微透析-液相色譜-化學發(fā)光聯用微透析技術應用于中藥藥動學研究(張群林)

匯報內容一個人簡歷二化學發(fā)光技術三液相色譜—化學發(fā)光聯用技術四微透析在體采樣技術五丹參藥動學研究第一頁，共67頁。個人簡歷1992.9-1996.6沈陽藥科大學中藥系1996.7-2000.8安徽省藥物研究所中藥新藥研發(fā)2000.9-2005.6中國科學技術大學獲分析化學博士學位（導師：崔華教授）2005.7“安徽醫(yī)科大學引進人才”2005.7－現在藥學院藥物分析教研室2006.8任副教授、碩士生導師、中青年學術帶頭人

2009.7任教研室主任第二頁，共67頁?；瘜W發(fā)光[1]作為一種自然現象很早就為人類所注意1877年，Radziszewski[2]

證實在乙醇－KOH溶液中洛粉堿(Lophine,2,4,5-三苯基咪唑)被H2O2等氧化發(fā)出綠光十九世紀末期，德國科學家Wiedemann[3]首次解釋了化學發(fā)光的機制[1]B.T.P.Whitehead,L.J.Kricka,et.al.Clin.Chem.25(1979)1531.[2]B.Radziszewski,Chem.Ber.10(1877)70.[3]E.Wiedemann,Ann.Phys.Chem.34(1888)446.化學發(fā)光現象是一種相對簡單的有機反應過程化學發(fā)光(Chemiluminescence,CL)第三頁，共67頁。[4]R.Dubois,Acad.Sci.132(1901)431.[5]K.vanDyke,F.McCapra,I.Behesti,BioluminescneceandChemiluminescence,InstrumentsandApplications.Vol1.FL:CRCPress,1985.[6]K.Gleu,Z.Petsch.Angew.Chem.48(1935)57.1901年，法國生物學家Dubois[4]引入了熒光素(Luciferin)和熒光素酶(Luciferase)

的概念1902年，Schmitz合成發(fā)光試劑魯米諾(Luminol),它曾被廣泛用于血跡鑒定；1928年,Albrecht觀察到魯米諾在堿性介質中的化學發(fā)光行為[5]

1935年,Gleu和Petsch[6]報道了光澤精(Lucigenin)與H2O2反應產生化學發(fā)光

這些發(fā)光試劑的合成，對于化學發(fā)光發(fā)展為分析化學的一種重要手段起到了非常重要的作用化學發(fā)光(CL)的發(fā)展歷史第四頁，共67頁。由于大多數化學發(fā)光非常微弱，且稍縱即逝，早期的化學發(fā)光研究主要集中在對化學發(fā)光反應現象的觀察和反應機理的探討上，其發(fā)展一直比較緩慢。

1945年出現了光電倍增管，1950年出現了商品化的化學發(fā)光檢測裝置到了八十年代，隨著生命科學、環(huán)境科學和材料科學的興起，化學發(fā)光才被真正應用于分析化學并迅速得到了發(fā)展目前，化學發(fā)光分析的研究和應用已成為當前微量和痕量分析領域一個十分重要的研究方法化學發(fā)光(CL)的發(fā)展歷史第五頁，共67頁?；瘜W發(fā)光(CL)的優(yōu)點1.靈敏度極高

熒光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化學發(fā)光分析，可測定210-17mol/L的ATP，即可檢測出一個細菌中的ATP含量2.線性范圍寬

至少二個數量級以上3.儀器設備簡單

不需要光源、單色器和背景校正4.分析速度快

多數化學發(fā)光反應是快速反應，在瞬間或幾秒即可完成,100samplesh-15.易于自動化

適合與HPLC和HPCE等其它的分離技術聯用，作為其高靈敏度的檢測器

第六頁，共67頁?；瘜W發(fā)光(CL)的基本原理化學反應釋放出的化學能激發(fā)產物分子或體系共存的其它分子，這些分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時產生光輻射的現象。第七頁，共67頁。一.化學反應必須釋放出足夠的能量可以使某種反應產物或中間體到達激發(fā)態(tài)；二.反應歷程必須有利于形成激發(fā)態(tài)產物；三.這種激發(fā)態(tài)物質必須具有一定的發(fā)光量子效率，或者能夠將其能量轉移給共存的某種熒光物質，產生光輻射。

