流感相關(guān)知識與實驗室檢測

一、流感病毒的生物學(xué)特征流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流感病毒分為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常以流行形式出現(xiàn)，引起世界性大流行，在動物中廣泛分布，并也能在動物中引起流感流行和造成動物大量死亡。乙型流感病毒常引起流感局部暴發(fā)，不能引起世界性大流行，也沒有在動物中存在的證據(jù)。丙型流感病毒主要以散在形式出現(xiàn)，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流行。第一頁，共25頁。第二頁，共25頁。流感病毒屬于正粘病毒科，病毒顆粒多形態(tài)或球形，直徑80～120nm，絲狀體可達(dá)數(shù)微米。病毒的毒粒結(jié)構(gòu)可分為三層：最外層為雙層類脂囊膜，膜上覆蓋著血凝素（H）、神經(jīng)氨酸酶（N）、M2蛋白。囊膜上的突起，一種像三角形、細(xì)長的、能凝集紅細(xì)胞的稱血凝素（H），另一種像蘑菇樣、能使病毒顆粒從吸附的紅細(xì)胞表面釋放下來的叫神經(jīng)氨酸酶（N）。中間層為球形蛋白殼，是由基質(zhì)（M1）蛋白形成的，有一個或若干個分子厚。里層為核殼體，呈螺旋對稱，直徑9～15nm，包含核蛋白（NP），三種多聚酶蛋白（PB1，PB2，PA），病毒單鏈的RNA.第三頁，共25頁。第四頁，共25頁。病毒是專性活細(xì)胞內(nèi)寄生物，不能單獨進(jìn)行繁殖，必須在活細(xì)胞內(nèi)才能繁殖。整個復(fù)制周期概括起來分為：吸附，侵入，脫殼，生物合成，裝配與釋放等5個步驟。第五頁，共25頁。第六頁，共25頁。流感在流行病學(xué)上最顯著的特點為：突然爆發(fā)，迅速蔓延，波及面廣，具有一定的季節(jié)性，發(fā)病率高，死亡率低，多發(fā)于青少年，一般不留后遺癥，每次流行后在人群中總要造成不同程度的超額死亡，死亡者多為年邁體衰或有慢性疾病的患者。流感經(jīng)呼吸道飛沫傳播，潛伏期短，一般為1～3天。人對流感病毒普遍易感。病人是流感的主要傳染源，隱性感染者因不易被人察覺，可自由活動，也易向周圍人群傳播病毒。第七頁，共25頁。一般來講，流感病毒對熱敏感，56℃30min被滅活。4℃～-40℃條件下不穩(wěn)定，-70℃以下或冷凍干燥后置4℃可長期保存。流感病毒最適PH值7.0～8.0。流感病毒能被紫外線滅活，對乙醚、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑、氧化劑、鹵素化合物、重金屬、去污劑等均敏感。人流感病毒只感染呼吸道表面粘膜上皮細(xì)胞，并在這些細(xì)胞中繁殖。如果把活流感病毒注入易感者皮下或肌肉內(nèi)，病毒不能繁殖，但可引起高熱頭痛、白細(xì)胞減少等癥狀。第八頁，共25頁。二、流感監(jiān)測的意義流感為第一個實行全球性監(jiān)測的傳染病，目前已有80多個國家、110余個國家/地區(qū)流感中心組成了全球性流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)。流感實驗室監(jiān)測最主要的目的是及時發(fā)現(xiàn)并抓到有意義的新變異株，尤其大流行株，提供給診斷試劑制備和疫苗生產(chǎn)；準(zhǔn)備做好流感疫情預(yù)報。自人流感病毒被發(fā)現(xiàn)以來，人甲型流感病毒出現(xiàn)過四個亞型均首發(fā)于我國。1968年以來所出現(xiàn)的新變異株絕大多數(shù)也首發(fā)于我國。因此我國流感動態(tài)已引起WHO和世界各國的關(guān)注，甚至有人提示我國的南方是世界流感流行的中心。第九頁，共25頁。三、流感監(jiān)測的方法流感病毒在我國的活動規(guī)律南北存在明顯的差異。長江以南地區(qū)，流感活動季節(jié)性不太強(qiáng)，每年有兩個活動峰，一個在冬春季，另一個在夏季；長江以北地區(qū)具有較嚴(yán)格的季節(jié)性，每年只有一個冬春季高峰。