第三章基因工程的酶學基礎演示文稿

第三章基因工程的酶學基礎演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有117頁\編輯于星期五優(yōu)選第三章基因工程的酶學基礎現(xiàn)在是2頁\一共有117頁\編輯于星期五一、限制性核酸內(nèi)切酶

（restrictionendonuclease）這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核苷酸內(nèi)切酶現(xiàn)在是3頁\一共有117頁\編輯于星期五１．寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象

人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙，即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）細菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉現(xiàn)在是4頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是5頁\一共有117頁\編輯于星期五R/M體系：

寄主是由兩種酶活性配合完成的一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶現(xiàn)在是6頁\一共有117頁\編輯于星期五E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當λ(k)噬菌體侵染E.coliB時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。現(xiàn)在是7頁\一共有117頁\編輯于星期五

R/M體系的作用：保護自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解現(xiàn)在是8頁\一共有117頁\編輯于星期五限制性內(nèi)切酶本是微生物細胞中用于專門水解外源DNA的一類酶，其功能是避免外源DNA的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制。由于R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。根據(jù)酶的功能、大小和反應條件，及切割DNA的特點，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶２．限制性內(nèi)切酶的分類現(xiàn)在是9頁\一共有117頁\編輯于星期五Ⅰ型酶：

1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分離出的核酸內(nèi)切酶。分子量較大，反應需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識別位點但沒有特異的切割位點，而且切割是隨機的，所以在基因工程中應用不大。現(xiàn)在是10頁\一共有117頁\編輯于星期五Ⅲ型酶

這類酶可識別特定堿基順序，并在這一順序的3’端24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點也是沒有特異性的。

現(xiàn)在是11頁\一共有117頁\編輯于星期五Ⅱ型酶

1970年，和在流感嗜血Rd株中分離出來的限制酶。分子量較?。?05Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應只需Mg++的存在，并且具有以下兩個特點，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應用。識別位點是一個回文對稱結構，并且切割位點也在這一回文對稱結構上。許多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重組。

現(xiàn)在是12頁\一共有117頁\編輯于星期五主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結構異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMMg2+Mg2+SAMATP識別序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋轉(zhuǎn)對稱序列GAGCCCAGCAG切割位點距距識別序列1kb處隨機性切割識別序列內(nèi)或附近特異性切割識別序列下游24--26bp處現(xiàn)在是13頁\一共有117頁\編輯于星期五

第一個字母：大寫，表示所來自的微生物屬名的第一個字母

第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母

其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號

羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號

3.限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：例：

EcoRI:來自于Escheria

coli

RY13

的第一個限制酶

現(xiàn)在是14頁\一共有117頁\編輯于星期五同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶Haemophilusinfluenzaed屬名種名株名嗜血流感桿菌d株HindIIHindIII1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII現(xiàn)在是15頁\一共有117頁\編輯于星期五4．限制酶的特性a.限制酶識別靶序列同DNA的來源無關；b.限制酶識別靶序列是唯一的（對某種限制酶只具一個限制位點的質(zhì)粒）?，F(xiàn)在是16頁\一共有117頁\編輯于星期五二、Ⅱ型酶現(xiàn)在是17頁\一共有117頁\編輯于星期五1.II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性

識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列，大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側，識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結構EcoRI的切割位點EcoRI的識別序列5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’現(xiàn)在是18頁\一共有117頁\編輯于星期五5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’退火4-7℃

OH

P5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’POHEcoRI37℃現(xiàn)在是19頁\一共有117頁\編輯于星期五PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃退火4-7℃OHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’POH現(xiàn)在是20頁\一共有117頁\編輯于星期五PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃現(xiàn)在是21頁\一共有117頁\編輯于星期五2.核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式

（1）粘性末端：兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是圍繞著一個對稱結構中心，這樣形式的斷裂結果形成具有粘性末端的DNA片斷。

現(xiàn)在是22頁\一共有117頁\編輯于星期五GGATCCCCTAGGGCCTAGGGATCCG+現(xiàn)在是23頁\一共有117頁\編輯于星期五5′-端突出粘性末端

3′-端突出5′AATTC

3′Ｇ

5′Ｇ

3′ACGTC現(xiàn)在是24頁\一共有117頁\編輯于星期五（2）平末端兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。

現(xiàn)在是25頁\一共有117頁\編輯于星期五HindGTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG+現(xiàn)在是26頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是27頁\一共有117頁\編輯于星期五3．同裂酶（isoschizomers)

指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶，同裂酶進行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。Example:

