免疫磁珠熒光量子點技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌

免疫磁珠熒光量子點技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌馬慧;高詩會;楊華;王祎龍;胡忠義;秦蓮花;陳海珍;陸俊梅;王潔;柏文娟;郭琪【摘要】目的篩選結(jié)核分枝桿菌(MTB)免疫磁珠熒光量子點檢測方法的最佳配體組合?方法將本室篩選獲得的MTB結(jié)合肽H8和商業(yè)化抗MTB多克隆抗體(Pab)與納米磁珠偶聯(lián)，多肽H8、商業(yè)化抗MTB單克隆抗體(Mab)和抗熱休克蛋白65單克隆抗體(Mabe)與熒光量子點偶聯(lián)，分別獲得2種免疫磁珠和三種功能化熒光量子點,兩兩組合用于MTB檢測，通過顯微鏡下觀察熒光信號以及激光誘導(dǎo)熒光儀測量熒光值,判斷不同配體組合與MTB的親和性及特異性，獲得最佳組合及其檢測下限?結(jié)果偶聯(lián)Mabe的熒光量子點與免疫磁珠MNP-Pab組合檢測MTB結(jié)果為陰性，其余5組均為陽性?測量熒光值，檢測效果較好的兩組組合分別是MNP-Pab+QD-H8和MNP-H8+QD-H8,陽性熒光值與陰性對照組比值分別是4.394和3.956,檢測下限均是102條菌/mL.6組組合與12種非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的親和性各異，而與3種非分枝桿菌均不結(jié)合?結(jié)論MNP-Pab+QD-H8和MNP-H8+QD-H8兩組檢測效果較好，與MTB親和性較高,特異性較好,可作為MTB免疫磁珠熒光量子點檢測技術(shù)的最佳配體組合.％TheaimsofthisstudyistoselectthebestligandeombinationsofimmunomagnetiebeadsandfluoreseentquantumdotsmethodfordeteetingMyeobaeleriumtubereulosis(MTB).MTB-speeifiepeptideH8andeommereialanti-MTBpolyelonalPabwereeombinedwithmagnetienanopartieles,whilethepeptideH8andtwoeommereialanti-MTBmonoelonalantibodies(MabandMabe)wereeoatedwithfluoreseentquantumdots,toobtainetwokindsofimmunomagnetiebeadsandthreekindsoffunetionalizedfluoreseeneeqantumdotseparately.Theresultsshowthatanti-MTBmonoelonalantibodiesMabecoatedQDscombinedwithMNP-Pabwasnegative,otherfivecombinationsdetectedMTBwereallpositive.ThebesttwocombinationswereMNP-Pab+QD-H8andMNP-H8+QD-H8,andtheratioofthefluorescencevaluebetweentheexperimentalgroupandthecontrolgroupwere4.394and3.956.Sixgroups,thelimitdetectionofthetwogroupswereall102CFU/mL.Sixgroupsdetectedtwelvekindsofnontuberculosismycobacteriumshoweddifferentaffinity,andhadnotaffinitywiththreekindsofnon-mycobacterium.ThecombinationofMNP-Pab+QD-H8andMNP-H8+QD-H8hadbetteraffinityandspecificity,couldbeusedasthebestligandcombinationsforimmunomagneticbeadsquantumdotsmethodtodetectMTB.期刊名稱】《中國人獸共患病學(xué)報》年(卷),期】2013(029)005【總頁數(shù)】6頁（P466-471）【關(guān)鍵詞】免疫磁珠;熒光量子點;分枝桿菌;結(jié)核;檢測;配體【作者】馬慧;高詩會;楊華;王祎龍;胡忠義;秦蓮花;陳海珍;陸俊梅;王潔;柏文娟;郭琪【作者單位】同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病診療中心,上海市結(jié)核病（肺）重點實驗室,上海,200433;蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,蘇州,215123;同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病診療中心,上海市結(jié)核?。