìn)行比色。將干燥的電泳圖譜膜條放入透明液中浸泡2~3min后，取出貼在潔凈的玻璃板上，干后為透明的薄膜圖譜，可用光密度計(jì)直接測(cè)定。第10頁/共13頁點(diǎn)樣前沿要平，點(diǎn)樣好壞是電泳圖譜是否清晰的關(guān)鍵。點(diǎn)樣量要控制好，少則區(qū)帶不