第八章-PCR技術(shù)及其應(yīng)用

前言PCR技術(shù)簡史鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：chainreaction燃燒中的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：有焰燃燒都存在鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?？扇嘉锸軣釙r不僅會汽化，而且分子會發(fā)生熱裂解作用，產(chǎn)生高度活潑的、易與其他自由基和分子反應(yīng)的自由基，使燃燒持續(xù)進(jìn)行下去。核鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：指能自持進(jìn)行的原子核反應(yīng)。如鈾-235核受到中子轟擊后分裂成兩塊，同時放出二至三個次級中子和一定能量。除去損耗以后，這些次級中子中如能至少剩下一個以引起另一個鈾-235核裂變，則裂變反應(yīng)就可繼續(xù)下去，這樣的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是自持的。原子彈與核反應(yīng)堆是根據(jù)這一原理而設(shè)計(jì)的。當(dāng)前1頁，總共99頁。當(dāng)前2頁，總共99頁。DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR：polymerasechainreaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……當(dāng)前3頁，總共99頁。ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長當(dāng)前4頁，總共99頁。ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶當(dāng)前5頁，總共99頁。ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶當(dāng)前6頁，總共99頁。1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E.coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費(fèi)力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀當(dāng)前7頁，總共99頁。KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。當(dāng)前8頁，總共99頁。引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段當(dāng)前9頁，總共99頁。Taq

DNA聚合酶（Thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020當(dāng)前10頁，總共99頁。72℃94℃55℃PCR循環(huán)當(dāng)前11頁，總共99頁。一、PCR的基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。第一節(jié)PCR技術(shù)原理和工作方式當(dāng)前12頁，總共99頁。當(dāng)前13頁，總共99頁。DenaturetemplateDNAbyheat(95oC)TargetSequenceTargetSequence①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；PCRCycle-Step1–當(dāng)前14頁，總共99頁。PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；當(dāng)前15頁，總共99頁。PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。當(dāng)前16頁，總共99頁。Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。當(dāng)前17頁，總共99頁。TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon當(dāng)前18頁，總共99頁。1

緩沖液10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0(室溫時約為7.2)，還可能有添加劑、共溶劑等。廠商一般以10倍的貯存液形式提供。Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。廠商一般以25mmolMgCl2+形式提供，使用濃度為0.5mmol/L至2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTPs、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。二、PCR反應(yīng)體系當(dāng)前19頁，總共99頁。2、脫氧三磷酸核苷(dNTPs)

dATP、dGTP、dCTP、dTTP四種的等量混合物。廠商一般提供為10mmol/L或4mmol/L的貯存液，使用濃度為0.2mmol/L左右。

dNTPs濃度取決于擴(kuò)增片段的長度。

濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量。

dNTPs可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。當(dāng)前20頁，總共99頁。PCR引物的設(shè)計(jì)一般原則1.引物長度一般以18～30bp為宜，過短則降低特異性，過長則會引起引物間的退火而影響有效擴(kuò)增，同時也增加引物合成的成本。2.解鏈溫度(Tm值)很重要，直接決定了擴(kuò)增中可使用的退火溫度(Ta值)的高低，較高時特異性增加，但退火效率下降，過低時退火效率較高，但特異性下降。兩條引物間的Tm值越接近越好。計(jì)算Tm值的方法很多，簡易公式為Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，適于短于20nt的引物。長引物的Tm值計(jì)算公式見書，但比實(shí)際值往往偏低。精確的Tm計(jì)算需要考慮緩沖液的鹽離子濃度和引物內(nèi)部的相鄰堿基的動力學(xué)參數(shù)。3、引物

