聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳課件

聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳第一部分實驗簡介一、實驗?zāi)康?/p>

通過雙向電泳實驗，初步掌握電泳的基本理論、雙向電泳實驗的設(shè)計原理和實驗技能。二、實驗原理根據(jù)不同的蛋白質(zhì)具有不同的分子量和等電點的特點。利用這一性質(zhì)首先通過毛細管聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦技術(shù)將不同等電點的蛋白質(zhì)分開，然后通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將相同或相近等電點而分子量不同的蛋白質(zhì)進行相對分子量分離。經(jīng)過二維電泳分離的蛋白質(zhì)在二維電泳圖譜所處的位置，就是該蛋白質(zhì)的相對分子量和等電點。三、實驗流程蛋白樣品的制備↓等電聚焦凝膠溶液的配制↓灌注毛細管凝膠↓組裝第一向電泳槽↓聚焦電泳↓停止電泳↓取出毛細管膠↓毛細管膠置平衡液中平衡第二部分實驗方法第一向電泳——毛細管等電聚焦電泳（IEF）1.儀器準備雙向電泳系統(tǒng)一套（見清單）燒杯1000mL、50mL各1個量筒1000mL（或500mL）、100mL、10mL各1個注射器1mL（帶長針頭）、微量注射器100μL（或50μL）各1支大塑料盒1個滴管1支2．溶液配制(1)覆蓋溶液（25mL/班）

含8mol/L尿素，1%兩性電解質(zhì)pH3~9.5，5%(w/v)NP40(NonidetP40Substitute)和100mmol/LDTT取12g尿素，0.25mL兩性電解質(zhì)(pH3~9.5)，12.5mL的10%的NP40和0.386gDTT，用重蒸水溶解后，定容到25mL。溶液不能受熱,儲存在冰箱中。(2)平衡溶液（250mL/班）Tris-HCl(pH6.8)緩沖液，含2%SDS，100mmol/LDTT和10%甘油15mLTris-HCl(pH6.8)，50mL10%SDS，3.86gDTT和29mL甘油，用重蒸水定容到250mL，室溫存放。

(3)30%Acrylamide第一向儲液（100mL/班）

含28.4%(w/v)acrylamide和1.6%(w/v)N,N'-methylene-bis-acrylamide用重蒸水先將1.6gbisacrylamide溶解后，再加入28.4gacrylamide，溶解，用重蒸水定容到100mL。如果溶液混濁，需要進行過濾。溶液存放在棕色瓶中，4°C貯藏，3~4星期內(nèi)使用。(4)10%(w/v)NP40（20mL/班）

配制100mL溶液，稱量10gNP40，用重蒸水定容到100mL，室溫存放。(5)20mmol/LNaOH配制500mL，稱0.4gNaOH用蒸餾水定容到500mL。3．實驗步驟(1)準備玻璃管

取4支18cm的長玻璃管，洗凈晾干。(2)配制第一向凝膠溶液（8mL/4組）

配制方法見表1。表1第一向凝膠溶液配方尿素3.84g重蒸水2.0mL30%Acrylamide儲液1.6mL攪拌溶解10%NP401.5mL兩性電解質(zhì)(pH3~9.5)0.50mL10%過硫酸銨*15μLTEMED*10μL

(3)灌制第一向凝膠（每組2人共制作4根膠柱）

取1支1mL注射器和一根長針頭，吸取約0.5mL第一向凝膠溶液，再取1支玻璃管，用手指墊一塊封口膜堵住玻璃管的一端，將長針頭全部插入玻璃管中，一邊注入凝膠溶液一邊后退針頭，注意針頭不要露出膠面,直至凝膠溶液到達玻璃管頂端，撤出針頭，用濾紙擦干玻璃管口的凝膠溶液，然后用封口膜封住該端管口，將玻璃管倒置，將長針頭從玻璃管的另一端插入管內(nèi)凝膠液面下，用同樣方法加入凝膠溶液至距管口2cm處，將玻璃管垂直放置，然后立即用微量注射器在膠面上加少量重蒸水覆蓋，大約30min后凝膠聚合。

(4)加樣

待凝膠聚合后，用微量注射器吸去覆蓋在膠上的重蒸水。在每根膠柱上加20~30μL蛋白質(zhì)樣品溶液，然后再加入覆蓋溶液至管口。(5)安裝電泳槽

加樣后將玻璃管插入電泳槽的架子上，在上槽中玻璃管上端露出1cm，剝?nèi)ゲＡЧ芟露说姆饪谀ぃ瑴蕚潆娪?。在電泳槽的下槽?000mL10mmol/LH3PO4溶液，將柱膠下端浸入到H3PO4溶液中，注意膠下端不可有氣泡(如果有氣泡，可以先用注射器將膠下端用H3PO4溶液灌滿，再將柱膠插入H3PO4溶液中)。上槽倒入500mL20mmol/LNaOH溶液，蓋上電泳槽蓋，注意正負電極。（8）平衡:將推出的一條凝膠條放入盛有10ml平衡液的小燒杯中，浸泡平衡20min，然后進行第二向電泳.(9)染色:另一條膠放入固定液中固定1~2h，用考馬斯亮藍R250染色1h，再用脫色液脫色，觀察第一向聚焦效果。第二向電泳--SDS-聚丙烯酰胺凝膠電（SDS）1．溶液配制(1)30%Acrylamide第二向儲液（500mL/班）

