分光光度計(jì)優(yōu)秀課件

分光光度計(jì)第1頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三BasicUV-VisTheoryandApplications

分光光度計(jì)的原理與應(yīng)用第2頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、基本原理利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測(cè)定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計(jì)。分光光度計(jì)靈敏度高，測(cè)定速度快，應(yīng)用范圍廣，其中的紫外/可見分光光度技術(shù)更是生物化學(xué)研究工作中必不可少的基本手段之一。因此我們重點(diǎn)討論紫外/可見分光光度法的基本原理、儀器構(gòu)造及其在生化領(lǐng)域中的應(yīng)用等。第3頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三電磁輻射的波長(zhǎng)第4頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三電磁波波長(zhǎng)的范圍Region Wavelength(nm)Farultraviolet 10-200Nearultraviolet 200-380Visible 380-780Nearinfrared 780-3000Middleinfrared 3000-30,000Farinfrared 3×104-3×105Microwave 3×105-1×109第5頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Relationshipbetweenlightabsorptionandcolor第6頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三電子躍遷類型與紫外吸收波長(zhǎng)(nm)關(guān)系電子躍遷類型例子 紫外吸收波長(zhǎng)范圍σ→σ*C－H 100～150nmπ→π*(非共軛)C＝O ＜200nmπ→π*(共軛)＝C－C＝ 200～300nmn→π*C＝O ～300nm第7頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Examplesoftransitionsandresultingλmax第8頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三π→π*躍遷：此類躍遷所需能量較小，吸收波長(zhǎng)在紫外區(qū)的200～300nm，不飽和烴、共軛烯烴及芳香烴均可發(fā)生這類躍遷，氨基酸、蛋白質(zhì)與核酸均含有大量共軛雙鍵，因而200～300nm的紫外吸收測(cè)定，在生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)中有極廣泛的用途。第9頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Commonlyusedsolventsandtheir'cut-off'wavelengthsSolvent 溶劑 Cut-off(nm)Iso-octane辛烷 202Ethylalcohol乙醇 205Cyclohexane環(huán)己烷 200Acetone丙酮 325Tetrachloroethylene四氯乙烯 290Benzene苯 280Carbontetrachloride四氯化碳 265Chloroform氯仿 245Ethylether乙醚 220Isopropylalcohol異丙醇 210Methylalcohol甲醇 210第10頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三不同溶劑對(duì)酚紫外檢測(cè)的影響第11頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長(zhǎng)，并測(cè)定物質(zhì)對(duì)各種波長(zhǎng)光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波長(zhǎng)λ作橫坐標(biāo)，“A”或“T”為縱座標(biāo)，畫出連續(xù)的“A~λ”或“T~λ”曲線，即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線。第12頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三吸收峰的命名曲線上“A”處稱最大吸收峰，它所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱最大吸收波長(zhǎng)，以λmax表示。曲線上“B”處有一谷，稱最小吸收，它所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，稱最小吸收波長(zhǎng)，以λmin表示。曲線上在最大吸收峰旁邊有一小峰“C”，稱肩峰。在吸收曲線的波長(zhǎng)最短的一端，曲線上“D”處，吸收相當(dāng)強(qiáng)，但不成峰形，此處稱為末端吸收。第13頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三λmax是化合物中電子能級(jí)躍遷時(shí)吸收的特征波長(zhǎng)，不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰，所以它對(duì)鑒定化合物極為重要。吸收光譜中，λmax、λmin、-肩峰以及整個(gè)吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而異，所以是物質(zhì)定性的依據(jù)。