一般溶成10mol/L的貯存液，使用濃度為1-5mol/L。

濃度過低則產(chǎn)量低，過高則易導(dǎo)致錯配，PCR特異性下降。當(dāng)前21頁，總共99頁。3.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免序列內(nèi)有較長的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4.要避免兩個引物間特別是3’末端堿基序列互補(bǔ)以及同一引物自身3’末端堿基序列互補(bǔ)的，使它們不能形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。5.G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。6.引物3’末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對，并且3’末端為G、C或T時引發(fā)效率較高，但3’要避免較密的C+C或G+C連排。7.引物5’末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列、ATG起始密碼子或啟動子序列等)，便于克隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求。8.引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。當(dāng)前22頁，總共99頁。4、模板單、雙鏈DNA均可。一個PCR反應(yīng)中104至107個模板分子可獲得較理想的效果，但由于PCR較靈敏，更少的模板分子數(shù)在循環(huán)數(shù)增加時也會得到大量擴(kuò)增。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類，模板純度不高往往是限制PCR擴(kuò)增的重要因素。

不同屬性的模板所加的理想的量不同，哺乳動物基因組總DNA、酵母DNA、細(xì)菌DNA、質(zhì)粒、M13噬菌體作模板時，需要的量分別為1g、10ng、1ng、1pg和1%噬菌斑。

模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。當(dāng)前23頁，總共99頁。5、耐熱性的DNA聚合酶有多種，均從耐熱性的細(xì)菌中分離出來，均耐高溫，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性，但在3’→5’外切酶活性(proofreading,校正功能，決定保真度,fidelity)、耐熱性和附加功能上有差異。酶量增加使產(chǎn)量增加，但反應(yīng)特異性下降，酶量過少雖能保證特異性，但影響產(chǎn)量。常用的有：

1）TaqDNA聚合酶：最常用，來自嗜熱水生菌(Thermusaquaticus)，95℃時的半衰期為40分鐘，75℃時活性最強(qiáng)，沒有校正功能，錯配率為8.9×10-5至1.1×10-4。標(biāo)準(zhǔn)使用濃度一般為2.5U/50l。2）TthDNA聚合酶：來自嗜熱熱細(xì)菌(Thermusthermophilus)HB8，95℃時的半衰期為20分鐘，74℃時進(jìn)行擴(kuò)增，除在Mg2+催化下進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增外，還具有在MnCl2催化下的高溫反轉(zhuǎn)錄功能。

3）VentDNA聚合酶：來自嗜熱高溫球菌(Thermococcuslitoralis)，100℃時的半衰期為1.8小時，具校正功能，保真度比Taq高5-15倍。當(dāng)前24頁，總共99頁。4）PwoDNA聚合酶：來自嗜熱細(xì)菌(Pyrococcuswoesei)，100℃時的半衰期大于2小時，有校正功能，保真度高。5）PfuDNA聚合酶：來自激烈熱球菌(Pyrococcusfariosus)，具有極高的熱穩(wěn)定性，目前公認(rèn)是最保真的。

6）混合DNA聚合酶：將具有校正功能的酶與Taq酶按一定比例混合，具有類似Taq的強(qiáng)啟動合成能力，同時又有一定的保真度，而且具有一定的擴(kuò)增長片段的能力。Taq酶的延伸速度為1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照600-700bp/min來預(yù)計(jì)。

PCR擴(kuò)增不是絕對真實(shí)的，因?yàn)榫咝Ｕδ艿腄NA聚合酶只是比不具校正功能的DNA聚合酶相對保真而已，錯配率相差在兩個數(shù)量級以內(nèi)。一些具校正功能的酶作PCR時，即使產(chǎn)物短也可能得不到產(chǎn)物，原因不明，估計(jì)可能與該酶的外切活性將引物降解有關(guān)。當(dāng)前25頁，總共99頁。三、PCR反應(yīng)程序1、常規(guī)程序：94℃左右預(yù)變性幾十秒至幾分鐘；

94℃左右變性10秒至1分鐘；50-65℃左右退火30秒至1分鐘；20-35個循環(huán)72℃左右延伸30秒至幾分鐘；72℃左右最后延伸和加尾3-10分鐘；4-25℃保持3分鐘或更長。2、退火和延伸溫度：