ǚ危┲攸c實驗室,上海,200433;同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病診療中心,上海市結(jié)核病（肺）重點實驗室,上海,200433;同濟大學(xué)先進材料與納米生物醫(yī)學(xué)研究院,上海,200092;同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病診療中心,上海市結(jié)核?。ǚ危┲攸c實驗室,上海,200433;同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病診療中心,上海市結(jié)核病（肺）重點實驗室,上海,200433;山西省兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心,太原,030013;同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病診療中心,上海市結(jié)核?。ǚ危┲攸c實驗室,上海,200433;同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病診療中心,上海市結(jié)核?。ǚ危┲攸c實驗室,上海,200433;同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病診療中心,上海市結(jié)核?。ǚ危┲攸c實驗室,上海,200433;同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病診療中心,上海市結(jié)核?。ǚ危┲攸c實驗室,上海,200433【正文語種】中文【中圖分類】R378結(jié)核病仍是威脅人類健康的主要傳染病，目前市售的抗結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis,MTB）抗體的特異性和敏感性均不高，因此，國內(nèi)外均在尋找新的MTB標(biāo)識物，建立檢測MTB新方法［1-2］。近年來，納米技術(shù)已經(jīng)廣泛用于普通細(xì)菌的檢測中［3］，在MTB檢測中也開展了一些研究［4］，我們利用前期篩選獲得的MTB結(jié)合肽H8分別與納米磁珠和熒光量子點偶聯(lián)，建立了免疫磁珠熒光量子點技術(shù)檢測MTB方法，但是該方法的特異性和靈敏度還有待于進一步提高，其中最關(guān)鍵就是獲得互補的高親和力高特異性檢測配體組合。本研究將本室利用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得的MTB結(jié)合肽H8和市售抗MTB多克隆抗體（Anti-MycobacteriumtuberculosisPolyclonalAntibody,Pab）與納米磁珠偶聯(lián)，結(jié)合肽H8和市售抗MTB單克隆抗體（Anti-MycobacteriumtuberculosisMonoclonalAntibody,Mab）、抗MTB熱休克蛋白65單克隆抗體（anti-HSP65Monoclonalantibody,Mabc）與熒光量子點偶聯(lián)，獲得2種免疫磁珠和3種功能化熒光量子點，六種組合用于MTB檢測，比較不同組合的檢測效果和特異性，并初步評價6組組合的檢測下限，為優(yōu)化MTB免疫磁珠熒光量子點檢測技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。1材料與方法材料1.1.1菌株MTB標(biāo)準(zhǔn)株（H37RvATCC27294）和12種非結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（Nontuberculusmycobacterium，NTM）（田鼠分枝桿菌ATCC19422、新金色分枝桿菌ATCC25795、戈登分枝桿菌ATCC14470、不產(chǎn)色分枝桿菌ATCC19530、恥垢分枝桿菌ATCC19420、龜-膿腫分枝桿菌ATCC19977、偶發(fā)分枝桿菌ATCC6841、金色分枝桿菌ATCC23366、堪薩斯分枝桿菌ATCC12478、淺黃分枝桿菌ATCC43909、愛知分枝桿菌ATCC27280和草分枝桿菌ATCC11758）均購自國家菌種保藏中心，由上海市肺科醫(yī)院保存。