生物化工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)及生產(chǎn)技術(shù)課件

第四章

生物化工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)

及生產(chǎn)技術(shù)

有機(jī)酸氨基酸生物可降解塑料功能性食品添加劑生物農(nóng)藥與生物肥料生物藥物及其他生物產(chǎn)品1、檸檬酸：檸檬酸(“枸椽酸”)：第一有機(jī)酸，2008年全球檸檬酸總銷(xiāo)量高達(dá)115萬(wàn)噸，食品用途約占6成，醫(yī)藥和其它工業(yè)用途（化妝品，洗滌劑等）約占4成。我國(guó)是世界主要檸檬酸生產(chǎn)國(guó)與出口國(guó)，出口量高達(dá)15萬(wàn)噸以上。

第一節(jié)有機(jī)酸一、重要的有機(jī)酸檸檬酸的消費(fèi)領(lǐng)域：飲料行業(yè)占40～45％食品添加劑等占15～20％洗滌劑占20～30％醫(yī)藥占5％其它占10％具有廣泛用途的有機(jī)酸。世界乳酸的總產(chǎn)量約為20萬(wàn)噸左右，日本和美國(guó)兩國(guó)的乳酸需求量3.5萬(wàn)噸。我國(guó)的乳酸目前已形成了約4萬(wàn)噸的生產(chǎn)能力。青島扶?；瘜W(xué)公司是國(guó)內(nèi)最大的精制(發(fā)酵)乳酸出口企業(yè)。

2、乳酸——聚乳酸牽頭發(fā)展

PLA為一種無(wú)毒高分子新材料，在環(huán)境中可自動(dòng)降解，可用于生產(chǎn)醫(yī)用塑料制品和食品包裝等。產(chǎn)業(yè)界認(rèn)定為新世紀(jì)最有發(fā)展前途的新型材料。由于我國(guó)原料玉米豐富，發(fā)展乳酸及聚乳酸產(chǎn)業(yè)的前景廣闊。目前，乳酸生產(chǎn)成本偏高以及聚乳酸聚合難題成為制約乳酸工業(yè)發(fā)展的瓶頸。

蘋(píng)果酸在飲料中使用較多。但由于價(jià)格較貴，故蘋(píng)果酸的用途受到了一定的限制。全球蘋(píng)果酸的年產(chǎn)銷(xiāo)量約在3萬(wàn)噸左右。蘋(píng)果酸有清除牙齒色斑和牙垢(牙石)的美容作用。故日本花王等日化產(chǎn)品廠(chǎng)商均已在牙膏、牙粉等潔齒產(chǎn)品中添加蘋(píng)果酸。3、蘋(píng)果酸——生產(chǎn)成本較高

而L蘋(píng)果酸可用于醫(yī)藥工業(yè)的輸液、pH調(diào)節(jié)劑和某些藥物的中間體。每噸純品65－70萬(wàn)元人民幣。生產(chǎn)成本高,出口數(shù)量少。我國(guó)采用固定化菌體將富馬酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)蘋(píng)果酸，因技術(shù)不過(guò)關(guān)，富馬酸殘留高，出口困難。而發(fā)酵法生產(chǎn)L－蘋(píng)果酸仍處于研究階段。葡糖酸是唯一具有促進(jìn)雙歧桿菌等“益生菌”生長(zhǎng)作用的有機(jī)酸。蜂蜜、釀造醋等產(chǎn)品均含有一定量的天然葡糖酸。酸味為檸檬酸的1/3。葡糖酸作為食品和醫(yī)藥原料(如用于生產(chǎn)“葡糖酸鈣)的用量正在逐年上升。4、葡糖酸——有保健新用途