退火溫度Ta值由Tm值決定，多數(shù)情況下Ta采用Tm減去3-5℃，較高時特異性強(qiáng)但退火效率低，較低時退火效率增加而非特異擴(kuò)增增加，可根據(jù)實(shí)際研究目的采用高特異性或低特異性退火。當(dāng)退火溫度高到與延伸溫度接近時，可以將退火和延伸溫度合為一個，這時PCR就由三步法變成了兩步法。當(dāng)前26頁，總共99頁。3、反應(yīng)時間：變性步驟一般為5秒至1分鐘，變性溫度高時時間短，低時時間長，簡單模板時間短，復(fù)雜模板時間長，尤其是直接用細(xì)胞作模板時預(yù)變性和變性時間都要長。

退火時間一般為30秒至1分鐘即可，引物結(jié)構(gòu)好的時間短，引物結(jié)構(gòu)差的退火時間宜長。

延伸時間從半分鐘到10分鐘以上不等，由擴(kuò)增片段的長度和DNA聚合酶的延伸速度共同決定。Taq擴(kuò)增時按1kb/min計(jì)算，具校正活性的酶則按0.6-0.7kb/min計(jì)算。4、循環(huán)次數(shù)：多數(shù)為25-35，主要取決于模板屬性、模板豐度、引物退火效率、DNA聚合酶的擴(kuò)增能力。裸露DNA、雜質(zhì)少、高豐度模板、引物結(jié)構(gòu)好、DNA聚合酶擴(kuò)增能力強(qiáng)時，循環(huán)數(shù)宜少，以盡量減少突變。否則宜多，以保證獲得必要的PCR產(chǎn)物量。

PCR擴(kuò)增的后期循環(huán)易進(jìn)入平臺期，實(shí)際上是由于PCR擴(kuò)增條件的逐步劣化而引起的。當(dāng)前27頁，總共99頁。平臺效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴(kuò)增過程后期會出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度降低dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體產(chǎn)生非特異性競爭作用擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不徹底Nf=N0(1+Y)nN0起始拷貝數(shù)；Nf最終拷貝數(shù)；Y延伸效率；n循環(huán)數(shù)IfNf=1012，Y=70%，N0=3x105，thenn=28.6當(dāng)前28頁，總共99頁。5、PCR反應(yīng)液的配制：

加試劑順序：雙蒸水、緩沖液、MgCl2、dNTPs、正向引物、反向引物、模板、DNA聚合酶。加DNA聚合酶前應(yīng)將其余試劑混勻后再加入酶。加完酶后應(yīng)先放回酶，然后再混勻PCR成分，覆蓋礦物油，并上機(jī)。

酶要用冰盒取放，禁止因手的接觸或暴露于空氣中而使酶升溫。第一次使用各試劑時要輕柔充分混勻。正確保存各種試劑，尤其是要避免核酸因反復(fù)凍融而降解，各試劑宜分裝成適量的小管。

熱啟動(hotstart)：購買的DNA聚合酶偶連有特異抗體，只有當(dāng)溫度升至68度或更高時，抗體才會失活并釋放出DNA聚合酶，從而增加PCR的特異性，減少低溫下尤其是配制PCR體系過程中由于引物錯配而帶來的非特異性擴(kuò)增。但啟動的DNA聚合酶的價格較貴。早期有蠟珠法。冷啟動(coolstart)：在冰水浴上配制PCR成分，然后立即放到已運(yùn)行并暫停于預(yù)變性之初的PCR儀的block上面，直接進(jìn)入高溫變性和隨后的PCR擴(kuò)增。延遲成分法：扣留一種PCR關(guān)鍵成分，直到已進(jìn)入預(yù)變性后才加入。當(dāng)前29頁，總共99頁。PCR儀當(dāng)前30頁，總共99頁。當(dāng)前31頁，總共99頁。當(dāng)前32頁，總共99頁。1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍當(dāng)前33頁，總共99頁。模板DNA95℃當(dāng)前34頁，總共99頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物當(dāng)前35頁，總共99頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶當(dāng)前36頁，總共99頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開始當(dāng)前37頁，總共99頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq當(dāng)前38頁，總共99頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束當(dāng)前39頁，總共99頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