3種非分枝桿菌（銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸桿菌ATCC25922）為上海市肺科醫(yī)院檢驗科保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株。MTB結(jié)合肽H8MTB結(jié)合肽H8（序列：WHSGTPH）是本室以H37Rv滅活菌體為靶分子，應(yīng)用噬菌體展示隨機7肽文庫進行篩選，通過恥垢分枝桿菌滅活菌體反篩獲得［5］，委托上海波泰生物技術(shù)有限公司合成。1.1.3抗體抗MTB熱休克蛋白65單克隆抗體（Mabc）、抗MTB單克隆抗體（Mab）和抗MTB多克隆抗體（Pab）購自美國Thermo公司。1.1.4主要儀器熒光顯微鏡（LeicaTCSCP5口）購自日本Olympus公司，細(xì)菌比濁儀（PhoenixSpecNephelometer）購自美國BectonDikinson公司，激光誘導(dǎo)熒光儀（SP-800MCE）由同濟大學(xué)納米院與上海光譜有限公司共同研制。方法1.2.1菌株制備將MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和12種NTM標(biāo)準(zhǔn)株轉(zhuǎn)種至含10%OADC營養(yǎng)添加劑的米氏7H9液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，IxPBS洗滌菌體2次，加入IxPBS和直徑3mm的玻璃珠數(shù)個，振蕩器振蕩0.5min，吸取上清菌液用比濁儀比濁至相當(dāng)于3x107細(xì)菌/mL[6],80。C水浴滅活30min待檢。3種非分枝桿菌均從血平板上刮取生長良好的菌落,1xPBS洗滌菌體2次，磨菌后比濁至1個麥?zhǔn)蠁挝唬?0。C水浴滅活30min待檢。1.2.2免疫磁珠制備參照文獻[7]，分別取合成的納米磁珠(Magneticnanoparticles,MNP,30mg/mL)33.3pL,用IxPBS洗滌3次，通過磁鐵吸附沉淀。沉淀重懸于(200pL)1xPBS中，然后加入配好的碳化二亞胺鹽酸鹽[1－ethyl－3－(3－dimethylaminopropyl)carbodiimide(ethyldimethlaminopropylcarbodiimide)，EDC]/PBS(4mg/mL)，2min后再加入多肽H8(10mg/mL)或抗體Pab(4-5mg/mL),室溫翻轉(zhuǎn)2.5h，隨時觀察。通過磁鐵吸附沉淀,1xPBS洗滌沉淀兩次，除去未與磁珠偶聯(lián)的多肽或抗體，沉淀重懸于BSA/PBS中即得到免疫磁珠，本研究中獲得兩種免疫磁珠MNP-H8和MNP-Pab。1.2.3功能化熒光量子點制備參照文獻[8]，分別取熒光量子點(Quantumdots,QD,10mg/mL)150pL與多肽H8(10mg/mL)、抗體Mabc(100pg/mL)和抗體Mab(100pg/mL)(均20pL)混合，吹打，然后加入新配制的EDC/PBS溶液，吹打，靜置2.5h，每隔0.5h吹打1次。12000r/min離心5min,1xPBS洗滌1次，沉淀重懸于BSA/PBS中，獲得3種功能化熒光量子點QD-H8、QD-Mabc和QD-Mab。1.2.4MTB檢測將免疫磁珠(MNP-Pab和MNP-H8)、功能化熒光量子點(QD-H8、QD-Mab和QD-Mabc)分別調(diào)整濃度為100pg/mL,兩兩組合(共6種組合)用于MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37RV檢測。檢測時，取1個麥?zhǔn)蠁挝坏腍37Rv50pL、免疫磁珠和功能化熒光量子點各50pL加入1.5mL離心管內(nèi)混勻，室溫溫和振蕩作用2h，通過磁力架吸附沉淀，用1xPBS洗滌沉淀2次，沉淀重懸于30pL1xPBS中，取10pL涂片，顯微鏡下觀察熒光信號；余下的20pL稀釋到總體積300pL用于激光誘導(dǎo)熒光儀檢測熒光值，功能化熒光量子點與免疫磁珠單獨作用作為陰性對照，實驗組與陰性對照組比值大于等于2.1判斷結(jié)果為陽性[9]。1.2.5特異性檢測將上述6種組合用于12種NTM標(biāo)準(zhǔn)株和3種非分枝桿菌檢測，初步評價6種組合的特異性。1.2.6下限檢測將比濁至3x107的H37RV進行10倍梯度稀釋，分別用于6組組合下限檢測。2結(jié)果6種組合檢測MTB6種組合檢測H37RV時熒光顯微鏡下均可見紅色熒光，如圖1所示，圖中可以看出免疫磁珠MNP-H8和MNP-Pab與功能化熒光量子點QD-H8組合檢測時，顯微鏡下熒光信號較強；測量熒光值結(jié)果，組合MNP-Pab+QDH8檢測陽性值與陰性對照組比值最大，比值為4.394，組合MNP-H8+QD-H8和MNP-Pab+QDMab檢測結(jié)果次之，陽性與陰性對照比值分別是3.956和3.459，6種組合檢測結(jié)果見表1。