凝膠滲透色譜

凝膠滲透色譜法GPC2013-5-3體積排阻色譜法定義及分類(lèi)

體積排阻色譜法(SEC)：利用多孔凝膠固定相的獨(dú)特特性而產(chǎn)生的一種主要依據(jù)分子尺寸大小進(jìn)行分離的方法。

●凝膠滲透色譜(GPC:Gelpermeationchromatography)主要用于聚合物領(lǐng)域以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相(氯仿，THF，DMF)常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯共聚物●凝膠過(guò)濾色譜(GFC:Gelfiltrationchromatography)主要用于生命科學(xué)領(lǐng)域以水溶液為流動(dòng)相常用固定相填料：親水性有機(jī)凝膠(葡聚糖，瓊脂糖，聚丙烯酰胺等)一、緒論

1964年由J.C.Moore首先研究成功

(J.Polym.Sci.,PartA:Polym.Chem.1964,2(2):835-843)以苯乙烯和二乙烯基苯在不同的稀釋劑存在下制成了一系列孔徑不同的凝膠，可以在有機(jī)溶劑中分離分子量從幾千到幾百萬(wàn)的試樣；第二年Maly用示差折光儀為濃度檢測(cè)器，以體積指示器為分子量檢測(cè)器制成凝膠色譜儀，從而創(chuàng)立了液相色譜中的凝膠滲透色譜技術(shù)。凝膠滲透色譜法(GPC)是一種新型的液相色譜。二、基本原理凝膠滲透色譜是一種液相色譜，原理是利用高分子溶液通過(guò)一根裝填有凝膠的柱子，在柱中按分子大小進(jìn)行分離。柱子為玻璃柱或金屬柱，內(nèi)填裝有交聯(lián)度很高的球形凝膠。其中的凝膠類(lèi)型有很多，都是根據(jù)具體的要求而確定(常用的有聚苯乙烯凝膠)。然而無(wú)論哪一種填料，他們都有一個(gè)共同點(diǎn)，就是球形凝膠本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞。

當(dāng)被分析的試樣隨著淋洗溶劑進(jìn)入柱子后，溶質(zhì)分子即向填料內(nèi)部孔洞擴(kuò)散。較小的分子除了能進(jìn)入大的孔外，還能進(jìn)入較小的孔；較大分子則只能進(jìn)入較大的孔；而比最大的孔還要大的分子就只能留在填料顆粒之間的空隙中。隨著溶劑的淋洗，大小不同的分子就得到分離，較大的分子先被淋洗出來(lái)，較小的分子較晚被淋洗出來(lái)。

孔穴填充物顆粒大中小樣品

溶質(zhì)分子的體積越小，其淋出體積越大。這種解釋不考慮溶質(zhì)與載體之間的吸附效應(yīng)以及在流動(dòng)相和固定相之間的分配效應(yīng)。淋出體積僅僅由溶質(zhì)分子尺寸和載體的孔尺寸決定，分離完全是由于體積排除效應(yīng)所致，故稱(chēng)為體積排除機(jī)理。GPC柱

●排阻極限

排阻極限是指不能進(jìn)入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時(shí)被最先洗脫出來(lái)。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。隨固定相不同，排阻極限范圍約在400至60×106之間。

●滲透極限

能夠完全進(jìn)入凝膠顆粒孔穴內(nèi)部的最大分子的分子量。在選擇固定相時(shí)，應(yīng)使欲分離樣品粒子的相對(duì)分子質(zhì)量落在固定相的滲透極限和排阻極限之間。Hi：峰高M(jìn)i：分子量應(yīng)用GPC峰高法計(jì)算平均分子量需要GPC軟件才可計(jì)算Mw

GPC儀的組成：泵系統(tǒng)、（自動(dòng)）進(jìn)樣系統(tǒng)、凝膠色譜柱、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)。三、GPC儀器配置

泵系統(tǒng)：

包括一個(gè)溶劑儲(chǔ)存器、一套脫氣裝置和一個(gè)高壓泵。它的工作是使流動(dòng)相（溶劑）以恒定的流速流入色譜柱。泵的工作狀況好壞直接影響著最終數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。越是精密的儀器，要求泵的工作狀態(tài)越穩(wěn)定。要求流量的誤差應(yīng)該低于0.01mL/min。色譜柱：

按照樣品所溶解的溶劑來(lái)選擇柱子所屬系列

THF、氯仿、DMF。

必須選擇合適的溶劑來(lái)溶解聚合物。按照樣品分子量范圍來(lái)選擇柱子型號(hào)

樣品分子量應(yīng)處在排阻極限和滲透極限范圍內(nèi)，并且最好是處在校正曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍內(nèi)。載體是GPC產(chǎn)生分離作用的關(guān)鍵。