在遼寧省，流感監(jiān)測方案規(guī)定流行周每周至少采集10—15份，非流行周每周至少采集5—10份，流行季節(jié)（每年10月至次年3月）至少采集120份。第十頁，共25頁。流感樣病例定義：體溫≥38℃，伴有咳嗽或咽喉痛、全身痛等癥狀的急性呼吸道傳染病病例。流感監(jiān)測對象為發(fā)病三天之內(nèi)的流感樣病例，監(jiān)測時采集的標(biāo)本一般為咽拭子、鼻拭子或含漱液。當(dāng)有流感暴發(fā)疫情時，應(yīng)盡量收集典型病例的鼻咽拭子、含漱液、血清、抽吸液等標(biāo)本。標(biāo)本應(yīng)在4℃保存24小時內(nèi)送至實驗室，實驗室對收到的標(biāo)本最好24～48小時內(nèi)進(jìn)行接種。第十一頁，共25頁。四、流感病毒實驗室分離1、MDCK細(xì)胞傳代技術(shù)2、流感病毒接種技術(shù)3、血凝實驗第十二頁，共25頁。1、MDCK細(xì)胞傳代技術(shù)把需用的溶液置室溫或37℃恒溫箱預(yù)溫；把已長成片的MDCK細(xì)胞生長液倒掉；把Versene與0.25%胰酶按7：1～5：1的比例配制成消化液，每瓶細(xì)胞加入適量的消化液，置37℃恒溫箱中消化，此期間要經(jīng)常在倒置顯微鏡下觀察。第十三頁，共25頁。當(dāng)細(xì)胞變圓，細(xì)胞與細(xì)胞間互不相連，表明消化時間已到。倒掉消化液，每瓶加入適量的細(xì)胞生長液，用毛細(xì)吸管將細(xì)胞輕輕吹下吹散。加入適量細(xì)胞生長液，混勻。分裝并留下原瓶。將分裝好的細(xì)胞瓶放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)，約3～7天可長成片。長成片的細(xì)胞即可進(jìn)行病毒接種。第十四頁，共25頁。第十五頁，共25頁。細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的一些問題：1、消化時間過長。胰酶濃度過低或保存時間過長。2、細(xì)胞的保存問題。3、溫度的問題。溫度增加2—3℃對細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，使之在24小時之內(nèi)死亡。低溫對細(xì)胞影響小。4、污染的問題。預(yù)防和避免污染是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。第十六頁，共25頁。污染的預(yù)防添加抗生素實驗時使用的器具用品消毒滅菌操作者嚴(yán)格遵守操作規(guī)程定期更換實驗室及生物安全柜的濾膜發(fā)生污染后對實驗室進(jìn)行徹底消毒第十七頁，共25頁。2、流感病毒接種技術(shù)接種前先將標(biāo)本管內(nèi)的棉簽取出，用小鑷子摘下棉簽頭，在管內(nèi)反復(fù)擠壓后棄去。向標(biāo)本管內(nèi)加入抗生素放4℃2小時。目的：抑制細(xì)菌生長。將長成片的細(xì)胞棄去細(xì)胞生長液，用Hank′s液洗2遍，加入標(biāo)本0.5～1ml，放33～35℃恒溫箱內(nèi)2小時。目的：使病毒吸附在細(xì)胞上。第十八頁，共25頁。棄去標(biāo)本液，用Hank′s液洗2遍，加入2倍于細(xì)胞生長液的病毒維持液，放33～35℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。目的：使病毒在細(xì)胞內(nèi)繁殖。逐日觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)有75～100%的細(xì)胞發(fā)生病變即可收獲病毒。細(xì)胞病變形態(tài)包括拉絲、脫落、圓縮等。7日仍未發(fā)生病變的視為陰性。盲傳一代，仍為陰性的可報告為陰性。第十九頁，共25頁。第二十頁，共25頁。第二十一頁，共25頁。3、血凝實驗第一孔加入100μl病毒液，其下各孔均加入50μl生理鹽水；由第一孔開始做倍比稀釋，最后一孔棄去50μl液體；每孔內(nèi)加入50μl1%血球，混勻；室溫靜置30～60分鐘觀察結(jié)果。以生理鹽水做陰性對照。第二十二頁，共25頁。血球均勻凝集