當(dāng)前40頁，總共99頁。PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個PFU細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA當(dāng)前41頁，總共99頁。PCR中其它注意的事項(xiàng)1.防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作2.設(shè)立對照：陽性對照：陽性模板陰性對照：陰性模板、無模板試劑對照：除模板外的所有組分當(dāng)前42頁，總共99頁。第二節(jié)PCR產(chǎn)物的克隆一、在PCR產(chǎn)物兩端添加限制性酶切位點(diǎn)在PCR引物的5’加上根據(jù)需要而設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物內(nèi)部沒有該切點(diǎn)。在酶切位點(diǎn)的5’加3個左右的保護(hù)堿基，堿基數(shù)目多少取決該酶的性質(zhì)。PCR物產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收后，直接用限制酶進(jìn)行切割，純化后與目標(biāo)載體連接重組。該法適用于直接將PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體進(jìn)行功能研究，但構(gòu)建好的表達(dá)載體必須測序才能證明PCR產(chǎn)物的身份正確且沒有突變。當(dāng)前43頁，總共99頁。二、TA克隆這是目前最通行的PCR產(chǎn)物克隆方法，基本思路是先將PCR產(chǎn)物與特制的T載體進(jìn)行連接重組，測序證明正確無誤后，再從T載體上亞克隆到表達(dá)載體上進(jìn)行功能研究。Taq酶PCR產(chǎn)物的特點(diǎn)：該酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，通常在其產(chǎn)物DNA分子每條鏈的3’末端加上一個突出的A。T載體：通過特定技術(shù)制作的在多克隆位點(diǎn)中間已開環(huán)的質(zhì)粒載體，其每條鏈的3’末端具有一個突出的T，如promega公司的pGEMT-easy。TA克?。簩?’末端具一個突出的A的PCR產(chǎn)物與T載體連接重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對鑒定為陽性的重組克隆子的多克隆位點(diǎn)區(qū)的插入片段進(jìn)行測序，然后再亞克隆到其它載體進(jìn)行功能研究等。pCR-TOPO技術(shù)：T載體上已經(jīng)偶連有拓?fù)洚悩?gòu)酶，因此PCR產(chǎn)物無需DNA連接酶而可直接與該T載體進(jìn)行快速連接重組。當(dāng)前44頁，總共99頁。當(dāng)前45頁，總共99頁。當(dāng)前46頁，總共99頁。當(dāng)前47頁，總共99頁。當(dāng)前48頁，總共99頁。當(dāng)前49頁，總共99頁。三、平末端DNA片段的克隆所有具有校正功能的DNA聚合酶擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物均為平末端，有兩種克隆思路：一是在PCR完成后加入適量的Taq酶并在72℃保溫20-30分鐘，使PCR產(chǎn)物每條鏈的3’末端加上一個突出的A后進(jìn)行TA克隆。二是將平末端PCR產(chǎn)物與平末端進(jìn)行載體連接克?。?、pCR-ScriptAmpSK(+)克隆載體：連接體系中除加有T4DNA連接酶外，還加有限制酶SrfⅠ，連接過程中載體自連的產(chǎn)物總是被SrfⅠ切開，而重組載體卻不能被切開，轉(zhuǎn)化子中重組子的比例就較高。2、pCR-Blunt克隆載體：載體的lacZ’基因下游融合了一個致死基因ccdB，載體自連轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不能存活，重組載體的轉(zhuǎn)化子則能長成菌落，因?yàn)橹滤阑蛞驯徊迦胧Щ?。?dāng)前50頁，總共99頁。當(dāng)前51頁，總共99頁。當(dāng)前52頁，總共99頁。四、長片段DNA的PCR擴(kuò)增長片段DNA的PCR擴(kuò)增效率較低，因?yàn)橛性S多降低PCR效率的因素。策略有：一是改進(jìn)PCR緩沖液體系。二是采用混合酶，尤其是Taq與Pwo的混合酶可擴(kuò)增40kb左右的片段。當(dāng)前53頁，總共99頁。當(dāng)前54頁，總共99頁。當(dāng)前55頁，總共99頁。當(dāng)前56頁，總共99頁。一、反向PCR(reversePCR)