主要來(lái)源是葡萄酒生產(chǎn)廠(chǎng)。酒石酸在食品工業(yè)中應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如檸檬酸那樣廣泛，但它卻是醫(yī)藥工業(yè)的重要原料。許多難溶藥物均可加工成為水溶性極佳的酒石酸鹽(如經(jīng)典藥物“酒石酸銻鉀”)。歐洲各大葡萄酒廠(chǎng)是世界最大的酒石酸生產(chǎn)基地，全球80%的酒石酸產(chǎn)自歐洲。發(fā)酵法生產(chǎn)酒石酸仍在研究中。5、酒石酸——八成產(chǎn)自歐洲琥珀酸在食品工業(yè)中應(yīng)用較少，也屬醫(yī)藥工業(yè)的常用原料之一。主要用于生產(chǎn)難溶藥物的水溶性鹽——琥珀酸鹽。全球琥珀酸總產(chǎn)銷(xiāo)量約在1萬(wàn)-2萬(wàn)噸左右。我國(guó)的琥珀酸生產(chǎn)仍以化學(xué)合成為主。未見(jiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的報(bào)道。6、琥珀酸——產(chǎn)量不大

重要的化工原料，主要用于晴綸化纖、樹(shù)脂、橡膠、涂料、造紙、制藥、農(nóng)藥、輕工、食品等領(lǐng)域（合成樹(shù)脂或在工業(yè)上用作除垢劑等）。世界年需衣康酸5－6萬(wàn)噸。主要生產(chǎn)國(guó)美國(guó)、日本、俄羅斯。我國(guó)以發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸，年產(chǎn)量5000t。大部分內(nèi)銷(xiāo)。因技術(shù)存在問(wèn)題，產(chǎn)品質(zhì)量不過(guò)關(guān)。外銷(xiāo)困難。7、衣康酸檸檬酸（citricacid）又名枸櫞酸，學(xué)名3-羥基-3-羧基戊二酸(C6H8O7)是生物體代謝產(chǎn)物之一，廣泛分布于自然界、動(dòng)物及人的器官中。無(wú)色透明或半透明晶體，或粒狀、微粒狀粉末，無(wú)臭，具有強(qiáng)烈的酸味，但令人愉快。稍有澀味。極易溶于水，乙醇，微溶于乙醚。無(wú)旋光性。

二檸檬酸的發(fā)酵生產(chǎn)HOOCCH2CHOHCOOHCH2COOH(一)、概述（1）食品方面：檸檬酸被稱(chēng)為第一食用酸味劑飲料——不僅賦予飲料水果風(fēng)味，而且具有增溶、緩沖、抗氧化等作用，能是飲料中的糖、香精、色素等成分交融協(xié)調(diào)果醬和果凍，釀造酒，冰激淋和人造奶油（增加乳化穩(wěn)定性）、腌制品（除腥去臭、抗氧化）、罐頭食品、豆制品和調(diào)味品

1、檸檬酸的應(yīng)用

（2）醫(yī)藥工業(yè)、美容、化妝品工業(yè)中作為活性藥物的增溶劑，改善藥物口感和清涼，解毒功能。洗發(fā)和染發(fā)劑中均有檸檬酸具有防腐，去除頭皮屑功能，洗頭時(shí)可增加頭發(fā)的光澤，恢復(fù)頭發(fā)的彈性。

1784年;由Scheels氏發(fā)現(xiàn)檸檬酸

1893年至1917年：青霉菌生產(chǎn)（德國(guó)微生物學(xué)者

Wehmer首先用青霉菌生產(chǎn)檸檬酸）；1917年至1938年：黑曲霉，淺盤(pán)發(fā)酵，奠定了大規(guī)模生產(chǎn)的基礎(chǔ)；1938年至1951年：深層發(fā)酵，用糖蜜為原料（1951年美國(guó)Miles公司首先采用深層發(fā)酵法）。2、國(guó)外檸檬酸發(fā)酵技術(shù)發(fā)展的三個(gè)歷史時(shí)期我國(guó)在20世紀(jì)40年代初開(kāi)始淺盤(pán)發(fā)酵；60年代末開(kāi)始深層發(fā)酵（先為薯干原料，后發(fā)展到精淀粉或糖蜜原料）；1970年開(kāi)始進(jìn)行石油為原料發(fā)酵檸檬酸(C10～22鏈烷烴等）目前，我國(guó)檸檬酸生產(chǎn)廠(chǎng)已過(guò)百家，年生產(chǎn)能力達(dá)80多萬(wàn)噸，居世界第一位。