化學發(fā)光(CL)的必須條件第八頁，共67頁?；瘜W發(fā)光(CL)的基本類型直接化學發(fā)光A+B→C*+DC*→C+hυ

間接化學發(fā)光

A+B→C*+DC*+F→C+F*

F*→F+hυ第九頁，共67頁。

化學發(fā)光(CL)的定量原理定量原理：在化學發(fā)光分析中，被分析物相對于發(fā)光試劑小得多，對于一級動力學反應：

dc/dt=Kc定量依據：（1）在一定條件下，峰值光強度與被測物濃度成線性（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強度(S)，其與被測物濃度成線性第十頁，共67頁。

化學發(fā)光(CL)的常見反應體系魯米諾及其衍生物發(fā)光體系吖啶類發(fā)光體系四價鈰發(fā)光體系其它發(fā)光體系第十一頁，共67頁。復雜體系中低含量物質的檢測——分析化學挑戰(zhàn)之一高選擇性和高靈敏度的分析技術化學發(fā)光是高靈敏分析技術，靈敏度可與質譜媲美分布廣泛、療效確切的黃酮，易于發(fā)生氧化還原反應前期工作基礎液相色譜—化學發(fā)光（HPLC-CL）聯用技術分析中藥黃酮成分第十二頁，共67頁。第十三頁，共67頁。ChemiluminescenceProducinglightwithchemicals

化學發(fā)光(Chemiluminescence)技術液相色譜-化學發(fā)光聯用技術

發(fā)光新體系規(guī)律和機理中藥材指紋圖譜（復方）制劑中藥藥動學第十四頁，共67頁。

葛根素注射液中葛根素含量的測定線性范圍:

1.3×10-9-8.0×10-7g/mL檢測限:

8.4×10-10g/mL

R.S.D.:

1.86%(n=11)at5.0×10-8g/mL

首次報道化學發(fā)光法測定葛根素JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2004,36(3):587–592第十五頁，共67頁。草豆蔻中豆蔻明含量的測定線性范圍:

1.0×10-8-8.0×10-6

g/mL檢測限:

1.2×10-9

g/mL

R.S.D.:

1.15%(n=11)at8.0×10-7

g/mL

首次報道化學發(fā)光法測定豆蔻明PhytochemicalAnalysis,2005,16(1-2):440-445.第十六頁，共67頁。中藥沙棘制劑中的三種黃酮含量的測定沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科沙棘屬的植物，主要種植于中國的北方和西南地區(qū)。它是一種傳統(tǒng)的中草藥，很早以前就被人們用于止咳、助消化、促進血液循環(huán)和止痛。沙棘油還可以治療皮膚病和血栓。

30第十七頁，共67頁。圖2槲皮素、山萘酚和異鼠李素標準化合物的DAD(a)和CL(b)檢測色譜圖QU,IS:4.5×10-7gmL-1KA:2.0×10-7gmL-1第十八頁，共67頁。圖3

心達康膠囊(a)和沙棘顆粒(b)樣品中三種黃酮醇的CL檢測色譜圖

JournalofSeparationScience,2005,28(11):1117-1256.第十九頁，共67頁。圖4二十種黃酮和酚類化合物的化學發(fā)光檢測色譜圖首次報道能同時響應化合物種類最多的CL檢測器JournalofChromatographyA2005,1095,94-101.第二十頁，共67頁。第二十一頁，共67頁。黃酮具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等顯著藥理作用，受到國內外醫(yī)藥界的廣泛重視，但其藥動學研究資料的缺乏，制約了黃酮類新藥的研發(fā)與體內作用機制研究生物樣品中痕量黃酮的高通量、高靈敏分析技術是研究藥動學的基本前提中藥藥動學研究所面臨的生物樣本具有藥物含量低（樣品中的中藥成分濃度常在ng/mL水平或以下）、藥物濃度變化范圍大（需要測定的血藥濃度范圍為峰濃度Cmax―1/20Cmax）、干擾組分多且不確定、樣品不易重復獲得等特點

HPLC-CL聯用技術應用于黃酮藥動學研究第二十二頁，共67頁。液相色譜–化學發(fā)光法測定大鼠血漿中

山奈酚濃度及其藥動學研究

第二十三頁，共67頁。研究背景山奈酚的性質藥理作用廣泛，藥動資料缺乏

僅有兩篇報道：家兔灌胃，HPLC-DAD，前處理復雜

大鼠靜注，HPLC-UV，未報道藥動學參數第二十四頁，共67頁。實驗方法HPLC-CL條件的優(yōu)化1.色譜分離條件HPLC-CL條件的

優(yōu)化流動相不增加背景、不熄滅發(fā)光信號；不生成沉淀發(fā)光試劑

混合次序發(fā)光反應試劑的

濃度、試劑流速等2.發(fā)光反應兼容性3.