基本原理:用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物之外的DNA片段。首先用限制性內(nèi)切酶切割靶DNA片段,并用連接酶,使酶切所得DNA片段自身環(huán)化,然后再用內(nèi)切酶消化核心區(qū),并以該內(nèi)切酶切點(diǎn)兩側(cè)的DNA片段為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可將鄰近已知序列旁側(cè)的未知DNA片段擴(kuò)增出來?？蓪ξ粗蛄袛U(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列第三節(jié)PCR擴(kuò)增未知DNA片段當(dāng)前57頁，總共99頁。當(dāng)前58頁，總共99頁。當(dāng)前59頁，總共99頁。二、利用接頭的PCR/錨定PCR(anchoredPCR)

將基因組總DNA用限制酶切割，然后將序列已知的接頭連接到酶切片段的兩端，以提供PCR的錨定引物，該錨定引物與已知序列中的基因特異引物(gene-specificprimer,GSP)組合后，用于目標(biāo)基因側(cè)翼序列的擴(kuò)增。為了減少錨定引物與錨定引物之間組合后構(gòu)成的非特異擴(kuò)增，可以將接頭替換為一端平、另一端為5’突起的結(jié)構(gòu)，且對3’凹陷的堿基實(shí)行亞氨基修飾。當(dāng)前60頁，總共99頁。同端化PCR基本原理:首先將兩條變性的單鏈DNA的3′端加上同樣的特殊引物接頭,使其具有相同的末端序列,然后以DNA單鏈為模板,接頭的主體部分為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的DNA片段。具體方法:將一條具有回文結(jié)構(gòu)的特殊引物接頭,加在待擴(kuò)增的單鏈DNA片段3′端,然后以其為模板,以該引物接頭的5′端主體部分為引物,合成它們的互補(bǔ)鏈,再通過變性、復(fù)性,使新合成的兩條鏈復(fù)性。并在DNA聚合酶作用下補(bǔ)平,產(chǎn)生兩端都含有所連接引物5′端同一主體序列的模板分子,然后再用該主體序列作引物進(jìn)行PCR反應(yīng),即可使未知序列的基因片段得以擴(kuò)增。當(dāng)前61頁，總共99頁。當(dāng)前62頁，總共99頁。不對稱PCR

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究三、熱不對稱交錯PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)

當(dāng)前63頁，總共99頁。

高濃度引物低濃度引物當(dāng)前64頁，總共99頁。TAIL-PCR：利用特異引物與隨機(jī)引物組合后進(jìn)行PCR，產(chǎn)生3種產(chǎn)物：Ⅰ型產(chǎn)物：特異引物和隨機(jī)引物共同延伸的產(chǎn)物；Ⅱ型產(chǎn)物：特異引物單獨(dú)延伸的產(chǎn)物；Ⅲ型產(chǎn)物：隨機(jī)引物單獨(dú)延伸的產(chǎn)物。5輪高嚴(yán)謹(jǐn)度PCR，形成特異引物介導(dǎo)的目標(biāo)序列的單鏈擴(kuò)增；1個低嚴(yán)謹(jǐn)度PCR循環(huán)，將目標(biāo)序列轉(zhuǎn)換為雙鏈；高嚴(yán)謹(jǐn)度與低嚴(yán)謹(jǐn)度循環(huán)交錯進(jìn)行，共14個超級循環(huán)；PCR產(chǎn)物稀釋1000倍；換用新的特異引物與隨機(jī)引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增，10個超級循環(huán)；PCR產(chǎn)物稀釋1000倍；換用第三特異引物與隨機(jī)引物進(jìn)行第三次擴(kuò)增，10個超級循環(huán)；電泳、回收、克隆、測序。當(dāng)前65頁，總共99頁。第一輪擴(kuò)增