測(cè)定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標(biāo)準(zhǔn)的紫外光譜圖相對(duì)照，對(duì)照時(shí)須注意測(cè)定的條件，如溶劑、濃度等。第14頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜有許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進(jìn)行化合物定性鑒定時(shí)，應(yīng)注意：化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團(tuán)或基團(tuán)，因此在鑒定時(shí)應(yīng)與紅外光譜相結(jié)合。由于電子躍遷的同時(shí)也引起分子的轉(zhuǎn)動(dòng)和振動(dòng)光譜，要把電子躍遷和分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)的躍遷完全分開是不可能的，因此我們常見的紫外吸收光譜是由一個(gè)或幾個(gè)寬的吸收譜帶所組成。第15頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三紫外光譜中常用的術(shù)語(yǔ)發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)。發(fā)色團(tuán)：凡是與飽和碳?xì)浠衔镞B接能引起n→π*、π→π*、n→σ*等電子躍遷的基團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)。例如：C＝C、C＝O等。助色團(tuán)：助色團(tuán)是一些具有非共價(jià)鍵的基團(tuán)（如OH、NH2、SH等）。這些基團(tuán)在波長(zhǎng)＞200nm處沒(méi)有吸收，當(dāng)它與發(fā)色團(tuán)相連接時(shí)，使發(fā)色團(tuán)的吸收帶向長(zhǎng)波移動(dòng)，稱為紅移（或淺色效應(yīng)），紅移的同時(shí)吸收帶的強(qiáng)度增加。若助色團(tuán)與發(fā)色團(tuán)相連接，產(chǎn)生n→π*躍遷，使吸收波長(zhǎng)向短波移動(dòng)，稱為蘭移（或深色效應(yīng)）。第16頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）核酸變性或降解，使得DNA或RNA溶液對(duì)紫外光的吸收明顯增加，即ε值（吸光系數(shù)或稱消光系數(shù)）顯著升高，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。此效應(yīng)是由于堿基之間電子相互作用的改變所致，通常在260nm處測(cè)量。第17頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三減色效應(yīng)（hypochromiceffect）在一定的條件下，變性的核酸又可以復(fù)性，此時(shí)ε值又明顯減少，回復(fù)到原來(lái)的核酸分子ε值較低的水平，即此時(shí)DNA或RNA溶液的紫外光吸收顯著降低，此現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)，此效應(yīng)也是由于堿基之間電子相互作用的變化所引起的，通常在260nm條件下測(cè)量。第18頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三光吸收定律朗伯——比爾（Lambert－beer）光吸收定律：

A＝-lgT＝εbcA——吸光度，又稱光密度“O.D”。T——透光度，T＝I/I。，I?！獮檎丈涞轿粘厣系墓鈴?qiáng)，I——為透過(guò)吸收池的光強(qiáng)。ε——摩爾吸光系數(shù)（L·mol-1·cm-1）。b——樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，b=1cm。C——樣品濃度（mol/L）。吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“ε”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。第19頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三檢測(cè)計(jì)算溶液的摩爾濃度例如：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測(cè)定260nm處的吸光度為0.650，用同一吸收池測(cè)定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，計(jì)算尿嘧啶溶液的摩爾濃度，已知其摩爾吸光系數(shù)=8.2×103M-1cm-1（M＝mol/L)?！逜＝εbC∵A＝（溶劑加樣品的吸光度）－（溶劑的吸光度）∴A＝0.650－0.070＝0.580∵b＝1cm∴C=7.1×10-5mol/L第20頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、分光光度計(jì)的組成和構(gòu)造組成：各種型號(hào)的紫外/可見分光度計(jì)，不論是何種型式，基本上都由五部分組成：光源：鎢燈和氘(dao)燈單色器（包括產(chǎn)生平行光和把光引向檢測(cè)器的光學(xué)系統(tǒng)）；樣品室；接收檢測(cè)放大系統(tǒng)；顯示或記錄器。第21頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三⑴光源理想光源的條件是：①能提供連續(xù)的輻射；②光強(qiáng)度足夠大；③在整個(gè)光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長(zhǎng)有明顯變化；④光譜范圍寬；⑤使用壽命長(zhǎng)，價(jià)格低。