GPC儀器對(duì)載體的要求：1.良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性；2.有一定的機(jī)械強(qiáng)度；3.不易變形;4.流動(dòng)阻力?。?.對(duì)試樣沒(méi)有吸附作用；6.分離范圍越大越好（取決于孔徑分布)等；7.載體的粒度愈小，愈均勻，堆積的愈緊密，色譜柱分離效率愈高。

檢測(cè)系統(tǒng)：

通用型檢測(cè)器：適用于所有高聚物和有機(jī)化合物的檢測(cè)。有示差折光儀檢測(cè)器、紫外吸收檢測(cè)器、粘度檢測(cè)器。

示差折光儀檢測(cè)器：溶劑的折光指數(shù)與被測(cè)樣品的折光指數(shù)有盡可能大的區(qū)別。

紫外吸收檢測(cè)器：在溶質(zhì)的特征吸波長(zhǎng)附近溶劑沒(méi)有強(qiáng)烈的吸收。

選擇型檢測(cè)器：適用于對(duì)該檢測(cè)器有特殊響應(yīng)的高聚物和有機(jī)化合物。有紫外、紅外、熒光、電導(dǎo)檢測(cè)器等。

直接法：◆把激光光散射與凝膠色譜儀聯(lián)用，在得到濃度譜圖的同時(shí)，還可得到散射光強(qiáng)對(duì)淋出體積的譜圖，從而計(jì)算出分子量分布曲線(xiàn)和整個(gè)試樣的各種平均分子量?！舭袵PC儀與光散射儀連用，由光散射儀連續(xù)測(cè)定聚合物樣品中各個(gè)級(jí)分的相對(duì)分子質(zhì)量，由GPC儀中的濃度示差檢測(cè)器檢測(cè)各個(gè)級(jí)分的濃度，就可以得到聚合物的各種平均相對(duì)分子質(zhì)量。

四、實(shí)驗(yàn)部分間接法：用已知相對(duì)分子質(zhì)量的單分散標(biāo)準(zhǔn)聚合物預(yù)先做一條淋洗體積或淋洗時(shí)間和相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線(xiàn)，該線(xiàn)稱(chēng)為“校正曲線(xiàn)”。在相同的測(cè)試條件下，做一系列的GPC標(biāo)準(zhǔn)譜圖，對(duì)應(yīng)不同相對(duì)分子質(zhì)量樣品的保留時(shí)間，以lgM對(duì)t作圖，所得曲線(xiàn)即為“校正曲線(xiàn)”。通過(guò)校正曲線(xiàn)，就能從GPC譜圖上計(jì)算各種所需相對(duì)分子質(zhì)量與相對(duì)分子質(zhì)量分布的信息。常見(jiàn)的標(biāo)樣：聚苯乙烯(PS，溶于各種有機(jī)溶劑)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)聚環(huán)氧乙烷(PEO，也叫聚氧化乙烯，溶于水)聚乙二醇(PEG，溶于水)

注意事項(xiàng)：

◆由于凝膠色譜中濃度檢測(cè)通常使用示差折光檢測(cè)器，其靈敏度不太高，所以試樣的濃度不能配置得太稀。但另一方面色譜柱的負(fù)荷量是有限的，濃度太大易發(fā)生“超載”現(xiàn)象。

◆一般情況下，進(jìn)樣濃度按分子質(zhì)量大小的不同在0.05～0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))范圍內(nèi)配置。分子質(zhì)量越大，溶液濃度越低。

◆標(biāo)樣配制應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)樣說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通常室溫靜置12小時(shí)以上，然后輕輕混勻。絕對(duì)不能超聲或者劇烈振蕩來(lái)加速溶解。

◆溶液進(jìn)樣前應(yīng)先經(jīng)過(guò)過(guò)濾，以防止固體顆粒進(jìn)入色譜柱內(nèi)，引起柱內(nèi)堵塞，損壞色譜柱。進(jìn)樣濃度范圍及體積：分子量范圍樣品濃度：

低于5,000<1.0%5,000～25,000<0.5%25,000～200,000<0.25%200,000～2,000,000<0.1%高于2,000,000<0.05%進(jìn)樣體積：50-100uL之間(濃度在0.05%-0.5%之間)GPC校正方法

窄分布標(biāo)樣校正法選用與被測(cè)樣品同類(lèi)型的單分散性(d≤1.1)標(biāo)樣，先用其他方法精確測(cè)定其平均相對(duì)分子質(zhì)量，然后與被測(cè)樣品在同樣的條件下進(jìn)行GPC分析。

普適校正法此法的優(yōu)點(diǎn)是只要用一種高聚物（一般用窄分布聚苯乙烯）作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)就可以測(cè)定其他類(lèi)型的聚合物，但先決條件是2種高聚物的K和α值必須己知。

