實(shí)驗(yàn)熒光光譜呂己莉

實(shí)驗(yàn)熒光光譜呂己莉第1頁(yè)/共16頁(yè)實(shí)驗(yàn)4-10熒光光譜第2頁(yè)/共16頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)背景

熒光：一些化學(xué)物質(zhì)從外界吸收并儲(chǔ)存能量而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回到基態(tài)時(shí)，過(guò)剩的能量以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光），稱之為熒光?？僧a(chǎn)生熒光分子/原子發(fā)光熒光現(xiàn)象消失熒光的分類接收能量供能停止產(chǎn)生方式：化學(xué)發(fā)光、光致發(fā)光基本微粒原子熒光X射線熒光分子熒光……第3頁(yè)/共16頁(yè)

4、熒光分析法/分子熒光光譜法/熒光光譜法：

以物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度與濃度之間的線性關(guān)系為依據(jù)進(jìn)行定量分析及以熒光光譜的形狀和熒光峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)進(jìn)行定性分析的方法。5、在熒光分析中，將熒光分為自然熒光和人工熒光兩種。自然熒光（一次熒光、自發(fā)熒光等）：某些物質(zhì)無(wú)須經(jīng)過(guò)處理，當(dāng)受到激發(fā)光照射時(shí)就能產(chǎn)生熒光的現(xiàn)象。人工熒光（二次熒光、繼發(fā)熒光等）：某些物質(zhì)必須經(jīng)過(guò)化學(xué)處理，如用熒光染料與其結(jié)合才能被激發(fā)產(chǎn)生熒光的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中采用自然熒光。第4頁(yè)/共16頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)原理（一）熒光原理處于基態(tài)的分子躍遷到高能級(jí)無(wú)輻射躍遷：激發(fā)態(tài)分子不產(chǎn)生光輻射而躍遷到更低的激發(fā)態(tài)或基態(tài)。

輻射躍遷：返回基態(tài)而產(chǎn)生光輻射3.熒光光譜吸收能量輻射光/產(chǎn)生熱，消激發(fā)熒光發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(zhǎng)，掃描發(fā)射光波長(zhǎng)熒光激發(fā)光譜：固定熒光發(fā)射波長(zhǎng)，掃描激發(fā)波長(zhǎng)第5頁(yè)/共16頁(yè)熒光光譜的基本原理第6頁(yè)/共16頁(yè)（二）三個(gè)基本定律為讓一種物質(zhì)發(fā)射熒光，它必須吸收光和其它形式的能量。一般來(lái)說(shuō)，熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光的波長(zhǎng)長(zhǎng)，即存在斯托克斯線（但也存在熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)短的現(xiàn)象，即反斯托克斯線）。熒光的量子產(chǎn)額Q決定于熒光發(fā)射光子數(shù)與吸收的激發(fā)光子數(shù)的比值。由于激發(fā)分子的去活化過(guò)程包括輻射躍遷和無(wú)輻射躍遷，因而熒光量子產(chǎn)額可以表示為：第7頁(yè)/共16頁(yè)（三）熒光分析的兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)

高選擇性——每種熒光物質(zhì)都有自己的特征熒光光高靈敏度——熒光分析法比吸收光譜分析法高二到三個(gè)數(shù)量級(jí)（四）影響熒光的幾個(gè)主要因素樣品溫度——許多樣品溫度每升高1度，熒光強(qiáng)度就會(huì)降低1%-2%，具體下降的百分比與樣品類型有關(guān)樣品的光化反應(yīng)——在較大光子能量激發(fā)光的照射下，有些樣品會(huì)因?yàn)楫a(chǎn)生光化反應(yīng)而受到破壞，使熒光強(qiáng)度信號(hào)隨光照時(shí)間增加而逐漸下降。第8頁(yè)/共16頁(yè)雜散光干擾——在實(shí)驗(yàn)中可觀察到激發(fā)光溶劑分子、小顆粒或氣泡的散射光和拉曼散射光引起的吸收峰，這些吸收峰在一定情況下會(huì)對(duì)熒光光譜的測(cè)量造成干擾。溶劑——同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中，其熒光光譜的位置和強(qiáng)度都會(huì)有顯著的差別。溶劑的拉曼散射光——在激發(fā)光波長(zhǎng)邊出現(xiàn)類似熒光的拉曼散射峰、基本不隨樣品濃度改變一般的溶劑效應(yīng)：普遍存在，與溶劑的折射率和介電常數(shù)相關(guān)特殊的溶劑效應(yīng)：取決于溶劑和溶質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、化學(xué)作用等第9頁(yè)/共16頁(yè)樣品濃度效應(yīng)——樣品濃度過(guò)高時(shí)由于激發(fā)光的吸收損失各熒光的重吸收導(dǎo)致熒光光譜分布改變，“向長(zhǎng)波位移”。同時(shí)被激發(fā)的分子易相互作用，產(chǎn)生濃度猝滅。7.樣品的污染8.溶解氧——對(duì)一定的樣品具有明顯的熒光消光效應(yīng)9.PH值——熒光物質(zhì)具有弱酸弱堿性時(shí)，溶液pH值的改變會(huì)影響熒光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)從而改變其熒光光譜和熒光強(qiáng)度第10頁(yè)/共16頁(yè)三、實(shí)驗(yàn)裝置本實(shí)驗(yàn)所用日本島津RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)的原理框圖，如圖4-10-2所示：