當(dāng)前66頁，總共99頁。第二輪擴(kuò)增當(dāng)前67頁，總共99頁。第三輪擴(kuò)增當(dāng)前68頁，總共99頁?；騧RNA蛋白質(zhì)多肽鏈第四節(jié)與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的PCR當(dāng)前69頁，總共99頁。逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜合雙鏈PCR擴(kuò)增當(dāng)前70頁，總共99頁。一、cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)用于克隆全長cDNA的5’和3’末端序列。RACE是利用PCR技術(shù)由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA末端的方法,又稱為錨定PCR(AnchoredPCR)和單邊PCR(One-sidedPCR)。一般有兩種RACE策略,分別用于擴(kuò)增3′或5′端。無論哪一種策略的第一步都需要首先通過反轉(zhuǎn)錄把mRNA轉(zhuǎn)化為單鏈cDNA。在擴(kuò)增反應(yīng)中,先根據(jù)基因已知部分的序列設(shè)計(jì)引物;引物(又稱錨定引物)帶有與cDNA5′或3′端相鄰區(qū)域互補(bǔ)的序列。這些序列可以是自然存在的,也可以在反轉(zhuǎn)錄完成后添加。錨定引物也可以帶有接頭序列,以方便克隆。當(dāng)前71頁，總共99頁。在5′RACE中,第一條cDNA單鏈?zhǔn)且耘c基因中已知序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸片段為引物合成的。去掉RNA模板后,用脫氧核糖核苷末端轉(zhuǎn)移酶或T4RNA連接酶在單鏈cDNA3′端添加一個錨定引物序列尾巴。然后就可以用與基因中已知序列和錨定序列尾巴互補(bǔ)的序列為引物,進(jìn)行典型的PCR反應(yīng)。1、

5′RACE

當(dāng)前72頁，總共99頁。當(dāng)前73頁，總共99頁。2、3’RACE在3′RACE中,首先用寡聚(dT)引物/接頭做引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。這一寡聚(dT)引物可與mRNA的多聚(A)尾巴復(fù)性。這一寡聚(dT)引物/接頭同時還用來在隨后的PCR反應(yīng)中作為錨定引物。反應(yīng)中的另一引物與基因中某一特定序列互補(bǔ)。當(dāng)前74頁，總共99頁。當(dāng)前75頁，總共99頁。二、差異顯示PCR(differentialdisplayPCR,DD-PCR)檢測相似材料表達(dá)譜差異的經(jīng)典方法，此后已衍生出許多新方法。