圖16種組合檢測H37Rv顯微鏡下觀察結(jié)果（x400）Fig.1ResultsforthesixcombinationsdetectionofH37Rvunderthemicroscope表16組組合檢測H37Rv的結(jié)果Tab.1ResultsofsixcombinationsonH37RvdetectionQD-H8QD-MabcQD-MabMNP-Pab4.3941.9803.459MNP-H83.9562.4822.4556種組合檢測3種非分枝桿菌上述6種組合檢測3種非分枝桿菌，顯微鏡下均觀察不到紅色熒光（以組合MNP-H8+QD-H8檢測銅綠假單包菌為例，見圖2，測量熒光值低于陰性對照組熒光值或者是負(fù)值。圖2組合MNP-H8+QD-H8檢測銅綠假單胞菌顯微鏡觀察結(jié)果（x400）Fig.2ResultoncombinationofMNP－H8＋QD－H8indetectionofPseudomonasaeruginosa表26種組合檢測12種非結(jié)核分枝桿菌結(jié)果Tab.2Sixcombinationsondetectionof12kindsofnon－tuberculosismycobacteriaNote：“－”meansredfluorescencesignalcouldnotbeobservedinmicroscope；the“＋”meanstheredfluorescentsignalcouldbeobserved.H8－H8H8－MabH8－MabcPab－H8Pab－MabPab－MabcMTB＋＋＋＋＋－Mycobacteriumkansasii－－－－－－Mycobacteriumchelonae－－－－＋－Mycobacteriumfortuitum－＋－－＋－Mycobacteriumgordonae－－－－－－Mycobacteriumaurum－－－－－－Mycobacteriumneoaurum－－－－＋－Mycobacteriumgivum－－－＋＋－Mycobacteriumaichiense－＋－－－－Mycobacteriummicroti＋－－－＋－Mycobacteriumsmegmatis＋＋－－－－Mycobacteriumnonchromogenicum－＋－＋－－Mycobacteriumphlei－－－－－－2.3特異性檢測6種組合檢測12種NTM，顯微鏡下觀察結(jié)果見表2,其中“+”代表顯微鏡下可見紅色熒光，“－”代表觀察不到紅色熒光。6種組合檢測熒光值測量結(jié)果如圖3和圖4,圖3和圖4均表明多肽H8的特異性高于抗體Mab和Mabe,圖3和圖4結(jié)起來表明，多肽H8的特異性高于抗體Pab。2.4下限檢測組合MNP-H8+QD-H8和MNPPab+QD-H8檢測下限均為102條菌/mL,在檢測低濃度細(xì)菌（S106細(xì)菌/mL）時,MNP-H8+QD-H8組合檢測效果較好，此時陽性熒光值與陰性對照的比值大于組合MNP-Pab+QD-H8檢測的比值。熒光量子點QD-Mab和QD-Mabe與免疫磁珠MNPH8組合檢測下限分別為105條菌/mL和106條菌/mL;QD-Mab與免疫磁珠MNP-Pab組合檢測結(jié)果為陰性，熒光量子點QD-Mabe與免疫磁珠組合檢測下限為105條菌/mL,6組組合下限檢測結(jié)果如圖5所示。3討論納米技術(shù)在MTB檢測中研究相關(guān)報道甚少［10-11］,Liandris等［9］采用商業(yè)化抗體作為配體，修飾納米磁珠和熒光量子點，通過檢測MTB表面抗原達到分離檢測MTB的目的，檢測下限為102條菌/mL。他們的研究直接以商業(yè)化MTB抗體作為配體進行檢測，并未對不同配體組合的檢測效果進行評價。本研究對不同配體組合進行評估，以期獲得高特異性高靈敏性的組合用于MTB檢測。