分離工程第三章課件

第三章沉淀與泡沫分離第一節(jié)沉淀什么是沉析？沉析法純化蛋白質(zhì)的優(yōu)點有哪些？沉析的一般操作步驟是什么？何謂鹽析？其原理是什么？鹽析操作時常用的鹽是什么？影響鹽析的主要因素有哪些？通過本章學(xué)習(xí)應(yīng)掌握以下內(nèi)容沉淀（Precipitation）：是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)溶解度降低，生成固體凝聚物的現(xiàn)象。結(jié)晶：由溶解度降低引起的固體成相現(xiàn)象。沉淀的純度遠(yuǎn)低于結(jié)晶，是一種初級分離技術(shù)。但多步沉淀操作也可制備高純度的目標(biāo)產(chǎn)物，相當(dāng)于重結(jié)晶，沉淀分級目前主要用于蛋白質(zhì)的分離。常用沉淀方法的分類一、鹽析沉淀β和Ks的物理意義β—鹽濃度為0時，蛋白質(zhì)溶解度的對數(shù)值。與蛋白質(zhì)種類、溫度、pH值有關(guān)，與鹽無關(guān)；Ks—鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和無機鹽的種類有關(guān)，與溫度、pH值無關(guān)。Ks鹽析法：在一定pH和溫度下，改變體系離子強度進行鹽析的方法；β鹽析法：在一定離子強度下，改變pH和溫度進行鹽析；

其中，Ks鹽析法由于蛋白質(zhì)對離子強度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。而β鹽析法由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的純化。蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，鹽濃度高時，這些水分子被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相互結(jié)合，沉淀。鹽析（（NH4）2SO4）鹽析過程當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象—低鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度增大（2）“鹽析”現(xiàn)象—高鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降，原因如下：無機離子與蛋白質(zhì)表面電荷中和，形成離子對，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏；中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導(dǎo)致沉淀；Electricdoublelayer選擇鹽析鹽時還應(yīng)考慮：a、溶解度大。b、溶解度受溫度影響較?。籧、鹽溶液密度不高，利于沉淀的沉降或離心分離。d、常用的鹽析鹽是(NH4)2SO4，此外還有Na2SO4和NaCl。鹽析用鹽的選擇在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作用較弱（Ks）磷酸鉀>硫酸鈉>硫酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂

(2)溫度和pH值（影響）

高離子強度下，溫度升高，蛋白質(zhì)溶解度下降,減小。pH值接近蛋白質(zhì)pI值時，蛋白質(zhì)溶解度最小。(三)、鹽析操作(以硫酸銨為例)確定沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì)所需硫酸銨飽和度的實驗步驟（設(shè)操作溫度為0℃）：取部分料液，分成等體積的幾份，冷卻至0℃；用下式計算飽和度（濃度相當(dāng)于飽和濃度的百分?jǐn)?shù)）達(dá)到20％~100％所需加入硫酸銨量，并在攪拌條件下分別加到料液中，繼續(xù)攪拌1h以上，同時保持溫度在0℃；其中：W為硫酸銨加入量（g/L)；S1和S2為飽和度；505為0℃時硫酸銨飽和濃度（質(zhì)量百分比，g/L）；0.285為0℃時硫酸銨飽和濃度（體積百分比，L/L）。3000g下離心40min，將沉淀溶于2倍體積的緩沖液中，測定其中總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度；分別測上清液中總蛋白和目標(biāo)蛋白的濃度，比較沉淀前后蛋白質(zhì)是否保持物料守恒；

以上清液中總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度對飽和度作圖，從而可根據(jù)所要求達(dá)到的目標(biāo)蛋白純化倍數(shù)和回收率確定硫酸銨的加入量。(四)、應(yīng)用由于鹽析沉淀后產(chǎn)物中鹽含量較高，故一般在鹽析沉淀后，需進行脫鹽處理，才能進行后續(xù)的純化操作。

二、等電點沉淀等電點(pI)：蛋白質(zhì)靜電荷為零時的pH值為其等電點.利用蛋白質(zhì)在pH等于其等電點的溶液中溶解度下降的原理進行沉淀分級的方法稱為等電點沉淀法（Isoelectriprecipitation）。操作條件：低離子強度；pHpI。低離子強度調(diào)pH值至等電點，或在等電點的pH下利用透析方法降低離子強度，使蛋白質(zhì)沉淀。適用于疏水性大蛋白質(zhì)（如酪蛋白），對于親水性強的蛋白質(zhì)（如明膠）則不太適用。特點：優(yōu)點：無需后續(xù)的脫鹽操作。缺點：由于操作pH過低，容易引起目標(biāo)蛋白質(zhì)的失活.