基本原理：利用一系列寡核苷酸為引物,其中一種錨定于mRNA3′端poly(A)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,形成mRNA:cDNA雜交分子。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增時在PCR反應(yīng)溶液中除加入前一種引物外,再加入另一短的隨機(jī)引物,通過兩組引物的隨機(jī)組合,使細(xì)胞中大約15000種mRNA均有擴(kuò)增的機(jī)會,并在序列膠上顯示出清晰的電泳帶,從中分離出目的DNA片段。利用真核細(xì)胞mRNA均含有ploy(A)末端的特點(diǎn),把其中3′端引物設(shè)計(jì)成T11VN(V表示為除T以外的三種堿基,N表示四種堿基中的任意一種),所以共有12種組合,分別對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,理論上這12種組合剛好覆蓋所有mRNA,而且每一種組合均可有效地進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)結(jié)束時,應(yīng)全部形成mRNA:cDNA雜交分子。當(dāng)前76頁，總共99頁。mRNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA后,向反應(yīng)體系中加入另一個十聚核苷酸的隨機(jī)引物,連同T引物，進(jìn)行標(biāo)記的PCR擴(kuò)增，然后，通過序列膠分析即可將差異表達(dá)條帶，即目的條帶從中檢出，然后再回收DNA，并進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，即可得到進(jìn)行進(jìn)一步鑒定所需要的量。當(dāng)前77頁，總共99頁。當(dāng)前78頁，總共99頁。DDRT-PCR技術(shù)的不足:（1）假陽性率高，假陽性的比例有時高達(dá)50％～75％。（2）由于某些序列的特異性，一些差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄不能得到分離，所以凝膠中的單條帶可能由1種以上cDNA片段所構(gòu)成。（3）差異顯示所得的cDNA片段較短，長度多在100bp～400bp之間，且大多位于mRNA3′端約300bp的非翻譯區(qū)（untranslatedregions,3′UTR），很少能擴(kuò)增到ORF范圍內(nèi)。（4）研究表明，差顯技術(shù)對高豐度mRNA具有明顯的傾向性，不管用多少個10mer引物，標(biāo)準(zhǔn)的差顯技術(shù)并不能有效顯示細(xì)胞中的大量mRNA。

當(dāng)前79頁，總共99頁。一、多重PCR(multiplexPCR)：在一個反應(yīng)體系中使用一對以上引物的PCR稱為多重PCR。其結(jié)果是產(chǎn)生多個PCR產(chǎn)物，用于檢測特定基因序列的存在或缺失，也可用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。

電泳引物第五節(jié)PCR產(chǎn)生的DNA指紋當(dāng)前80頁，總共99頁。二、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)：在高等真核生物龐大基因組背景下，引物長度縮短到一定程度以后，單一引物就可以擴(kuò)增出多個PCR產(chǎn)物。RAPD引物一般為10-11nt。它的應(yīng)用是基于這樣的一個推理：對于不同模板DNA，用同一引物擴(kuò)增既可能得到相同的帶譜（模板基因組間可能具有同源性），也可能得到不同的帶譜。僅在某一特定模板中出現(xiàn)的條帶就可作為該模板的分子標(biāo)記。事實(shí)上，不同基因組DNA總是一定差異的，所以用RAPD就可以進(jìn)行分子標(biāo)記研究。理論上講，在一定的擴(kuò)增條件下，擴(kuò)增的條帶數(shù)取決于基因組的復(fù)雜性。對特定的引物，復(fù)雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶數(shù)也越多。當(dāng)前81頁，總共99頁。當(dāng)前82頁，總共99頁。當(dāng)前83頁，總共99頁。RAPD技術(shù)目前運(yùn)用相當(dāng)廣泛，幾乎滲透于整個基因組研究的各個方面，這與它所具有的眾多優(yōu)勢是分不開的。①無需專門設(shè)計(jì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)引物，也無須預(yù)先知道被研究生物基因組的核苷酸序列，引物可隨機(jī)合成和隨機(jī)選定，長度一般為9-10個核苷酸；②每個RAPD反應(yīng)中，僅加單個引物，就可通過引物和模板DNA隨機(jī)配對實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，擴(kuò)增無特異性；③退火溫度低，一般為36℃，這樣的溫度能保證核苷酸引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合，同時允許適當(dāng)?shù)腻e誤配對，以擴(kuò)大引物在基因組DNA中配對的隨機(jī)性，使RAPD有較高的檢出率；④RAPD技術(shù)簡便易行、省時省力。RAPD易于程序化，利用一套隨機(jī)引物可得到大量的分子標(biāo)記，并可借助于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行分析；⑤RAPD分析所需的DNA樣品量極少，這對于生物早期取樣鑒定或在DNA受限制的情況下是十分有利的。當(dāng)前84頁，總共99頁。RAPD的缺點(diǎn)：