淀粉質(zhì)原料或糖質(zhì)原料：

黑曲霉（Aspergillus

niger

）

正烷烴為原料：解脂假絲酵母（Candidalipolytica

）熱帶假絲酵母（C.tropicalis

）(二)、檸檬酸生產(chǎn)菌1、簡(jiǎn)介：將接種后的發(fā)酵液分裝入發(fā)酵盤(pán)進(jìn)行發(fā)酵的方法。傳統(tǒng)方法，設(shè)備投資少，動(dòng)力消耗低，原料粗放、價(jià)廉，生產(chǎn)易控制，目前已實(shí)現(xiàn)全部自動(dòng)化操作。缺點(diǎn)是設(shè)備占地大，勞動(dòng)強(qiáng)度大，能耗高，產(chǎn)率和回收率低，副產(chǎn)物多。(四)、檸檬酸的靜止淺盤(pán)發(fā)酵工藝2、淺盤(pán)發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵盤(pán)：材質(zhì)，以不銹鋼為佳。規(guī)格4m×1.2m×0.15m。其次還有鐵盤(pán)、鋁盤(pán)、耐酸塑料盤(pán)。發(fā)酵盤(pán)經(jīng)常受到酸液、高溫蒸汽、甲醛、微生物的侵蝕，所以材料和涂料要求嚴(yán)格。為了防止蒸發(fā)過(guò)快和天花板冷凝水滴入盤(pán)中，每個(gè)發(fā)酵盤(pán)上有一盤(pán)罩5、干孢子制備工藝流程：一級(jí)發(fā)酵用種子質(zhì)量鑒定培養(yǎng)器液態(tài)培養(yǎng)32－35℃干孢子收集干燥40－50℃無(wú)菌空氣成品保藏使用前檢查斜面培養(yǎng)30℃原菌種三角瓶培養(yǎng)3二級(jí)三級(jí)（總發(fā)酵時(shí)間：8～9天）6、液體表面發(fā)酵工藝流程pH值3～4.5攪拌煮沸15～30min靜止4h取上清加等體積沸水，糖蜜質(zhì)量1%生石灰糖蜜原料硫酸或硫酸鈉糖蜜濃度12～16%（以蔗糖計(jì)）冷卻至60～70℃加營(yíng)養(yǎng)鹽和抗菌劑入室裝盤(pán)（40～45℃

液層深8～20㎝）冷卻至35℃接種黑曲霉干孢子（100mg/m2表面積）通風(fēng)培養(yǎng)（35℃，3天）控溫發(fā)酵至結(jié)束26～28℃，pH2.5最大通風(fēng)量(15～18m3/m2·h，濕度75%以上)(五)、檸檬酸的深層發(fā)酵工藝1檸檬酸發(fā)酵的原料原料糖質(zhì)原料和石油烷烴。糖質(zhì)原料包括薯類(lèi)：甘薯、薯干、木薯、木薯干、馬鈴薯、薯渣。谷類(lèi)：玉米、小麥、面粉、大米。淀粉：谷類(lèi)與薯類(lèi)加工的淀粉。砂糖：白砂糖、赤砂糖、糖蜜。

淀粉糖：淀粉水解糖(單糖、雙糖、糊精、葡萄糖母液)果實(shí)，糧食加工下腳料：各種含糖果實(shí)、糖食加工的下腳料等。石油烷烴原料包括正烷烴、乙酸、乙醇等