三、有機溶劑沉淀定義：向蛋白質(zhì)溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有機溶劑，造成蛋白質(zhì)分子表面水化程度降低，從而發(fā)生沉淀的方法。例：血漿蛋白質(zhì)的分離純化，至今仍用此法常用的有機溶劑沉析劑乙醇：沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣；特點：介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48 丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取當(dāng)有機溶劑濃度增大時，水對蛋白質(zhì)分子表面上荷電基團或親水基團的水化程度降低，因而靜電吸引力增大。操作條件：低離子強度；等電點附近。加入有機溶劑充分?jǐn)嚢?，快速，蛋白質(zhì)與有機溶劑接觸時間短。特點：優(yōu)點：有機溶劑密度較低，易于沉淀分離；不需后續(xù)脫鹽處理；缺點：易引起蛋白質(zhì)變性，須在低溫下進行。有機溶劑沉析的特點分辨率高；溶劑容易分離，并可回收使用；產(chǎn)品潔凈；容易使蛋白質(zhì)等生物大分子失活；應(yīng)注意在低溫下操作；成本高溶劑選擇介電常數(shù)要小致變性作用要?。状迹┒拘砸　]發(fā)性適中水溶性要好影響有機溶劑沉析的主要因素溫度：低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有利于提高收率（溶解度下降）；攪拌速度：散熱溶液pH值：原則是避免目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)帶有相反的電荷，防止共沉現(xiàn)象。（pI）離子強度:離子強度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L樣品濃度:0.5~2%稀：溶劑用量大，回收率低，但共沉淀作用小濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強，分辨率低金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+本法應(yīng)用，注意下列各點：（1）降低溫度，能增加收率和減少蛋白質(zhì)變性，加有機溶劑于水常為放熱反應(yīng)，故操作時需冷卻。例：乙醇沉淀血漿蛋白，在-10℃下進行。（2）所選溶劑必須能與水互溶，而和蛋白質(zhì)不起作用，常用乙醇、丙酮。（3）蛋白質(zhì)分子量越大，產(chǎn)生沉淀需加入的有機溶劑量越少。如用丙酮作沉淀劑有下列關(guān)系式：[所需丙酮量]=1.8-0.12[蛋白質(zhì)分子量]（4）一種蛋白質(zhì)溶解度會由于另一種蛋白質(zhì)存在而降低。（5）沉淀的蛋白質(zhì)如不能再溶解，就可能已經(jīng)變性。（6）接近等電點時，引起沉淀所需加入有機溶劑量少。（7）少量中性鹽（0.1~0.2molL-1)的存在能產(chǎn)生鹽溶作用，增加蛋白質(zhì)在有機溶液水溶液中的溶解度，使沉淀蛋白質(zhì)所需有機溶劑量增大，一般I=0.05或稍低為最好，既能使沉淀迅速形成，又能對蛋白質(zhì)起保護作用。（8）鹽析法制蛋白質(zhì)透析除鹽，進一步純化可用有機溶劑沉淀。四、熱沉淀（Thermalprecipitation)定義：利用在較高溫度下，熱穩(wěn)定性差的蛋白質(zhì)發(fā)生變性沉淀的現(xiàn)象，分離純化熱穩(wěn)定性高的目標(biāo)蛋白的方法。熱沉淀基于蛋白質(zhì)的變性動力學(xué)。假設(shè)變性過程符合一級反應(yīng)規(guī)律：操作條件：調(diào)節(jié)pH；加入有機溶劑。特點：是一種變性分離法，帶有冒險性，需對目標(biāo)蛋白和共存雜蛋白的熱穩(wěn)定性有充分了解。五、其他沉淀法（一）、非離子型聚合物沉淀法

機理不清，可能是降低蛋白質(zhì)分子表面的水化程度或空間排阻作用。常用聚合物：聚乙二醇（PEG）。PEG是一種特別有用的沉淀劑，因為無毒、不可燃燒且對大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護作用。PEG沉淀分離蛋白質(zhì)的優(yōu)點：1、體系溫度只須控制在室溫下。2、沉淀的顆粒較大，產(chǎn)物易收集。3、PEG不會使蛋白變性。PEG沉淀分離蛋白質(zhì)的缺點：PEG很難從蛋白質(zhì)溶液中除去，須用超濾和液-液萃取解決。PEG分子量需大于4000，最常用6000和20000。所用PEG濃度通常為20%，濃度再高會使黏度增大，造成沉淀回收困難，若PEG對后繼分離步驟影響較小，可以不必除去。蛋白質(zhì)溶解度與PEG濃度之間的關(guān)系：lgS=lgS0-k[PEG]S:PEG存在時濃度，S0:無PEG時濃度，k:常數(shù)，與蛋白質(zhì)和PEG分子大小有關(guān)。（二）、聚電解質(zhì)沉淀法沉淀機理：與絮凝類似，在蛋白質(zhì)之間起架橋作用，同時還兼有鹽析作用。應(yīng)用：主要用于酶和食品蛋白的回收常用的聚電解質(zhì)：酸性多糖、海藻酸鹽、果膠酸鹽、卡拉膠和羧甲基纖維素等。聚電解質(zhì)是長鏈狀結(jié)構(gòu)，鏈上有許多活性官能團，如：-COOH、NH4+等離子型基團，通過靜電引力、范德華力、氫鍵強烈吸附膠體表面，產(chǎn)生架橋作用。鏈越長，活性基團越多，效果越好。（三）、金屬離子沉淀法沉淀機理：可與蛋白質(zhì)分子上的某些殘基發(fā)生作用而使蛋白質(zhì)沉淀。如Ca2+和Mg2+能與羧基結(jié)合，Mn2+和Zn2+能與羧基、含氮化合物以及雜環(huán)化合物結(jié)合。優(yōu)點：可使?jié)舛群艿偷牡鞍踪|(zhì)沉淀；沉淀后金屬離子可用離子交換樹脂或螯合劑除去。第二節(jié)泡沫分離自學(xué)思考題1、名詞解釋：鹽析和鹽溶、蛋白質(zhì)的等電點、蛋白質(zhì)變性。2、扼要解釋為什么大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在溶液中具有下列性質(zhì)？（1）在低pH值時沉淀。（2）當(dāng)離子強度從零逐漸增加時，其溶解度開始增加，然后下降，最后出現(xiàn)