限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對同裂酶(CCGG)，當靶序列中有一個5-甲基胞嘧啶時HpaⅡ不能進行切割，而MspⅠ可以?，F(xiàn)在是28頁\一共有117頁\編輯于星期五4．同尾酶（isocaudamer）指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。現(xiàn)在是29頁\一共有117頁\編輯于星期五

雜種位點（hybridsite）由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價結合形成的位點。一般不能被原來的任何一種同尾酶識別。

BamHⅠG

GATCCBclⅠT

GATC

A

C

CTAG

G

A

CTAG

T

雜種位點：T

GATC

C（BamHⅠ）

（BclⅠ）

ACTAG

G

現(xiàn)在是30頁\一共有117頁\編輯于星期五5．限制片斷的末端連接作用

（１）分子間的連接：不同的DNA片斷通過互補的粘性末端之間的堿基配對而彼此連接起來?，F(xiàn)在是31頁\一共有117頁\編輯于星期五（2）分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個互補末端之間的堿基配對而形成的環(huán)形分子現(xiàn)在是32頁\一共有117頁\編輯于星期五6.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應的操作大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應條件Tris--HCl50mMpH7.5MgCl210mM0-50mM低鹽酶NaCl0-150mM100mM中鹽酶DTT1mM150mM高鹽酶Volume20-100μlT37℃1-1.5h1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應1小時，完全水解1μg標準DNA所需的酶量現(xiàn)在是33頁\一共有117頁\編輯于星期五對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應注意：

BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：5‘…GCTACATGGATTCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’現(xiàn)在是34頁\一共有117頁\編輯于星期五II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：

使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解低鹽酶先切，然后補加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥現(xiàn)在是35頁\一共有117頁\編輯于星期五6．影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：（１）DNA的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTTA、SDS、NaCl等DNase的污染(Mg++)

a.增加核酸內(nèi)切限制酶的用量；

b.擴大酶催化反應的體系（稀釋）；

c.延長酶催化反應的保溫時間。

d.加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當?shù)臏囟痊F(xiàn)在是36頁\一共有117頁\編輯于星期五（2）DNA的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC’3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG’3或5‘CCTGG’3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5‘CG’3序列中的C5位上引入甲基現(xiàn)在是37頁\一共有117頁\編輯于星期五

高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象。

EcoRI在正常條件下識別并切割5‘GAATTC’3序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5‘PuPuATTPyPy3’或者5‘AATT’3（3）核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)嘧啶堿基T/C嘌呤堿基A/G現(xiàn)在是38頁\一共有117頁\編輯于星期五（4）酶切消化反應的溫度：

大多數(shù)酶的標準反應溫度37度（5）DNA的分子結構：

某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)?；虿《綝NA所需要的酶量要比消化線性的DNA高29倍現(xiàn)在是39頁\一共有117頁\編輯于星期五7．核酸內(nèi)切限制酶標準的緩沖液（1）.氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀：

不正確的NaCl或Mg++濃度，會降低限制酶的活性，還可能導致識別序列的改變

（2）.Tris-HCl：

維持最適的pH值（pH＝7.4）（3）.β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）：

維持酶的穩(wěn)定性（4）.牛血清蛋白（BSA）：維持酶的穩(wěn)定性現(xiàn)在是40頁\一共有117頁\編輯于星期五8．核酸內(nèi)切限制酶對DNA的消化作用（1）核酸內(nèi)切限制酶以同型二聚體形式與靶序列發(fā)生作用（2）核酸內(nèi)切限制酶對DNA的局部消化完全的酶切消化：識別序列n個堿基的核酸內(nèi)切限制酶，對DNA的切割能達到每隔4n切割一次的水平現(xiàn)在是41頁\一共有117頁\編輯于星期五（3）核酸內(nèi)切限制酶對真核生物基因組的消化作用小分子量的片斷-----少（電泳-容易分離目的片斷）大分子量的片斷-----多（基因文庫）

現(xiàn)在是42頁\一共有117頁\編輯于星期五1．ＤＮＡ連接酶2．體外連接1．ＤＮＡ連接酶2．體外連接現(xiàn)在是43頁\一共有117頁\編輯于星期五1.1ＤＮＡ連接酶的作用機理

能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。現(xiàn)在是44頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是45頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是46頁\一共有117頁\編輯于星期五

酶－－AMP（腺苷－磷酸）磷酸酰胺鍵DNA的腺苷酸復合物3’-OH對P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機理此反應是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費兩個高能磷酸鍵（賴氨酸殘基）現(xiàn)在是47頁\一共有117頁\編輯于星期五