(1)RADP圖譜中某些弱帶重復(fù)性較差，而且目前該法在引物長度和序列及應(yīng)用的引物數(shù)目、擴(kuò)增反應(yīng)條件等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面未標(biāo)準(zhǔn)化，影響了不同條件下結(jié)果的可比性；(2)每個標(biāo)記含有的信息量??；(3)有假陽性或假陰性結(jié)果；(4)顯性標(biāo)記，無法區(qū)分從一個位點(diǎn)擴(kuò)增的DNA片段是純合的還是雜合的，無法進(jìn)行等位基因分析；(5)用在種以上類群間的比較時無法得到可靠的遺傳距離。當(dāng)前85頁，總共99頁。三、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplifiedfragmentpolymorphism,AFLP)：將高等真核生物基因組DNA酶切，連接接頭，然后進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增?；驹恚夯蚪MDNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，用含有選擇性堿基的引物對模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴(kuò)增片段的特殊性，只有那些限制性位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無來檢驗(yàn)多態(tài)性。引物由三部分組成：①核心堿基序列，該序列與人工接頭互補(bǔ)；②限制性內(nèi)切酶識別序列；③引物3’端的選擇堿基。選擇堿基延伸到酶切片段區(qū)，這樣只有那些兩端序列能與選擇堿基配對的限制性酶切片段被擴(kuò)增。AFLP技術(shù)包括三個主要內(nèi)容：①模板的制備；②片段的擴(kuò)增；③聚丙烯酰胺變性膠電泳分離檢測。當(dāng)前86頁，總共99頁。被擴(kuò)增的DNA限制性酶切片段由二個限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生，一個為酶切位點(diǎn)較少的限制性酶（如EcoRI），另一個為多酶切位點(diǎn)的限制酶（如MseI）。采用雙酶切的原因：

①多位點(diǎn)酶切產(chǎn)生小的DNA片段，這些片段易被擴(kuò)增且片段長短適宜在變性膠上分離；②切點(diǎn)數(shù)少的酶可減少擴(kuò)增片段的數(shù)目。由于擴(kuò)增片段是由多切點(diǎn)酶和切點(diǎn)數(shù)較少的酶酶切后產(chǎn)生酶切片段，這樣就可選擇擴(kuò)增時所需的選擇堿基數(shù)目限制在一定的范圍內(nèi)；③利用雙酶切使對PCR產(chǎn)物的單鏈進(jìn)行標(biāo)記成為可能，從而防止膠上由于擴(kuò)增片段雙鏈遷移率不一致而造成的雙帶現(xiàn)象（doublets）；④雙酶切可以對擴(kuò)增片段的數(shù)目進(jìn)行靈活調(diào)節(jié)；⑤通過少數(shù)引物可產(chǎn)生許多不同的引物組合，從而產(chǎn)生大量的不同的AFLP指紋。當(dāng)前87頁，總共99頁。當(dāng)前88頁，總共99頁。當(dāng)前89頁，總共99頁。AFLP技術(shù)主要特點(diǎn)：（1）分析所需DNA量少，僅需0.5μg。（2）可重復(fù)性好。誤差小于0.6%。（3）多態(tài)性強(qiáng)。AFLP分析可以通過改變限制性內(nèi)切酶和選擇性堿基的種類與數(shù)目,來調(diào)節(jié)擴(kuò)增的條帶數(shù),具有較強(qiáng)的多態(tài)分辨能力。（4）分辨率高。（5）樣品適用性廣。AFLP技術(shù)適用于任何來源和各種復(fù)雜度的DNA。（6）穩(wěn)定的遺傳性。AFLP標(biāo)記在后代中的遺傳和分離中符合Mendel式遺傳規(guī)