用于可見光和近紅外光區(qū)的光源是鎢燈，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogenlamp），即石英鎢燈泡中充以鹵素，以提高鎢燈的壽命。適用波長(zhǎng)范圍是320～1100nm。由于能量輸出的波動(dòng)為電壓波動(dòng)的四次方倍，因此電源電壓必須穩(wěn)定。用于紫外光區(qū)的是氘燈（Deuteriumlamp），適用波長(zhǎng)范圍是195～400nm，由于氘燈壽命有限，國(guó)產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時(shí)左右，要注意節(jié)約燈時(shí)。第22頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三鎢燈燈絲溫度和波長(zhǎng)的關(guān)系第23頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三⑵單色器單色器是分光光度計(jì)的心臟部分，它的作用是把來(lái)自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長(zhǎng)。它的主要組成部件和作用是：①入射狹縫——限制雜散光進(jìn)入。②色散元件——即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。③準(zhǔn)直鏡——把來(lái)自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等光，并把來(lái)自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。④出射狹縫——只讓額定波長(zhǎng)的光射出單色器轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡或光柵的波長(zhǎng)盤，可以改變單色器出射光束的波長(zhǎng)；調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度。光柵：光柵有透射光柵和反射光柵，實(shí)際應(yīng)用的都是反射光柵，它又可分為平面反射光柵（即通稱的反射光柵或閃爍光柵）和凹面反射光柵兩類，凹面反射光柵可以起色散元件和準(zhǔn)直鏡兩個(gè)作用，使色散后的光束聚焦于出射狹縫，得到銳線光譜。第24頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三狹縫、光譜頻帶寬度和分辨率出射狹縫的寬度通常有兩種表示方法：一為狹縫的實(shí)際寬度，以毫米（mm）表示，另一種為光譜頻帶寬度，即指由出射狹縫射出光束的光譜寬度，以毫微米nm表示。例如，出射狹縫的寬度是6nm，并不是說(shuō)出射狹縫的寬度是6nm，而是指由此狹縫射出的光具有6nm的光譜帶寬。第25頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三純粹的單色光只是一種理想情況，分光光度計(jì)所能得到的“單色光”，實(shí)際上只是具有一定波長(zhǎng)范圍的譜帶，狹縫越寬，所包括的波長(zhǎng)范圍也愈寬。對(duì)單色光純度來(lái)說(shuō)，狹縫是愈窄愈好，但光的強(qiáng)度也就越弱，因此狹縫不能無(wú)限制地小，狹縫的最小寬度取決于檢測(cè)器能準(zhǔn)確地進(jìn)行測(cè)量的最小光能量。目前達(dá)到的最小寬度為0.1nm。由于光柵分光其色散是線性的，所以只用一種狹縫寬度對(duì)各種波長(zhǎng)的光的測(cè)量，其分辨率都相同，即狹縫寬度不必經(jīng)常調(diào)節(jié)。只要光強(qiáng)能達(dá)到要求，應(yīng)使用盡可能小的狹縫寬度，以提高分辨率。第26頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三⑶樣品室包括池架、吸收池（即比色杯）以及各種可更換的附件。池架有普通池架和恒溫池架，恒溫池架有水恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫，控溫精度為0.1℃，電恒溫池架十分昂貴，控溫精度可達(dá)0.05℃。吸收池有光學(xué)玻璃杯和石英玻璃杯兩種。光學(xué)玻璃杯因?yàn)槠胀ü鈱W(xué)玻璃吸收紫外光，因此只能用于可見光，適用波長(zhǎng)范圍是400nm～2000nm。石英玻璃杯可透過(guò)紫外光、可見光和紅外光，是最常使用的吸收池，使用波長(zhǎng)范圍是180nm～3000nm。第27頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三吸收池使用注意事項(xiàng)要徹底清洗，尤其是盛過(guò)蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時(shí)可放在1％洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時(shí)用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可用綢布絲線或軟塑料制作小刷子清洗。嚴(yán)禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴(yán)禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí)，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。吸收池的校正：要固定參比杯和樣品杯，可在杯的毛玻璃面上寫上記號(hào)。