激發(fā)單色儀將氙燈輸入的連續(xù)光譜的光分離出個(gè)別波長(zhǎng)的單色光輸出，作為激發(fā)光。為提高光強(qiáng)，激發(fā)單色儀的入射孔徑較大。激發(fā)光照射到樣品池中的樣品上，樣品受激而發(fā)射的熒光則進(jìn)一步分光并被其后的光電倍增管PM2接收。光電倍增管PM1用于監(jiān)控氙燈光源光強(qiáng)起伏。通過(guò)分束器獲得激發(fā)光強(qiáng)起伏信號(hào)，并反饋到用于熒光掃描分析的光電倍增管PM2的電路中，進(jìn)行光源補(bǔ)償。第11頁(yè)/共16頁(yè)四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、制備樣品：將5mg維生素B2放在200mL容量瓶中，加蒸餾水到200mL,待其全部溶化后，配制10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL各10mL和5μg/mL溶液50mL,放在試管中待用。2、樣品的激發(fā)光譜特性：選擇最佳激發(fā)、發(fā)射狹縫的寬度和儀器接受增益，使激發(fā)單色儀在220nm-700nm之間；人工選擇激發(fā)波長(zhǎng)，對(duì)樣品作照射，然后掃描熒光發(fā)射波長(zhǎng)；檢測(cè)到熒光發(fā)射峰后，固定波長(zhǎng)，然后對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，即得到被測(cè)樣品的激發(fā)光譜（熒光相對(duì)強(qiáng)度與激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系）；分別測(cè)量上述濃度樣品的激發(fā)光譜，然后把激發(fā)光譜圖像分別保存到磁盤(pán)上。第12頁(yè)/共16頁(yè)3、樣品的發(fā)射光譜特性：將激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)置在激發(fā)光譜的峰值波長(zhǎng)處，對(duì)被測(cè)樣品照射，然后掃描熒光發(fā)射波長(zhǎng)，得到熒光強(qiáng)度相對(duì)強(qiáng)度與熒光波長(zhǎng)的關(guān)系圖（被測(cè)樣品的熒光光譜），保存數(shù)據(jù)。

4、溶劑的熒光光譜特性：測(cè)量蒸餾水的熒光光譜，找出蒸餾水的熒光峰。

5、熒光強(qiáng)度I與樣品濃度C的關(guān)系：以配制好的不同濃度維生素溶液為各種樣品，自選參數(shù)測(cè)試，做出I-C曲線。

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6、熒光猝滅：取五只試管，各放入5mL的5μg/mL維生素溶液，再向每只試管中分別滴入0、1、2、3、4滴濃度為0.1mol/L的NaOH溶液，并分別測(cè)出它們的相對(duì)熒光強(qiáng)度I。以未滴NaOH溶液的熒光強(qiáng)度為I1，作出I1/I-CQ曲線。

7、狹縫寬度的影響：將一定濃度的蒽的乙醇溶液（適量）放于樣品池中并蓋好以防止揮發(fā)。取5nm縫寬，λex選定在365nm。掃描發(fā)射單色儀記錄熒光發(fā)射光譜曲線I-

λem，再將縫寬選為10nm、20nm等，重復(fù)上述步驟并記錄熒光發(fā)射光譜。比較不同縫寬的曲線并分析之。第14頁(yè)/共16頁(yè)五、注意事項(xiàng)試驗(yàn)一個(gè)未知樣品應(yīng)先從測(cè)量較高濃度的樣品的吸收光譜開(kāi)始，用吸收光譜峰值波長(zhǎng)去激發(fā)，測(cè)得最強(qiáng)熒光。為避免樣品的光化反應(yīng)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)采用光閘，縮短樣品暴露在激發(fā)光下的時(shí)間，同時(shí)增加