1.2連接酶的來源

.DNA連接酶：大腸桿菌染色體編碼的

.T4DNA連接酶：大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的

DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP現(xiàn)在是48頁\一共有117頁\編輯于星期五Ｔ４ＤＮＡ連接酶（DNAligase）

該酶常從Ｔ４噬菌體的受體細胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結合起來

DNA連接酶對具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對平末端的DNA分子也可以進行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量?，F(xiàn)在是49頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是50頁\一共有117頁\編輯于星期五

1.3影響連接酶作用的因素（1）反應溫度：連接缺口的溫度：37度

連接粘性末端的最佳溫度：4～15度（2）Ｔ４ＤＮＡ連接酶的用量：

平末端DNA分子的連接反應中，最適1～2個單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個單位。

ATP的用量10μmol～1mmol/L之間（3）提高外源片斷與載體的濃度的比值，（10～20倍）現(xiàn)在是51頁\一共有117頁\編輯于星期五2.體外連接現(xiàn)在是52頁\一共有117頁\編輯于星期五體外連接的三種方式a.

用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片斷b.用T4DNA連接酶將平末端的DNA片斷連接；或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片斷加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用DNA連接酶連接。c.先在DNA片斷末端加上化學合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用DNA連接酶連接

現(xiàn)在是53頁\一共有117頁\編輯于星期五2.1粘性末端DAN片斷的連接

由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連，對載體的5’末端進行處理，用細菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團，使載體不能自連。而外源片斷的5’-P能與載體的3’-OH進行共價鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個連接位點中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5’-P的鏈不能進行連接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

現(xiàn)在是54頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是55頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是56頁\一共有117頁\編輯于星期五2.2平末端DNA片斷的連接

（1）T4DNA連接酶（2)用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法現(xiàn)在是57頁\一共有117頁\編輯于星期五

同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B分別中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10～40個堿基現(xiàn)在是58頁\一共有117頁\編輯于星期五

同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無法用原來的限制酶作特異性的切割，對獲得插入片斷進行進一步的研究。

現(xiàn)在是59頁\一共有117頁\編輯于星期五銜接物連接法

平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個核苷酸，其結構特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點的回文結構。如：

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點

HpaIIHpaIIBamHI

或Sau3A現(xiàn)在是60頁\一共有117頁\編輯于星期五

銜接物（linker）：是指用化學方法合成的一段由10～12個核苷酸組成、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。

現(xiàn)在是61頁\一共有117頁\編輯于星期五銜接物連接法現(xiàn)在是62頁\一共有117頁\編輯于星期五雙銜接物：可以實現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時對克隆片斷的再刪除也比較方便?，F(xiàn)在是63頁\一共有117頁\編輯于星期五雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成第二鏈加入SalI銜接物SI核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補齊，加入第二銜接物EcolI現(xiàn)在是64頁\一共有117頁\編輯于星期五

在用DNA銜接物連接法時，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把克隆的基因切斷?，F(xiàn)在是65頁\一共有117頁\編輯于星期五（４）DNA接頭（adapter）連接法：

1978年，美國康奈爾大學生化分子生物學系的教授吳瑞博士發(fā)明的。它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。粘性末端容易通過堿基配對形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對DNA接頭分子末端，進行必要的修飾。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子?，F(xiàn)在是66頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是67頁\一共有117頁\編輯于星期五DNA接頭連接法現(xiàn)在是68頁\一共有117頁\編輯于星期五（５）熱穩(wěn)定的連接從嗜熱高溫方線菌的菌株中分離出來的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶?？擅黠@的降低形成非特異性連接產(chǎn)物的幾率，在85度下具有酶活性。重復升溫94度之后仍具有酶活性。

現(xiàn)在是69頁\一共有117頁\編輯于星期五寡核苷酸連接測定（oligonucletideligationassay,OLA）用兩個寡核苷酸探針，同已知序列的靶DNA雜交，探針在靶DNA分子的位置是相鄰的。

探針長度是20～25bp連接酶鏈式反應（lingasechainreaction,LCR）連接擴增反應（lingaseamplicationreaction）用寡核苷酸探針通過DNA連接酶的作用擴增已知序列的靶DNA的方法。需要4種引物。