含29.1%(w/v)acrylamide和0.9%(w/v)N,N'-methylene-bis-acrylamide，配制方法同第一向儲液。(2)10%SDS稱10gSDS用重蒸水溶解，定容到100mL，室溫存放。

(3)分離膠緩沖液（300mL/班）1.5mol/LTris-HCl緩沖液，pH8.9。稱Tris109g，取1mol/LHCl144mL，用重蒸水定容至300mL，4°C保存。(4)濃縮膠緩沖液（300mL/班）0.5mol/LTris-HCl緩沖液，pH8.9。稱Tris6g，取1mol/LHCl48mL，用重蒸水定容至100mL，4°C保存。(5)電極緩沖液（2500mL/2組）

稱6g的Tris，29g甘氨酸，2.5gSDS，用蒸餾水定容到2.5L。

2．實驗步驟 (1)組裝夾心式玻璃板、制膠支架底座調(diào)水平；取一塊長玻璃板和一塊帶磨口槽的短玻璃板，將短玻璃板帶磨口槽的一邊位于上端與長玻璃相對，兩玻璃板之間的左、右兩端各放入一條間隔條，對齊，插入玻璃板固定夾，將上面的固定螺絲擰緊，將此夾心式玻璃板放入制膠支架底座，插入凸輪，向內(nèi)側(cè)推入并旋轉(zhuǎn)180o，夾心式玻璃板即被固定。(2)分離膠配制分離膠按照凝膠濃度不同分為三層，自下而上濃度遞減，每層高度約4~5cm，分別按照表2配制，并依次灌制。

試劑凝膠濃度

18%12%7%30%Acrylamide儲液/mL7.24.82.8

分離膠緩沖液/mL3.03.03.0

重蒸水/mL1.64.06.0

10%SDS/mL0.120.120.12

TEMED/μL202020

10%AP/μL303030

總體積/mL121212

(3)灌注分離膠首先將配制的第一層凝膠溶液用滴管沿著長玻璃板內(nèi)側(cè)緩緩加入凝膠腔，小心不產(chǎn)生氣泡，然后用少量1/4濃度的分離膠緩沖液封膠面（高度約2mm），凝膠聚合大約30min。待凝膠聚合后用濾紙片吸干封膠緩沖液，灌注第二層凝膠溶液，并封膠面。凝膠聚合后灌注第三層凝膠溶液，最終凝膠距離短玻璃板上沿3cm左右,最后用1/4濃度的分離膠緩沖液封膠面（約20mm）。

試劑凝膠濃度

5%30%Acrylamide儲液/mL2.5

濃縮膠緩沖液/mL2.0

重蒸水/mL10.2

10%SDS/mL0.15

TEMED/μL30

10%AP/μL45

總體積/mL15

(5)安裝第二向電泳裝置在冷卻槽上取下紅色密封條，安裝上白色密封條，將夾心式凝膠板從灌膠支架底座上取下，安裝在冷卻槽上。(6)凝膠拼接①

將平衡好的膠條用少量的電極緩沖液漂洗，擺放在一塊干凈的玻璃板上，膠條的正極端位于小加樣槽一端。膠條兩端各切去約2cm，使凝膠長度略短于加樣槽；②輕輕拔出樣品槽模板，在小加樣槽中加入5~10μL標準蛋白質(zhì)；③用滴管將已加熱融化的用電極緩沖液配制的1％瓊脂快速加在濃縮膠上，使瓊脂在濃縮膠上鋪開形成一層水平的膠層，瓊脂高度為1~2mm；(7)電泳將電泳裝置放入電泳槽中，在上槽中灌入電極緩沖液，緩沖液高過短板，其余緩沖液到入下槽，應(yīng)高過凝膠板下沿2cm。蓋上電泳槽蓋子，接通電源，恒壓60V，電泳30min，樣品進入凝膠后，調(diào)節(jié)恒壓250V，電泳至溴酚蘭到達分離膠底部1cm左右時停止。(8)固定倒去電極緩沖液，拆開電泳槽，取下凝膠板，放入固定液中，室溫過夜。(9)染色和脫色用考馬斯亮藍R250染色液染色2h，用脫色液脫色，直至背景清晰。(10)實驗結(jié)果凝膠掃描。3\操作步驟①將膠置于150ml40％甲醇－10％冰醋酸中浸泡，搖動固定過夜。②取出膠，置于120ml10％甲醇-5％冰醋酸中浸泡，搖動固定30min。③用去離子水將膠浸泡、漂洗，第一、二次，每次間隔20min。④去離子水搖動漂洗，第三、四次，每次間隔30min換水一次。⑤傾出去離子