流路的優(yōu)化4.發(fā)光反應條件分離度、峰形、

保留時間第二十五頁，共67頁。HPLC-CL實驗裝置示意圖第二十六頁，共67頁。血漿樣品的預處理方法取血漿樣品100μL，精密加入內標溶液（0.2mg·mL-1異鼠李素）5.0μL，20%的磷酸溶液10μL酸化，加甲醇200μL，渦旋混合1.0min，離心（10000r·min-1）10min后，取上清液10μL進樣。第二十七頁，共67頁。方法學考察專屬性1線性關系和檢測限2精密度、準確度與提取回收率3穩(wěn)定性4第二十八頁，共67頁。結果專屬性SampleBlankBlank+KA+IS第二十九頁，共67頁。結果線性關系和檢測限

線性范圍：2.0×10-9－2.0×10-6g·ml-1線性方程：y=0.8626x+5.553(r=0.9991,n=7)檢測限：1.0×10-9g·mL-1。第三十頁，共67頁。結果精密度、準確度與提取回收率

日內和日間RSD均小于5.0%，回收率大于80.0%

Added(ng·mL-1)Found(ng·mL-1)Precision(%RSD)Accuracy(%)Recovery(%)Intra-day20.016.2±0.63.780.889.2±3.1160.0151.3±3.02.094.697.1±1.710001001.2±32.83.3100.195.3±2.7Inter-day20.016.0±0.74.480.090.0±4.3160.0150.7±4.63.193.997.4±2.41000.01002.4±13.01.3100.295.1±2.4第三十一頁，共67頁。結果4℃穩(wěn)定性

Concentration(ng·mL-1)0h48hDeviation(%)±sRSD(%)±sRSD(%)20.016.0±0.63.816.4±0.63.60.7160.0152.1±3.02.0146.6±2.61.81.61000.0997.2±28.92.9949.5±25.62.72.6凍融穩(wěn)定性

Concentration(ng·mL-1)Beforefreeze-thawingAfterfreeze-thawingDeviation(%)x±sRSD(%)x±sRSD(%)20.016.0±0.63.815.7±0.74.30.8160.0152.1±3.02.0142.2±2.61.73.41000.0997.2±28.92.9951.6±33.93.42.3第三十二頁，共67頁。藥動學研究

給藥1250mg/kgBW隨機分組2500mg/kgBW前處理取血C-T數據DAS2.0藥動參數第三十三頁，共67頁。第三十四頁，共67頁。首次成功將HPLC-CL聯用技術應用于中藥藥動學的研究多峰現象肝腸循環(huán)第三十五頁，共67頁。結果藥動學參數ParametersDoses(mg·kg-1BW)25001250Tmax(h)1.21±0.461.08±0.43Cmax(ng·mL-1)232.90±5.14165.67±1.99AUC0-∞(ng·h·mL-1)1728.41±57.31729.01±29.44MRT0-∞(h)13.38±3.874.77±2.06t1/2(h)9.27±1.843.30±1.05JournalofChromatographyB,2009,877(29),3595-3600.第三十六頁，共67頁。30微透析采樣技術第三十七頁，共67頁。第三十八頁，共67頁。第三十九頁，共67頁。微透析技術(microdialysis,MD)時間分辨性、空間分辨性不破壞機體完整性提供游離態(tài)小分子化合物樣品可不經預處理直接用于測定樣品量少、濃度低微透析第四十頁，共67頁。多個器官連續(xù)取樣與高靈敏度分析技術聯用活體內待測組分的實時、連續(xù)、檢測

微透析采樣技術第四十一頁，共67頁。微透析–液相色譜–化學發(fā)光法測定大鼠血和腦組織中丹參酚類化合物濃度及其藥動學研究第四十二頁，共67頁。脂溶性成分二萜醌類水溶性成分酚類丹參素DSS、原兒茶酸PA、原兒茶醛PAL、咖啡酸CA丹酚酸A、丹酚酸B等丹參近期藥理研究發(fā)現：丹參酚類化合物具有改善血液循環(huán)、減少腦梗死面積、抑制腎素血管緊張素系統(tǒng)、和清除自由基、保護損傷的腦組織等藥理作用。研究背景第四十三頁，共67頁。研究背景丹參水溶性成分的藥動學研究吸收和分布：