漸進(jìn)試差法(寬分布標(biāo)樣校正法)這種方法不需要窄分布樣品，其標(biāo)樣可為1~3個(gè)不同相對(duì)分子質(zhì)量的寬分布標(biāo)樣（平均相對(duì)分子質(zhì)量精確測(cè)量，Mw和Mn為已知），采用數(shù)學(xué)處理方法得到漸進(jìn)試差法的校正曲線(xiàn)。1、凝膠滲透色譜法測(cè)定聚氨酯樹(shù)脂的平均相對(duì)分子質(zhì)量流動(dòng)相：DMF，流速為1.0ml/min進(jìn)樣量：100μL；柱溫：50℃。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的繪制取重均相對(duì)分子質(zhì)量為3.21×10～3.05×10的5種Ps標(biāo)準(zhǔn)樣品，用DMF配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用0.45μm濾膜過(guò)濾，取濾液測(cè)試,求得Ps的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)線(xiàn)性方程。五、凝膠滲透色譜的應(yīng)用2、高分子與低分子同時(shí)測(cè)定

由于小分子和高分子的流體力學(xué)體積相差較大，因而GPC可以同時(shí)分析而不必進(jìn)行預(yù)先分離。一般來(lái)說(shuō)從高分子材料的GPC可以同時(shí)看到三個(gè)區(qū)域：A：高分子；B：添加劑和齊聚物；C：未反應(yīng)的單體和低分子的污染物，如水。(1)環(huán)氧樹(shù)脂中樹(shù)脂和齊聚物的同時(shí)分析

普通雙酚A型環(huán)氧樹(shù)脂有很寬的分子量范圍(高，中，低）。GPC能快速可靠地鑒別不同類(lèi)型環(huán)氧樹(shù)脂的分子量特性。低、中和高分子量雙酚A型環(huán)氧樹(shù)脂的GPC譜圖色譜條件：

四根微粒凝膠柱(7.7mm250mm)，孔徑分別為5、10、50和100nm，顆粒直徑10m；280nm下UV檢測(cè)；流動(dòng)相為四氫呋喃，流速1mL/min；柱溫為50℃；樣品量為10L0.2%~0.5%溶液

三種不同分子量的GPC譜圖如圖所示，圖上數(shù)字代表不同的聚合度n，樹(shù)脂和齊聚物的峰形特征可用作指紋圖，以區(qū)別不同廠家和批號(hào)的產(chǎn)品。(2)高分子材料中小分子的定性鑒別

和其他色譜方法一樣，GPC也可以用保留體積來(lái)鑒別或分離后用IR等方法鑒定中小分子物質(zhì)。如果能預(yù)測(cè)某未知峰屬于某種化合物，則將該化合物加入該試樣中，比較前后的譜圖變化，如果未知峰強(qiáng)化，則很可能就是該物質(zhì)。用強(qiáng)化法鑒別高分子材料中的小分子化合物的示意圖(1)丁苯橡膠在塑煉時(shí)分子量分布的變化

在塑煉過(guò)程中定時(shí)取樣分析，結(jié)果如圖。隨時(shí)間的增加，高分子量組分裂解增加，GPC曲線(xiàn)向低分子量方向移動(dòng)，經(jīng)過(guò)25min以后，高分子量組分幾乎完全消失。如果塑煉的目的就是消除該組分，那么25min足夠了。通過(guò)GPC數(shù)據(jù)可以幫助工作人員確定塑煉時(shí)間。3、在高分子材料生產(chǎn)過(guò)程中的檢測(cè)經(jīng)不同時(shí)間塑煉后的丁苯膠的GPC譜圖塑煉時(shí)間為：0：0min；1：4min；2：5min；3：25min；4：120min；5：180min(2)控制聚合反應(yīng)的終點(diǎn)

用GPC對(duì)聚合物進(jìn)行中間反應(yīng)分析，使生產(chǎn)人員能在達(dá)到預(yù)定的單體/聚合物比后即時(shí)終止反應(yīng)。用GPC對(duì)聚合終點(diǎn)控制分析的示意圖——反應(yīng)開(kāi)始時(shí)全部是單體；反應(yīng)進(jìn)行一半，部分單體部分聚合物；反應(yīng)終點(diǎn)，大部分是聚合物，單體/聚合物比為0.154、高分子材料老化過(guò)程研究

可以研究高分子材料在使用過(guò)程中的老化，研究老化機(jī)理。以高密度聚乙烯HDPE為例，必須加適量抗氧劑以提高耐候性。在耐候試驗(yàn)不同階段的HDPE樣品的GPC譜圖1-開(kāi)始時(shí)；2-第一階段；3-第二階段；4-最后階段5、高分子支化度的測(cè)定

表征高分子支化度的參數(shù)常用的是支化因子g：

顯然對(duì)于相同分子量的高分子，所以支化程度越大，g越小。另一個(gè)支化參數(shù)是G:[]b—支化高分子的特性粘度；[]l—線(xiàn)型高分子的特性粘度。因?yàn)橹Щ叻肿拥牧黧w力