用盛有參比液的參比杯和樣品杯測(cè)定吸光度“A0”，樣品杯換上樣品液后測(cè)定的吸光度為“A1”，則校正后的實(shí)際吸光度A為：A=A1－A0第28頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三⑷檢測(cè)器檢測(cè)器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強(qiáng)度以電訊號(hào)顯示出來(lái)，常用的檢測(cè)器有光電管，光電倍增管和光電二極管等三種。光電二極管：原理是硅二極管受紫外～近紅外輻射照射時(shí)，其導(dǎo)電性增強(qiáng)的大小與光強(qiáng)成正比。近年來(lái)分光光度計(jì)使用光電二極管作檢測(cè)器在增加，雖然其靈敏度還趕不上光電倍增管，但它的穩(wěn)定性更好，使用壽命更長(zhǎng)，價(jià)格便宜，因而許多著名品牌的高檔分光光度計(jì)都在使用它作檢測(cè)器。尤其值得注意的是由于計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，使用光電二極管的二極管陣列分光光度計(jì)有了很大發(fā)展，二極管數(shù)目已達(dá)1024個(gè)，明顯提高了分辨率。這種新型分光光度計(jì)的特點(diǎn)是“后分光”，即氘燈發(fā)射的光經(jīng)透鏡聚焦后穿過(guò)樣品吸收池，經(jīng)全息光柵色散后被二極管陣列的各個(gè)二極管接收，信號(hào)由計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理和存儲(chǔ)，因而掃描速度極快，約10ms就可完成全波段掃描，繪出吸光度、波長(zhǎng)和時(shí)間的三維立體色譜圖，可以最方便快速地得到任一波長(zhǎng)的吸收數(shù)據(jù)，它最適宜用于動(dòng)力學(xué)測(cè)定，也是高效液相色譜儀最理想的檢測(cè)器。第29頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三顯示輸出裝置低檔分光光度計(jì)現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的還連有打印機(jī)?，F(xiàn)代高性能分光光度計(jì)均可以連接微機(jī)，而且有的主機(jī)還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機(jī)和打印繪圖機(jī)。有的還帶有標(biāo)準(zhǔn)軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便（例如SPECORD200）。第30頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三分光光度計(jì)光路原理圖光源切換鏡石英鹵素?zé)綦疅魹V色盤場(chǎng)鏡入口球面反光鏡基準(zhǔn)轉(zhuǎn)換鏡旋轉(zhuǎn)鏡電機(jī)螺環(huán)鏡樣品室凹形全息光柵出口第31頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三分光光度法在生化實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用分光光度計(jì)除用于常規(guī)的吸光度測(cè)定和吸收光譜的掃描外，常用的分光光度法還有導(dǎo)數(shù)分光光度法、催化動(dòng)力學(xué)分光光度法和差示分光光度法等。在生化實(shí)驗(yàn)中主要用于氨基酸含量的測(cè)定、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定、核酸的測(cè)定、酶活力測(cè)定、生物大分子的鑒定和酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究等。相對(duì)濃度、分子構(gòu)象、反應(yīng)過(guò)程記錄等等。第32頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三NAD和NADH吸收光譜的對(duì)比第33頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、Helios儀器特點(diǎn)采用全息母光柵（不是復(fù)制光柵），可獲得優(yōu)異的光學(xué)性能和耐久性，即使在高吸光度3A下也能保持線性。采用步進(jìn)馬達(dá)單色器，配合HattenModulator調(diào)制器，使得無(wú)論是高速掃描還是低速掃描，其掃描曲線完全重合（沒(méi)有峰值）。真正的雙光束，光束能量比為樣品/參比=80/20，可獲得良好的信噪比。標(biāo)準(zhǔn)軟盤，存取方便，方便計(jì)算機(jī)的應(yīng)用。第34頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三主機(jī)功能SCAN：測(cè)定吸收值和吸收峰FIXED：在一固定波長(zhǎng)下的吸收值QUANT：濃度測(cè)定（以一標(biāo)準(zhǔn)作參照）RATE：一定時(shí)間范圍內(nèi)吸收值的變化曲線。存盤第35頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三配件功能連續(xù)進(jìn)樣分析：加流動(dòng)池配件（SUPPERSIPPER）打印：配打印機(jī)計(jì)算機(jī)控制：配計(jì)算機(jī)核酸解鏈分析：配核酸解鏈配件（水浴+溫控）酶動(dòng)力學(xué)：溫控裝置。第36頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三操作步驟開機(jī)預(yù)熱：電源在機(jī)器后面。在HOME主頁(yè)上選擇功能，用箭頭（機(jī)子右下角）選擇，確定后按ENTER，再進(jìn)一步用箭頭，光標(biāo)和ENTER選，直到所有功能（參數(shù)）確定。調(diào)零：用左右箭頭