丹參提取物給家兔灌服，采用液-液萃取技術對家兔血漿中的丹參素進行萃取，用膠束毛細管電泳進行測定。灌胃后30min，肝、肺、腎、腦組織中的丹參素濃度最高；70min時，心組織中丹參素濃度最高；50min時，脾組織中DSS濃度最高。灌胃給藥后，DSS在很短的時間內進行吸收、分布。其中肝組織中的丹參素濃度最大，表明DSS在新西蘭大白兔體內的代謝主要在肝組織中進行。楊燕,楊榮,衛(wèi)引茂,等.藥物分析雜志.2008,28(3):362.第四十四頁，共67頁。研究背景代謝和排泄

Zhang等利用HPLC-UV和HPLC-MS對大鼠灌胃200mg·kg-1丹參總酚酸（丹參素2.3%，原兒茶醛4.6%，丹酚酸B60.7%）后尿液和糞便中的代謝產物進行了研究，在收集的24h尿液中檢測到5個代謝產物：丹參素、咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸和3,4-二甲氧基苯乙酸，而在糞便中未檢測到代謝產物。

Shen等利用LC/TOFMS，對大鼠靜脈注射純化的丹酚酸A后血漿中的代謝產物進行了研究，發(fā)現了5個代謝產物：單葡萄糖醛酸化丹酚酸A、甲基葡萄糖醛酸化丹酚酸A、甲基丹酚酸A，二甲基丹酚酸A和二甲基葡萄糖醛酸化丹酚酸A。ZhangJ,HeY,CuiM,etal.BiomedicalChromatography.2005,19(1):51.ShenY,WangX,XuL,etal.RapidCommunicationsinMassSpectrometry.2009,23(12):1810.第四十五頁，共67頁。研究背景藥動學參數及生物利用度

Guo等用LC-MS測定了大鼠注射冠心寧凍干粉后血漿中DSS，PA，PAL，綠原酸，CA和SalB的濃度。獲得了這幾種酚類化合物的t1/2，Cmax，Tmax。

潘堅揚等考察了丹參素在大鼠體內藥動學和口服生物利用度。用超高壓液相色譜三重四級桿質譜聯用法測定丹參素血藥濃度，計算藥動學參數，丹參素的口服生物利用度為9.53%，口服生物利用度較差。

Han等用LC-MS測定了大鼠靜脈注射劑量為10、20和40mg·kg-1的純度為98%的SalB后的血藥濃度，求算了AUC，MRT，t1/2，V等參數，發(fā)現AUC隨劑量增加，各劑量組之間MRT，t1/2和V無差異。GuoXR,ChenXH,LiL,etal.

JournalofChromatographyB.2008,873(1):51.潘堅揚,趙筱萍,邵青.中國中藥雜志.2008,33(2):146.HanDE,GaoZD,ZhaoD,etal.BiomedicalChromatography.2009,23(10):1073.第四十六頁，共67頁。研究背景腦部藥動學研究

羅世英等對大鼠灌胃丹參水提物（DSS32.4,PAL6.0,SalB36.2mg·kg-1）采用液-液萃取法對血清樣品和腦組織勻漿樣品進行預處理，用HPLC-UV法測定，在大鼠血清中檢測到DSS、PAL和SalB，在腦組織勻漿中未檢測到這三種物質。但由于紫外檢測器靈敏度較低，腦勻漿中未檢測到的原因有待進一步試驗證明？

鄭曉暉等在研究復方丹參方中使藥冰片對君藥丹參藥動學和組織分布的影響時，用丹參水煎液對新西蘭大白兔灌胃給藥（10g·kg-1），通過從小腦延髓池抽取腦脊液，以及腦組織勻漿采用LC-MS，在腦脊液和腦組織勻漿中測得DSS，但未報道丹參素在腦組織中的藥動學參數。羅世英,鐘志國,林堅濤,等.中藥藥理與臨床.2009,25(4):44.鄭曉暉,趙欣,房敏峰,等.西安交通大學學報(醫(yī)學版).2007,28(2):170.第四十七頁，共67頁。研究背景存在問題：腦組織藥代動力學研究的報道較少。測定腦組織中藥物含量多采取腦組織勻漿法或抽取腦脊液進行測定離體干擾生命過程樣品處理繁瑣易被污染準確性需進一步評價積極尋求一種實時、連續(xù)的腦部采樣技術是當前迫切需要解決的問題！第四十八頁，共67頁。30微透析（microdialysis,MD）采樣技術應用于丹參藥動學研究臺灣Tsai課題組用HPLC-UV法測定了大鼠靜脈注射純度為98%的丹酚酸B（100mg?kg-1）后，血液和膽汁中的游離SalB，線性范圍為0.1–50μg?mL-1，并報道了藥動學參數。ChenYF,JawI,ShiaoMS,etal.JournalofChromatographyA.2005,1088(1-2):140.第四十九頁，共67頁。研究內容HPLC-CL體系的建立微透析采樣技術的研究丹參藥動學研究實驗一靜脈注射給藥實驗二口服給藥第五十頁，共67頁。丹參六種水溶性成分結構第五十一頁，共67頁。色譜與化學發(fā)光分析條件的優(yōu)化流動相組成、pH、流速發(fā)光反應流路、試劑濃度、pH、流速第五十二頁，共67頁。實驗一：色譜柱：Shim-packODS,250×4.6mmI.D.5μm柱溫:30°C流速：1.0mL·min-1流動相：A：水（含0.1%磷酸，v/v）