淀粉水解糖的制備

淀粉質(zhì)原料是發(fā)酵工業(yè)常用的原料，大多數(shù)發(fā)酵生產(chǎn)菌不能直接利用或僅微弱利用淀粉，因此淀粉質(zhì)原料必須轉(zhuǎn)化為葡萄糖等可發(fā)酵性糖，才能被生產(chǎn)菌利用。工業(yè)生產(chǎn)將淀粉水解為葡萄糖的過(guò)程稱(chēng)為淀粉的糖化，所制得的糖液稱(chēng)為淀粉水解糖碳源：黑曲霉能利用的碳源很多，淀粉和二糖，單糖大多能利用。從生產(chǎn)角度看，葡萄糖、蔗糖、糊精是最好的碳源。但為了降低成本，多用廉價(jià)的甘薯、玉米、小麥及其淀粉、糖蜜。高糖濃度是檸檬酸深層發(fā)酵的特征，薯干粉深層發(fā)酵，粉漿濃度可達(dá)16－20％。淀粉質(zhì)粉漿濃度25%。2培養(yǎng)基生理酸性氮:（NH4)2SO4,（NH4)3PO4

（NH4)2HPO4

（NH4)Cl（NH4)2CO3生理堿性氮:NaNO3,KNO3LiNO3CaNO3

有機(jī)氮:麩皮、米糠、蛋白胨、氨基酸、尿素等。氮源：檸檬酸發(fā)酵中的氮源有氮源是黑曲霉合成細(xì)胞物質(zhì)和代謝調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)，特別是細(xì)胞中銨離子濃度的升高，能解除ATP和檸檬酸對(duì)磷酸果糖激酶的反饋抑制，有利于檸檬酸的生成與積累。在檸檬酸生產(chǎn)中，黑曲霉偏好生理酸性氮[如（NH4)2SO4]，酸性氮中的銨離子被利用后，使培養(yǎng)基變酸，可以使發(fā)酵中的黑曲霉生長(zhǎng)階段結(jié)束，轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸階段，pH下降到較低水平有利于檸檬酸的積累，所以銨鹽即可以調(diào)節(jié)代謝，也可以控制pH。無(wú)機(jī)鹽：無(wú)機(jī)鹽是黑曲霉生長(zhǎng)和檸檬酸發(fā)酵不可缺少的物質(zhì)，具有構(gòu)成菌體，促進(jìn)代謝，促進(jìn)產(chǎn)酸的作用。我國(guó)采用誘變方法改良的菌株耐金屬離子，原料與水可不經(jīng)處理用于發(fā)酵。采用薯干粉、馬鈴薯、木薯和糖蜜原料發(fā)酵，其中P、K、Mg、S已夠黑曲霉生長(zhǎng)，不需專(zhuān)門(mén)添加。要求KH2PO4KClMgSO4.7H2OZn2＋Mn2＋Cu2＋SFe2＋％％％mg/L深層0.05-0.5