現(xiàn)在是70頁\一共有117頁\編輯于星期五寡核苷酸連接測定

AGTGACCTTCACTGGA

AGTGACCTAGT

T

ACCTTCACTGGATCACTGGA

AGTGACCTACCTAGTGACCTACCT

待擴增的DNA片斷PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP陽性信號無信號鏈霉抗生素蛋白由于堿基錯配不能形成磷酸二酯鍵檢測單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性堿性磷酸酶堿性磷酸酶底物現(xiàn)在是71頁\一共有117頁\編輯于星期五LCR：ligasechainreaction，連接酶鏈式反應。樣品DNA、探針(4)94度變性、NAD55度退火現(xiàn)在是72頁\一共有117頁\編輯于星期五三、DNA聚合酶現(xiàn)在是73頁\一共有117頁\編輯于星期五

常用的DNA聚合酶：

大腸桿菌DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片斷酶、

T4DNA聚合酶、

T7DNA聚合酶、

反轉(zhuǎn)錄酶等。現(xiàn)在是74頁\一共有117頁\編輯于星期五共同點：

把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況?，F(xiàn)在是75頁\一共有117頁\編輯于星期五1.大腸桿菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、

DNA聚合酶（Pol）、

DNA聚合酶（Pol）、

PolＩ和Pol的主要功能參與DNA的合成；

Pol的功能同DNA的復制有關；

PolＩ同DNA分子克隆的關系最為密切。現(xiàn)在是76頁\一共有117頁\編輯于星期五1.1大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ：

1957年，美國的生物學家A.Kornberg首次證實，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為109103dal。

DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個片斷，一個具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’的聚合酶活性，另一個具有全部5’3’的外切酶活性?，F(xiàn)在是77頁\一共有117頁\編輯于星期五

DNA聚合酶Ｉ的酶活性：1.5’3’的聚合酶活性；2.5’3’的外切酶活性；3.3’5’的外切酶活性（較低）。現(xiàn)在是78頁\一共有117頁\編輯于星期五

1.2DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：

1、底物：四種脫氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；

2、Mg＋＋離子；

3、帶有3’-OH游離基團的引物鏈；

4、DNA模板：單鏈，雙鏈（糖-磷酸主鍵上有一個或多個斷裂）。

現(xiàn)在是79頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是80頁\一共有117頁\編輯于星期五

PolＩ現(xiàn)在是81頁\一共有117頁\編輯于星期五

1.3DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性

1、5’3’的外切酶活性，所切割的DNA鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；

2、切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距5’末端數(shù)個核苷酸遠的一個鍵上發(fā)生；

3、DNA的合成可以增強5’3’的核酸外切酶活性；

4、5’3’核酸外切酶的活性位點同聚合作用的活性位點以及3’5’的水解作用位點是分開的?，F(xiàn)在是82頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是83頁\一共有117頁\編輯于星期五

1.4DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性

能催化DNA鏈發(fā)生水解作用，從DNA鏈3’-OH末端開始向5’的方向水解DNA，并釋放出單核苷酸分子。

對酶活的影響：

反應物中缺乏dNTPs時，大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，將會發(fā)揮作用。但對于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時，這種降解活性將會被5’3’的聚合酶活性所抑制。

現(xiàn)在是84頁\一共有117頁\編輯于星期五

現(xiàn)在是85頁\一共有117頁\編輯于星期五

1.5DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：

通過DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標記的DNA探針

DNA缺口轉(zhuǎn)移（nicktranslation）

在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發(fā)生。當外切酶活性從缺口的5’一側移去一個5’核苷酸之后，聚合酶作用就會在缺口的3’一側補上一個新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之間形成一個鍵，隨著5’一側的核苷酸不斷移去，3’一側的核苷酸又按序列增補，缺口便沿著DNA分子合成的方向移動

現(xiàn)在是86頁\一共有117頁\編輯于星期五

DNA雜交探針的制備

典型的反應體系是。在25μl總體積中含有1μg純化的特定DNA片斷，并加入適量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標記的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的斷裂或缺口；

PolＩ

：進行缺口轉(zhuǎn)移，使反應混合物中的32p標記的核苷酸取代原有的未標記的核苷酸，最終從頭到尾都被標記?，F(xiàn)在是87頁\一共有117頁\編輯于星期五

dNTP對PolＩ酶活性的影響

在低濃度dNTPs的條件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs濃度時，PolＩ則能夠更有效的合成DNA。低濃度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高濃度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs參入DNA鏈（DnaseＩ數(shù)量）。

現(xiàn)在是88頁\一共有117頁\編輯于星期五2.Klenow片斷與DNA末端標記

Klenow片斷：是由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來的分子量為761000dal的大片斷分子。仍具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性，失去了全酶的5’3’外切酶活性。