B：甲醇（含0.1%磷酸，v/v）梯度洗脫：0–15min，25–50%B；15–30min，50%B進樣量：20μL。

實驗二：流動相：0.1%磷酸–甲醇（92:8，v/v），等度洗脫其他條件同實驗一液相色譜的分析條件第五十三頁，共67頁。色譜與化學發(fā)光分析條件的優(yōu)化第五十四頁，共67頁。微透析采樣儀器設備：

腦立體定位儀

微量注射泵

動物恒溫控制器

血管探針

腦探針第五十五頁，共67頁。.Text2Text3模型組BloodprobeBrainprobe血管探針的植入腦探針的植入第五十六頁，共67頁。微透析條件的優(yōu)化探針回收率的測定

體外：Rinvitro=Cdia/Cs

體內：Rin

vivo=(Cperf?Cdial)/Cperf

實際濃度：Cf=Cm/Rinvivo

流速對探針回收率的影響

血管探針：2.5、2.0、1.5μL·min-1

腦探針：1.0、0.8、0.6μL·min-1

濃度對探針回收率的影響

在所選濃度范圍內無影響探針回收率的穩(wěn)定性

4h內的體外回收率的RSD第五十七頁，共67頁。給藥及采樣給藥

實驗一：丹參注射液（DSS3.5mg/kg，PAL0.5mg/kg，SalB0.48mg/kg）尾靜脈注射

實驗二：丹參提取物灌胃(DSS，40mg/kg，PAL149mg/kg,SalB50mg/kg)灌胃

樣品采集

灌流液種類：林格液

實驗一：采樣部位：腦；灌流液流速2.0μL/min。采樣間隔15min

實驗二：采樣部位：血管、腦同步；灌流液速度：血管2.0μL/min；

腦0.8μL/min；采樣時間間隔：血管15min；腦30min第五十八頁，共67頁。實驗結果

專屬性

樣品中的雜質不干擾測定

線性關系和檢測限

各酚類化合物的線性關系良好（R＞0.990）。

LOD：實驗一：0.22~12.80ng/mL，實驗二：0.29~0.80ng/mL

精密度和準確度

日內和日間RSD均小于5.5%第五十九頁，共67頁。DSS丹參素；PA原兒茶酸；PAL原兒茶醛；CA咖啡酸；SalB丹參素B；SalA丹酚酸A濃度：64.0ng/mLAbsorbanceRelativeCLIntensity(a.u.)HPLC-CL法檢測六種丹參酚類化合物色譜圖UVCL第六十頁，共67頁。腦和血樣品的專屬性色譜圖

HPLC-CLHPLC-UVbloodmicrodialysateBlankbrianmicrodialysateBlankbloodmicrodialysateBrianmicrodialysate第六十一頁，共67頁。丹參藥動學研究實驗一：丹參注射液靜脈給藥

丹參注射液給藥后（DSS3.5mg/kgBW，PAL0.5mg/kgBW，SalB0.48mg/kgBW）在血液和腦中均觀察到DSS，而未見PAL與SalB。腦中游離DSS的C-T曲線腦中游離DSS的PK參數ParametersEstimatest1/2/h0.64±0.20AUC0-∞/ng·h·mL-1369.39±114.77MRT0-∞/h0.64±0.18k1.36±0.27中國藥理學通報，2010，26(9),981-988.第六十二頁，共67頁。丹參藥動學研究DSSPA實驗二：丹參提取物灌胃給藥

丹參提取物給藥后（DSS，40mg/kg，PAL149mg/kg,SalB50mg/kg）在大鼠血液和腦透析液中均觀察到DSS和PA未測得