0.01-0.030.01-0.05

<0.3<0.2<0.5<0.07<0.2

發(fā)酵黑曲霉對(duì)無(wú)機(jī)鹽及微量元素的要求鏡檢：菌絲粗壯，結(jié)成菊花狀小球體，無(wú)異味，無(wú)雜菌。pH：2.0-2.5酸度：0.5-2.0%檸檬酸含量：0.5g/dl種子質(zhì)量要求：3檸檬酸深層發(fā)酵工藝流程（薯干原料）原始菌種實(shí)罐滅菌預(yù)處理培養(yǎng)基配制原料實(shí)罐液化粉碎無(wú)菌空氣麩曲菌種空氣凈化系統(tǒng)空壓機(jī)種子罐試管斜面環(huán)境空氣過(guò)濾發(fā)酵連消發(fā)酵成熟醪去檸檬酸提取工段代表菌種：Co827、γ-130、T419液體深層發(fā)酵工藝三級(jí)過(guò)濾↓黑曲霉↓原料,配料↓滅菌空氣ⅠⅡⅢ無(wú)菌空氣檸檬酸（鹽）ⅣⅤ無(wú)菌空氣制備和有氧發(fā)酵系統(tǒng)（氣升式發(fā)酵罐）生產(chǎn)實(shí)例工藝說(shuō)明菌種：Co827麩曲菌種：制法同前種子罐培養(yǎng)基：干薯干粉16-20%，（NH4)2SO40.5%，0.1MPa蒸汽滅菌30min，接入1000ml三角瓶麩曲菌種20-50只（根據(jù)發(fā)酵罐容積定）。35±1℃培養(yǎng)16-24h。發(fā)酵罐培養(yǎng)基：干薯干粉16-20%，0.1%的α-淀粉酶（中溫），115℃滅菌10－15min，培養(yǎng)溫度35±1℃，通風(fēng)量0.08-0.15m3/m3.min（視接種方式及培養(yǎng)情況而定）。溫度控制黑曲霉屬嗜熱菌，最適生長(zhǎng)溫度33－37℃，生產(chǎn)中溫度控制在35±1℃。若采用孢子接種，在孢子發(fā)芽和菌球體形成階段，可采用40℃高溫培養(yǎng)，促進(jìn)其發(fā)育，進(jìn)入產(chǎn)酸期再降到35℃左右。pH控制黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌發(fā)育適宜pH3－7。一般在生產(chǎn)中，在菌種生長(zhǎng)期，pH維持在4.5(有利于糖化）。而檸檬酸積累時(shí)，即產(chǎn)酸期最適pH2.0-3.0。pH3.0以上易產(chǎn)生草酸。采用薯干發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸，初始pH不調(diào)節(jié)，為自然pH。接種量孢子接種量與產(chǎn)酸的速率成正比關(guān)系，隨著孢子接種量的增加，檸檬酸的產(chǎn)率也提高。溶解氧的控制黑曲霉的檸檬酸產(chǎn)生菌屬于嚴(yán)格的好氧菌，在生長(zhǎng)、繁殖和產(chǎn)酸階段均需要氧，一般黑曲霉生長(zhǎng)期溶氧分壓＞1.8kPa，產(chǎn)酸期溶氧分壓＞3.2kPa由于菌體生長(zhǎng)過(guò)程中呼吸作用，消耗大量的氧氣，特別當(dāng)菌體生長(zhǎng)接近最大值時(shí)(20～24h)即旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，其需氧達(dá)到最高蜂，其后(一般24—30h)菌體生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)入產(chǎn)酸期，氧的消耗率立即降低到一個(gè)較低的水平，并一直持續(xù)到發(fā)酵終了。(六）檸檬酸生產(chǎn)下游工程成熟的檸檬酸發(fā)酵醪，主要成分除檸檬酸，還有菌體，纖維、有機(jī)雜酸、糖、蛋白類(lèi)膠體物質(zhì)、色素、礦物質(zhì)及其它代謝產(chǎn)物。來(lái)源于原料及發(fā)酵過(guò)程中。以溶解或懸浮狀存在于發(fā)酵醪中。通過(guò)各種理化方法，清除這些雜質(zhì)，得到符合各級(jí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檸檬酸成品的全過(guò)程，即為檸檬酸生產(chǎn)的下游工程。發(fā)酵醪精濾凈化液復(fù)濾過(guò)濾陽(yáng)離子交換拄調(diào)漿粗檸檬酸液預(yù)熱鈣鹽離子交換工藝流程活性碳粒濾液酸解蒸發(fā)結(jié)晶離心陰離子交換拄預(yù)處理復(fù)濾過(guò)濾洗鈣中和過(guò)濾濕晶包裝干燥筒倉(cāng)篩分入庫(kù)成品菌渣濃有機(jī)廢水淡有機(jī)廢水濕石膏渣加熱90℃CaCO390℃H2SO4等外品洗晶水母液70℃

乳酸,又名丙醇酸,學(xué)名α-羥基丙酸,分子式為C3H6O3,其分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子,因此具有旋光性按其構(gòu)型及旋光性可分為L(zhǎng)-乳酸、D-乳酸和DL外消旋乳酸三類(lèi).它是世界上公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一,是制造無(wú)毒的高分子化合物聚L-乳酸的單體,也是醫(yī)藥、印刷、印染、制革、食品等工業(yè)的重要原料。二乳酸發(fā)酵