圖3MNP-H8與3種功能化熒光量子點組合檢測13種分枝桿菌1:堪薩斯分枝桿菌；2：龜-膿腫分枝桿菌；3：偶然分枝桿菌4：戈登分枝桿菌；5：金色分枝桿菌；6:新色分枝桿菌7:淺黃分枝桿菌；8:愛知分枝桿菌；9:田鼠分枝桿菌；10:恥垢分枝桿菌；11:不產(chǎn)色分枝桿菌；12:草分枝桿菌；13:H37RvFig.3ThirteenNTMweredetectedbyMNP-H8combinedwiththreefunctionedfluorescentdedequantumdots1:Mycobacteriumkansasii；2:Mycobacteriumchelonae；3:Mycobacteriumfortuitum；4:Mycobacteriumgordonae；5:Mycobacteriumaurum；6:Mycobacteriumneoaurum；7:Mycobacteriumgivum；8:Mycobacteriumaichiense；9:Mycobacteriummicroti；10:Mycobacteriumsmegmatis；11:Mycobacteriumnonchromogenicum；12:Mycobacteriumphlei；13:H37Rv圖4MNP-Pab與3種QD組合檢測13種分枝桿菌1:堪薩斯分枝桿菌；2:龜-膿腫分枝桿菌；3:偶然分枝桿菌4:戈登分枝桿菌；5:金色分枝桿菌；6:新色分枝桿菌7:淺黃分枝桿菌；8:愛知分枝桿菌；9:田鼠分枝桿菌；10:恥垢分枝桿菌；11:不產(chǎn)色分枝桿菌；12:草分枝桿菌；13:H37RvFig.4ThirteenNTMweredetectedbyMNP-PabcombinedwiththreeQDs1:Mycobacteriumkansasii；2：Mycobacteriumchelonae；3：Mycobacteriumfortuitum；4：Mycobacteriumgordonae；5：Mycobacteriumaurum；6：Mycobacteriumneoaurum；7：Mycobacteriumgivum；8：Mycobacteriumaichiense；9：Mycobacteriummicroti；10：Mycobacteriumsmegmatis；11：Mycobacteriumnonchromogenicum；12：Mycobacteriumphlei；13：H37Rv圖56組組合檢測MTB下限結(jié)果Fig.5ThelowlimitdetectiononsixcombinationsofdetectingMTB本研究主要采用了目前市售常用抗MTB多克隆抗體、單克隆抗體以及本室篩選獲得的MTB菌體結(jié)合肽［7］和抗熱休克蛋白65單克隆抗體進行組合，對免疫磁珠熒光量子點技術(shù)檢測MTB的配體分子進行評估。結(jié)合肽H8是以H37RV滅活菌體為靶分子，應(yīng)用噬菌體展示隨機7肽文庫進行篩選，并于第2~4輪的篩選中加入恥垢分枝桿菌進行反篩獲得，與MTB具有較強的結(jié)合活性及一定的特異性。本研究中，多肽H8分別與納米磁珠和熒光量子點偶聯(lián)，多克隆抗體與捕獲用納米磁珠偶聯(lián)，單克隆抗體則與檢測用熒光量子點偶聯(lián)，在檢測，多抗作為包被抗體，單抗作為檢測抗體［12－13］，獲得2種免疫磁珠，3種功能化熒光量子點，共6種組合。6組組合檢測MTB結(jié)果表明，組合MNP-Pab+QD-H8檢測的陽陰比值最大（4.394）,組合MNP-H8+QD-H8組合稍次之（3.956）,均高于其它4組組合，熒光顯微鏡下也可見，組合MNP-Pab+QD-H8和MNP-H8+QD-H8檢測熒光信號較強，顯著高于其它4組組合，表明多肽H8偶聯(lián)的功能化熒光量子點檢測效果優(yōu)于兩種單克隆抗體（Mabe和Mab）偶聯(lián)的功能化熒光量子點。MTB結(jié)合肽H8是以MTB滅活菌體為靶分子，恥垢分枝桿菌作為反篩分子利用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得,恥垢分枝桿菌是一種快生長分枝桿菌,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與以MTB為代表的慢生長分枝桿菌有區(qū)別，將與快生長分枝桿菌結(jié)合的噬菌體洗脫下來。并且經(jīng)過4輪篩選，與MTB親和性高的噬菌體克隆富集被洗脫下來，進一步鑒定可獲得具有高特異性的MTB結(jié)合肽［6］。此外，多肽的量很容易控制，與熒光量子點偶聯(lián)時的濃度較高，而使MTB結(jié)合肽H8與熒光量子點偶聯(lián)的效率高于單抗偶聯(lián)的效率，使得其在檢測時親和性較高。目前，尚無一種針對MTB高親和性高特異性的分子，所以MTB細(xì)菌學(xué)檢測靈敏度和特異性均不高［13］。本研究中，雖6種組合檢測3種非分枝桿菌時，顯微鏡下均觀察不到紅色的熒光信號，測量熒光值很低甚至為負(fù)值，檢測結(jié)果均為陰性，但是在特異性檢測NTM時，不同組合之間檢測結(jié)果還是存在明顯差異。Mabe偶聯(lián)的功能化熒光量子點與2種免疫磁珠組合，檢測12種NTM結(jié)果均為陰性，表明Mabe的特異性很好，但是Mabe偶聯(lián)的功能化熒光量子點與MNP-Pab組合檢測MTB為陰性，與MNP-H8組合檢測MTB為弱陽性，表明Mabe與MTB的親和性不高，故不能作為免疫磁珠熒光量子點技術(shù)檢測MTB的配體分子6種組合特異性檢測結(jié)果表明，多肽H8和Mabe的特異性均高于單抗Mab，使得其在免疫磁珠熒光量子點技術(shù)檢測MTB中應(yīng)用受限。