臨床試驗(yàn)工作小結(jié)課件

產(chǎn)品臨床試驗(yàn)工作小結(jié)技術(shù)支持劉遠(yuǎn)澤《基礎(chǔ)分子生物學(xué)》中的幾個(gè)概念1/分子生物學(xué)（molecularbiology）：（廣義）在分子水平上研究生命現(xiàn)象的科學(xué)。通過研究生物大分子(核酸、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)、功能和生物合成等方面來闡明各種生命現(xiàn)象的本質(zhì)。研究?jī)?nèi)容包括各種生命過程，比如光合作用、發(fā)育的分子機(jī)制、神經(jīng)活動(dòng)的機(jī)理、癌的發(fā)生等。（狹義）范疇偏重于核酸（基因）的分子生物學(xué)，主要研究基因或DNA結(jié)構(gòu)與功能、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和調(diào)節(jié)控制等過程。2/核酸（nucleicacid）：是生物體細(xì)胞內(nèi)一類重要的生物大分子。其主要生物學(xué)功能是作為遺傳信息的載體。核酸以核苷酸（nucleotide）為基本結(jié)構(gòu)單位，通過3’，5’－磷酸二酯鍵形成的鏈狀多聚體。核苷酸由戊糖（核糖）、磷酸、含氮堿基三部分構(gòu)成。核酸分類：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）堿基：嘧啶堿：T、C、U嘌呤堿：A、G核糖：D-2-脫氧核糖（D-2-deoxyribose）D-核糖（D-ribose）3/染色體的組裝（真核生物）4/染色體組一、工作前的計(jì)劃與準(zhǔn)備

種類與數(shù)量試驗(yàn)用品的準(zhǔn)備：1、試劑盒：

基因型檢測(cè)試劑盒：反應(yīng)液/反應(yīng)酶/質(zhì)控品

血液基因組DNA提取試劑盒2、耗材：

移液器（槍）：1000ul/200ul/50ul/10ul/2ul（白色長(zhǎng)尖）

吸頭（槍尖）：20ul（白色長(zhǎng)尖）/200ul（黃色）/1000ul（藍(lán)色）

吸頭盒（三種規(guī)格）

熒光PCR管（長(zhǎng)且不透明、8聯(lián)排）和蓋子Eppendrof管（1.5ml）

多空板（96孔/60孔）、樣本儲(chǔ)存盒（72孔）、Marker

筆、手套3、樣本信息對(duì)照表二、試驗(yàn)樣本準(zhǔn)備：人全血基因組DNA提取

節(jié)奏與程度提取前的檢查與準(zhǔn)備：

1、檢查試劑盒各溶液，若產(chǎn)生沉淀，須在室溫放置一段時(shí)間，必要時(shí)可在37℃

水浴預(yù)熱；2、依據(jù)提取步驟，為溶液編號(hào)；3、緩沖液GD和漂洗液PW

需加入適量無水乙醇；

4、剪去吸附柱的蓋子提取步驟：

1、第二次加入細(xì)胞裂解液CL（裂解紅細(xì)胞）時(shí)，需要?jiǎng)×艺袷?，以充分混勻沉淀（可見管中液體深紅，并有較多泡沫，管底無結(jié)塊沉淀）；

2、加入緩沖液GB后，充分顛倒混勻（如不充分，可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般37℃放置時(shí)會(huì)消失，不影響后續(xù)試驗(yàn)）；

3、56℃水浴時(shí)間延長(zhǎng)至30~40min，其間顛倒混勻數(shù)次，觀察溶液是否變得清亮，并為收集管編號(hào)（如未變清亮，說明細(xì)胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少、純度不加，直接影響熒光檢測(cè)）；

4、水浴后加入200ul無水乙醇，出現(xiàn)絮狀沉淀，輕柔顛倒混勻（此時(shí)DNA析出，故自此步驟開始，顛倒要輕柔緩慢，否則破壞DNA結(jié)構(gòu)）；

5、最后向吸附膜中間位置懸空滴加100ul超純水。RT-PCR反應(yīng)體系的分裝與加樣：1、移液器的“連續(xù)吸放液”—調(diào)移液器量程至23ul，將排放按鈕按至第一停點(diǎn)（第一檔），再將吸頭垂直浸入液面，平穩(wěn)松開按鈕，在液面之下，再次將排放按鈕按至第一檔，排出吸頭尖端的氣泡后，松開按鈕，吸入液體，之后放液只需按至第一檔即是23ul（如吸頭尖端仍有氣泡，可反復(fù)吸放，直至排凈氣泡）；

2、樣本放置順序、吸頭安裝順序、試驗(yàn)者感知順序三者形成“校正機(jī)制”，保障順序加樣（校正機(jī)制的建立，有助于連貫而正確地加樣）；3、移液器的吸放液要“慢吸快放”，且試驗(yàn)者要觀察吸頭尖端，進(jìn)行視覺“校正”，避免吸空放空；4、放液時(shí)，吸頭先伸入液面以下放出液體，再在管壁處打凈殘液（如吸頭仍存殘液，將移液器按至第二檔，將殘液打至吸頭尖端處，拔掉吸頭，并再次安裝回去，將殘液打回管中）；5、不能直接用手觸摸PCR管，因?yàn)槿说氖稚虾袩晒馑?，沾染在管壁上的熒光素?huì)影響熒光儀檢測(cè)。操作時(shí)必須戴不含熒光物質(zhì)的一次性手套并且要經(jīng)常更換（應(yīng)使用鑷子夾取管子和管蓋）；6、吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；7、加樣完成后，蓋緊蓋子，并離心；8、超凈工作臺(tái)使用后，用次氯酸鈉擦拭，避免試驗(yàn)環(huán)境污染；結(jié)果分析：分析的思路：1、基線和閾值的選擇和設(shè)置是否正確（直接與Ct值相關(guān)）；2、陽性和空白對(duì)照的結(jié)果是否正常（既可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性，空白對(duì)照的污染將導(dǎo)致結(jié)果失信。如空白對(duì)照