作為一種食品添加劑人體只含有L-乳酸脫氫酶,所以只能夠分解自身產(chǎn)生或攝入的L-乳酸,所以高光學(xué)純度的L-乳酸更受市場(chǎng)的青睞。自然界中可產(chǎn)生L-乳酸的微生物很多,但產(chǎn)酸能力強(qiáng),可應(yīng)用到工業(yè)上的只有霉菌中的根霉及細(xì)菌的乳桿菌屬、鏈球菌屬及芽孢桿菌屬,下表列出了一些主要的產(chǎn)L-乳酸的微生物。

根霉屬(Rhizopus)中產(chǎn)L一乳酸的菌種很多,有米根霉(Rhizopusoryzae)、黑根霉(Rhizopusnigricans)、華根霉(Rh.chinensis)、行走根霉(Rhizopusstolonifer)、小麥曲根霉(Rhizopusritici)和美麗根霉(Rhizopuselegans)等十多種,其中米根霉生產(chǎn)L一乳酸的能力最強(qiáng)。

米根霉菌落疏松或稠密,最初呈白色,后變?yōu)榛液稚蚝诤稚＞z爬行,無(wú)色,于37-40℃生長(zhǎng)。米根霉能夠利用淀粉等廉價(jià)原料,營(yíng)養(yǎng)要求粗放,菌絲體大而易于分離,利于L一乳酸的精制,成為國(guó)內(nèi)外廣泛研究的發(fā)酵生產(chǎn)菌。

國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的研究,主要是從發(fā)酵原料的選擇、菌種的選擇和改良、發(fā)酵工藝技術(shù)的改進(jìn)三個(gè)方面進(jìn)行的（一）發(fā)酵制備L-乳酸所用的原料及選擇

1發(fā)酵制備L-乳酸所用原料的種類(lèi)目前國(guó)內(nèi)外發(fā)酵制備乳酸所用原料多集中于農(nóng)副產(chǎn)品，也有利用纖維等廢棄物發(fā)酵乳酸的報(bào)道。

以玉米淀粉或玉米粉發(fā)酵制備乳酸；以大米粉發(fā)酵制備乳酸；以紅薯淀粉發(fā)酵制備乳酸；以纖維等廢棄物發(fā)酵制備乳酸；以廢食品等為碳源進(jìn)行乳酸制備。

YuRC等人對(duì)直接發(fā)酵農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)L-乳酸進(jìn)行了研究，其結(jié)果是每千克粗玉米淀粉原料生成350g以上的L-乳酸。白冬梅等人對(duì)玉米淀粉先液化糖化再進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)酸71.65g/L。吳清林等人直接對(duì)玉米粉進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)物理方法處理，克服了淀粉濃度過(guò)高時(shí)基質(zhì)變?yōu)槟z而不能發(fā)酵的困難，不需經(jīng)液化糖化程序。

發(fā)酵制備乳酸的發(fā)展方向是對(duì)淀粉質(zhì)原料的直接應(yīng)用，不需經(jīng)過(guò)液化和糖化，這樣可以大大簡(jiǎn)化工序、降低成本，為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。另一發(fā)展方向就是利用低品位的原料(如生物質(zhì)原料、廢纖維、廚房垃圾等)發(fā)酵制備乳酸，以實(shí)現(xiàn)資源循環(huán)利用和可持續(xù)利用。發(fā)酵制備L-乳酸原料的利用方式

發(fā)酵制備L-乳酸原料利用方式的不同決定整個(gè)工藝的進(jìn)程，影響生產(chǎn)的成本。目前發(fā)酵制備L-乳酸對(duì)原料的利用方式主要集中于：①先經(jīng)液化再糖化，進(jìn)而再經(jīng)微生物利用；

②糖化和發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行；

③對(duì)淀粉質(zhì)原料直接進(jìn)行利用，不經(jīng)過(guò)液化糖化處理，可簡(jiǎn)化工藝過(guò)程，但對(duì)菌種要求較高，目前產(chǎn)率較低。（二）菌種的選擇和改良