現(xiàn)在是89頁\一共有117頁\編輯于星期五2.1Klenow片斷的主要用途：（1

）、修補經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’隱蔽末端；（2）、標記DNA片斷的末端；（3）、cDNA克隆的第二鏈cDNA的合成；（4）、DNA序列的測定?，F(xiàn)在是90頁\一共有117頁\編輯于星期五

2.2DNA片斷末端標記：

具有3’隱蔽末端的帶標記得的DNA片斷

5’GATCT…3’3’A…5’在反應物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP,一道溫育后生成：

5’GATCT…3’

3’32pGA…5’

或是同時加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’32p

AGA…5’現(xiàn)在是91頁\一共有117頁\編輯于星期五

DNA片斷末端標記可以作為用凝膠電泳法測定分子大小的標記樣品。因為被標記的DNA片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無關。所以在限制酶消化過程產(chǎn)生的大小DNA片斷都得到了同等程度的標記。不能夠有效的標記帶有5’突出末端的DNA分子現(xiàn)在是92頁\一共有117頁\編輯于星期五

3.T4DNA聚合酶和取代合成法標記DNA片斷

1）從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA聚合酶。具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性。2）在沒有脫氧核苷三磷酸存在的情況下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的獨特功能。作用于雙鏈DNA片斷，并按3’5’的方向從3’-OH末端開始降解DNA。如果反應物中存在一種dNTP時，它的水解作用進行到暴露出同反應物中唯一的dNTP互補的核苷酸時就會停止。3）在反應過程中，通過T4DNA聚合作用，反應物中的α-32p-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片斷上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。

現(xiàn)在是93頁\一共有117頁\編輯于星期五

外切酶活性

聚合酶活性

無dNTPdNTP現(xiàn)在是94頁\一共有117頁\編輯于星期五取代合成法優(yōu)于缺口轉(zhuǎn)移法：

（1

）、不會出現(xiàn)發(fā)夾結構而缺口轉(zhuǎn)移制備的探針會出現(xiàn)這種結構；（2）、應用適宜的核酸內(nèi)切限制酶切割，便可很容易的變成特定序列的探針。現(xiàn)在是95頁\一共有117頁\編輯于星期五具EcoR1位點的DNA分子對DNA分子3‘端有控制的降解合成作用產(chǎn)生選擇性標記T4DNA聚合酶的取代合成法標記DNA斷末端及制備鏈的特異探針現(xiàn)在是96頁\一共有117頁\編輯于星期五４、反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成DNA。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。

具有反轉(zhuǎn)錄酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA為模板合成cDNA；用來對5’突出末端的DNA片斷作末端標記?，F(xiàn)在是97頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是98頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是99頁\一共有117頁\編輯于星期五

合成cDNA的主要步驟：（1

）、應用poly(A)mRNA為模板，以12～18個堿基長的oligo(dT)片斷作為引物，加入反轉(zhuǎn)錄酶，合成出cDNA第一鏈;（2）、用堿水解法除去mRNA模板，單鏈cDNA能自我折疊形成一種發(fā)夾結構，作第二鏈的引物，用反轉(zhuǎn)錄酶或Klenow聚合酶催化第二鏈cDNA的合成；（3）、用SＩ核酸內(nèi)切酶消化除去單鏈區(qū)的發(fā)夾結構。（4）、通過同聚物或合成的銜接物，使DNA分子克隆到適當?shù)妮d體分子上。現(xiàn)在是100頁\一共有117頁\編輯于星期五現(xiàn)在是101頁\一共有117頁\編輯于星期五5.T7DNA聚合酶：

1978年，S.Tabor從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細胞中純化出來的一種核酸酶。具有5’3’的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3’5’核酸外切酶活性?，F(xiàn)在是102頁\一共有117頁\編輯于星期五

T7DNA聚合酶的用途：（1）、用于對大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二級結構的影響，聚合能力較強可延伸合成數(shù)千個核苷酸）（2）、通過延伸或取代合成法標記DNA3’末端（3）、將雙鏈DNA的5’或3’突出末端轉(zhuǎn)變成平末端的結構。現(xiàn)在是103頁\一共有117頁\編輯于星期五6.修飾的T7DNA聚合酶對天然的T7DNA聚合酶進行修飾，使之完全失去3’5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍?，F(xiàn)在是104頁\一共有117頁\編輯于星期五

用途：（1）、作為一種DNA序列分析的工具酶：加工性能高；無3’5’的外切酶活性；具有催化脫氧核糖類似物聚合的能力。（2）、制備探針；可催化較低水平的dNTP

（<0.1μmol/L）參入。（3）、有效的填補和標記具有5’突出末端的DNA片斷的3’-末端。聚合作用高；失去了3