偶聯(lián)H8和多抗Pab的兩種免疫磁珠與3種功能化熒光量子點組合檢測，表明多抗Pab的特異性和親和性均高于H8，說明我們篩選獲得的結(jié)合肽H8雖與MTB有較強的結(jié)合活性，但其特異度還需進一步提高［5］。由于上述原因，6組組合下限檢測時，只有偶聯(lián)多肽H8的功能化熒光量子點與2種免疫磁珠組合檢測下限較高（均為102條菌/mL）,其余4組組合的檢測下限均不是很高（約105~106條菌/mL）。綜上所述，偶聯(lián)MTB結(jié)合肽H8的功能化熒光量子點，與兩種免疫磁珠組合檢測下限和特異性均較高，兩組組合均可作為免疫磁珠熒光量子點技術(shù)檢測MTB的最優(yōu)組合。本研究結(jié)果表明我們篩選獲得的多肽比市售的單克隆抗體具有更高的親和性和特異性，完全可以取代單抗，作為一種有效的MTB檢測用配體分子。但MTB結(jié)合肽H8同時與熒光量子點和免疫磁珠偶聯(lián)，可能會競爭同一結(jié)合位點，導(dǎo)致檢測效果不佳；而利用MTB結(jié)合肽H8與多抗Pab協(xié)同作用，可以增加對MTB的捕獲能力提高檢測的靈敏度，所以組合MNP－Pab＋QDH8是最佳組合。在本研究的基礎(chǔ)上，我們將進一步優(yōu)化該檢測技術(shù)，并用于更多不同類型標(biāo)本的檢測，詳見后續(xù)報道。參考文獻：BoWJ，HuZY，LiuZH，etal.PreparationonapatamersofIgGantibodiesfromTBpatientsanditsspecificityidentification[J].ChinJZoonoses，2011,27(12):31-35.(inChinese)柏文娟，胡忠義，劉忠華，等?結(jié)核患者血清IgG抗體適體的制備及特異性鑒定J].中國人獸共患病學(xué)報，2011，27(12):31-35.YangHS，HuZY，LiuZH，etal.Screeningoftuberculosisspecificantibodybindingpeptides[J].ChinJPreventMed，2011，45(1):12-16.(inChinese)楊煥森，胡忠義，劉忠華等，結(jié)核特異性抗體結(jié)合肽的篩選研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011,45(1):12-16.LeeWH，KimYG，ChungBG，etal.Nano／microfluidicsfordiagnosisofinfectiousdiseasesindevelopingcountries[J].AdvDrugDelivRev,2010,66:449-457.DOI:10.1016／j.addr.2009.11.016ThiruppathirajaC,KamatchiammalS,DaikkappanP,etal.SpecificdetectionofMycobacteriumsp.genomicDNAusingduallabeledgoldnanoparticlebasedelectrochemicalbiosensor[J].A-nalBiochem,2011,417:73-79.DOI:org／10.1016／j.ab.2011.05.034YangH,ZhangLT,LiLQ,etal.ScreeningofthebindingpeptidesofMycobacteriumtuberculosisH37Rv[J].ChinJTubercRespirDis,2011,34(3):192-196.(inChinese)楊華，張麗婷，李連青等，結(jié)核分枝桿菌H37RV結(jié)合肽的篩選研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2011,34(3):192-19.CuiZL，WangJ，HuZY.RapidcolorimetricmethodfortestingdrugsusceptibilityofMycobacteriumtuberculosisinliquidcultures[J].ChinJAntibiotics，2006，31(9):555-558.(inChinese)崔振玲，王潔，胡忠義.液體培養(yǎng)基比色法快速檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性[J]?中國抗生素雜志，2006,31(9):555-558.MaJW，F(xiàn)anQS，WangLH，etal.S