菌種選育菌種的優(yōu)良直接關(guān)系到發(fā)酵過(guò)程的控制及其產(chǎn)量等,是發(fā)酵過(guò)程中的一個(gè)至關(guān)重要的影響因素。目前以米根霉為親本的優(yōu)良菌株的選育有:1、常規(guī)誘變育種只有乙醇脫氫酶（ADH）活性減弱的菌株才能生長(zhǎng)。抑制ADH活性，降低丙酮酸向乙醇支路的轉(zhuǎn)化，可能會(huì)提高丙酮酸向乳酸支路的碳流。

發(fā)酵復(fù)篩，得到最優(yōu)突變株：取原始菌株、初篩后的突變菌株進(jìn)行初步發(fā)酵。測(cè)定乳酸產(chǎn)量，選擇出乳酸高產(chǎn)突變株。

育種實(shí)驗(yàn)方案流程：2、離子注入誘變育種

離子注入生物體誘變育種是人工誘變方法的一種新發(fā)明,已經(jīng)證實(shí)離子注入誘變,可以獲得高突變率,擴(kuò)大突變譜,為篩選優(yōu)良的突變型菌株提供廣闊的空間。方法培養(yǎng)方法：需要用到：斜面培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)低能離子注入：樣品的制備：長(zhǎng)好的新鮮斜面,用7～10mL生理鹽水洗下斜面孢子,用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾得到無(wú)菌絲體孢子懸液,取稀釋10倍孢子懸液0.1mL均勻涂布于無(wú)菌平皿風(fēng)干。低能離子誘變處理：一般采用N+，能量為10keV~15keV，需要采用不同的劑量去處理。樣品、稀釋、分離、培養(yǎng)及篩選：1mL生理鹽水洗滌注入后的樣品,將洗脫液稀釋到10-2～10-3，取0.05mL涂布于溴甲酚綠平板或琥珀酸平板上，34～36℃培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行初篩，復(fù)篩。

古紹彬、葛春梅等采用離子束誘變方法,對(duì)米根霉PW352進(jìn)行改良,以葡萄糖為碳源獲得高產(chǎn)L(+)-乳酸菌株RE3303,產(chǎn)酸能力達(dá)131～136g/L,最高可達(dá)140g/L,糖轉(zhuǎn)化率為86%～90%,產(chǎn)酸比PW352提高75%。

楊英歌、李文等采用氮離子注入誘變方法，對(duì)出發(fā)菌株米根霉RLC41-6進(jìn)行改良，獲得高產(chǎn)L(+)-乳酸菌RQ4012，以木糖作為碳源，發(fā)酵周期為72h，產(chǎn)酸能力達(dá)74.37g/L，產(chǎn)酸速達(dá)1.03g/(L.h)，比RLC41-6提高了1.6倍。經(jīng)過(guò)多次傳代實(shí)驗(yàn)證明該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

李市場(chǎng)、葛春梅等采用離子修飾技術(shù)對(duì)一株產(chǎn)L-乳酸的米根霉菌P988進(jìn)行誘變處理,從正變菌株中反復(fù)篩選,得到一株產(chǎn)酸量高的菌株P(guān)N2207,產(chǎn)酸量達(dá)110g/L,比出發(fā)菌株提高了23%,經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代試驗(yàn),其遺傳性狀穩(wěn)定。3.利用基因工程技術(shù)得到高產(chǎn)的目的工程菌株。

L-乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase)以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+/NADH作輔酶,可逆催化氧化L-乳酸生成丙酮酸,因此可以提高L-乳酸脫氫酶表達(dá)基因在菌株中的擴(kuò)增,使其向有利于L-乳酸生成的方向進(jìn)行。Skory首次將米根霉的乳酸脫氫酶基因在酵母菌中表達(dá)。其后又通過(guò)提高乳酸脫氫酶活性來(lái)提高米根霉的產(chǎn)酸能力。盡管基因工程實(shí)現(xiàn)了有目的、有控制的菌株選育,但目前關(guān)于插入的DNA片斷在米根霉菌株中是如何結(jié)合與復(fù)制的還不清楚,在如何選擇最佳質(zhì)粒載體等方面也還有待進(jìn)一步的研究。

根霉發(fā)酵機(jī)理L-乳酸發(fā)酵按發(fā)酵過(guò)程中生成產(chǎn)物的不同,可分成同型發(fā)酵及異型發(fā)酵兩類(lèi),不同菌種有不同的乳酸發(fā)酵機(jī)理,細(xì)菌發(fā)酵為厭氧或微好氧。細(xì)菌的同型發(fā)酵一般是通過(guò)糖酵解途徑,異型發(fā)酵有6-磷酸葡萄糖酸途徑和雙歧途徑兩種。根霉發(fā)酵屬好氧異型發(fā)酵,但其途徑與細(xì)菌異型發(fā)酵不同,是通過(guò)糖酵解途徑,發(fā)酵產(chǎn)生L-乳酸的同時(shí)產(chǎn)生乙醇、富馬酸等,糖轉(zhuǎn)化率較低。（三）發(fā)酵工藝技術(shù)同型乳酸發(fā)酵是葡萄糖經(jīng)直接酵解途徑降解為丙酮酸,丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下還原為乳酸。此發(fā)酵過(guò)程中,1mol葡萄糖可以生成2mol乳酸,理論轉(zhuǎn)化為100%。

異型乳酸發(fā)酵是某些乳酸細(xì)菌利用磷酸已糖途經(jīng)(HMP途徑),分解葡萄糖為6-磷酸核酮酸,再經(jīng)差向異構(gòu)酶作用變成5-磷酸木酮糖,然后經(jīng)磷酸酮解酶催化裂解反應(yīng),生成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。磷酸酮解酶是異型乳酸發(fā)酵的關(guān)鍵酶。乙酰磷酸進(jìn)一步還原為乙醇,同時(shí)放出磷酸。而3-磷酸甘油醛經(jīng)EMP途徑后半部分轉(zhuǎn)化為乳酸,同時(shí)產(chǎn)生兩分子ATP。扣除發(fā)酵時(shí)激活葡萄糖消耗的1分子ATP,凈得1分子ATP。因此由葡萄糖進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵,其產(chǎn)酸能力比同型乳酸發(fā)酵低一半。異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)物除乳酸外還有乙醇、CO2和ATP。

雙歧發(fā)酵是兩歧雙岐桿菌(Bifidobacteriumbi2fidum)發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸的一條途徑。其發(fā)酵途徑如下:乳酸生產(chǎn)的傳統(tǒng)方法是采用游離細(xì)胞在攪拌罐中進(jìn)行發(fā)酵，由于米根霉的菌絲發(fā)達(dá)，在罐中易形成大的菌絲團(tuán)，引起氧氣及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞困難，或纏繞在攪拌槳上，使攪拌阻力增加，造成產(chǎn)酸速率低、得率低、生產(chǎn)不穩(wěn)定等問(wèn)題。Cachon和Divies的研究表明固定化技術(shù)可以作為一種穩(wěn)定菌體活力、防止質(zhì)粒流失的工具。因此利用固定化技術(shù)生產(chǎn)乳酸可以提高細(xì)胞濃度和乳酸產(chǎn)率。

米根霉發(fā)酵工藝

在工業(yè)化生產(chǎn)中最重要的是：固定化細(xì)胞載體可以反復(fù)使用，盡量減少接種次數(shù)，節(jié)省了大量的人力、物力和能源。因此，固定化技術(shù)是提高生物催化劑利用率、生物反應(yīng)速率以及實(shí)現(xiàn)高效連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程的有效方法。用于米根霉固定化發(fā)酵的載體種類(lèi)相對(duì)比較多，但是很少能優(yōu)化出用于大規(guī)模生產(chǎn)并創(chuàng)造出良好的經(jīng)濟(jì)效益的載體規(guī)格，所以在以后對(duì)于乳酸固定化發(fā)酵的研究中，載體的優(yōu)化和改良必將成為新的研究熱點(diǎn)。