基因治療GeneTherapy的研究概況及前景展望

(GeneTherapy)的研究概況及前景展望摘要：基因治療(GeneTherapy)是一種新的治療手段，也是基因工程在應(yīng)用領(lǐng)域一項(xiàng)較為常見的技術(shù)。主要是指向靶細(xì)胞或組織中引入外源基因DNA或RNA片段,以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷,關(guān)閉或抑制異常表達(dá)的基因，從而達(dá)到治療遺傳性或感染性疾病的目的[1]它可以治療多種疾病，包括癌癥、遺傳性疾病、傳染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。癌癥基因治療是基因治療的主要應(yīng)用領(lǐng)域。過去幾年里，全球基因治療臨床試驗(yàn)取得了很大的進(jìn)步。實(shí)際上，基因治療也遇到了很多困難。未來，基因治療的主要目標(biāo)是發(fā)展安全和高效的基因?qū)胂到y(tǒng)，它們能將外源遺傳物質(zhì)靶向性地導(dǎo)入到特異的細(xì)胞。本文主要介紹基因治療的基本概念、基本方法及面臨的主要問題，就基因轉(zhuǎn)移的載體、基因表達(dá)的調(diào)控、基因治療的安全性等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述和評(píng)價(jià)，并探討今后基因治療的發(fā)展方向。關(guān)鍵詞:基因治療；基因?qū)胂到y(tǒng)；基因表達(dá)調(diào)控；安全性；發(fā)展方向21世紀(jì)是生物科學(xué)與生物技術(shù)的世紀(jì)，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)、反義核酸技術(shù)、RNAi技術(shù)等基因操作方法的發(fā)展與完善，采用分子生物學(xué)手段治療遺傳疾病、腫瘤、心血管和代謝性疾病等已成為本世紀(jì)的一大熱點(diǎn)領(lǐng)域⑵。從1990年美國FDA批準(zhǔn)第1項(xiàng)人類基因治療的臨床試驗(yàn)方案至今，基因治療的研究已經(jīng)走過了20年余的歷程，其研究迅速發(fā)展，已取得很多突破，但仍處于比較幼稚的階段，還不能成為臨床常規(guī)的治療手段［3］。目前，治療已成為一項(xiàng)跨世紀(jì)工程，越來越多的受到科學(xué)界的關(guān)注，已有少數(shù)有確切療效的臨床試驗(yàn)?，F(xiàn)將基因治療及其研究的現(xiàn)狀綜述如下。1基因治療的簡介及概況基因治療的概念經(jīng)典的基因治療指在基因水平上對(duì)遺傳缺陷進(jìn)行糾正。但臨床實(shí)踐表明，基因治療在后天獲得性疾病如腫瘤等方面的應(yīng)用，要遠(yuǎn)多于先天性疾病，所以現(xiàn)在基因治療已轉(zhuǎn)變?yōu)?為達(dá)到治療目的而在基因水平進(jìn)行的操作?；蛑委熞褟膶?duì)單基因缺陷性遺傳病的基因替代治療，拓展至對(duì)致病基因的修正和基因增強(qiáng)治療,以及采用外源調(diào)理性細(xì)胞因子基因、核酶類及反義核酸類基因藥物進(jìn)行治療⑷。1.2基因治療的種類⑸基因治療根據(jù)靶細(xì)胞的類型可分為生殖細(xì)胞(germcell)基因治療和體細(xì)胞(somaticcell)基因治療。從理論上講，體細(xì)胞基因治療只涉及體細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)變,不影響下一代,現(xiàn)已被廣泛接受做為嚴(yán)重疾病的治療方法之一,在現(xiàn)代倫理道德上是可行的。方法上易于施行，而且已取得了可喜的成果。根據(jù)基因轉(zhuǎn)移的途徑可將基因治療分為invivo(活體直接轉(zhuǎn)移,或稱一步法)和exvivo(回體轉(zhuǎn)移或稱二步法)。前者指將含外源基因的重組病毒、脂質(zhì)體或裸露的DNA直接導(dǎo)入體內(nèi)。后者通過選擇適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞,在體外進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移,篩選可表達(dá)外源基因的細(xì)胞,再將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移至體內(nèi)。體內(nèi)法則是直接在體內(nèi)改變與修復(fù)遺傳物質(zhì)，目前對(duì)其研究日益增多，可能將成為基因治療最有前途的方法?；蛑委煹牟呗愿鶕?jù)宿主病變的不同，基因治療的策略也不同,概括起來主要有下列四種：⑴基因替代(genereplacement)，去除整個(gè)變異基因，用有功能的正常外源基因取代之，使致病基因得到永久地更正。(2)基因修正(genecorrection)，指將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。(3)基因增強(qiáng)(geneaugmentation)，指將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞,目的基因的表達(dá)產(chǎn)物可以補(bǔ)償缺陷細(xì)胞的功能或使原有的功能得到加強(qiáng)。(4)基因抑制(geneconstraint)和基因失活(geneinactivation)，導(dǎo)入外源基因去干擾、抑制有害的基因表達(dá)?；蛑委煹幕经h(huán)節(jié)目的基因的選擇用于基因治療的目的基因選擇原則為:(1)該基因的異常是疾病發(fā)生的根源；(2)該基因遺傳的分子機(jī)制清楚；(3)基因已被克隆,一級(jí)結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控機(jī)制較為清楚；(4)可在體外操作,而且安全有效；(5)轉(zhuǎn)移基因在受體細(xì)胞內(nèi)最好能夠完整地、穩(wěn)定地整合并能適時(shí)適量表達(dá)功能性蛋白質(zhì)。隨著分子生物學(xué)與基因重組技術(shù)的發(fā)展，基因獲取的手段也逐步成熟。目前，獲取目的基因的主要方法有利用分子生物學(xué)手段分離和克隆目標(biāo)基因，如利用酶切或逆轉(zhuǎn)錄等方法，或采用人工手段合成目的基因片段。靶細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)靶細(xì)胞(又稱受體細(xì)胞)是接受外源基因的細(xì)胞，來源于被治療的對(duì)象。合適的靶細(xì)胞是基因治療成敗的關(guān)鍵之一，選擇時(shí)應(yīng)考慮疾病的性質(zhì)和部位，炫彩的容易程度，便于體外培養(yǎng)和遺傳操作，以及要有可行的轉(zhuǎn)移方法。根據(jù)疾病的性質(zhì)、基因治療的策略，靶細(xì)胞可以選擇外周血淋巴細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等?；蜣D(zhuǎn)移系統(tǒng)⑹基因治療載體可分為病毒型和非病毒型兩類。病毒型載體包括:逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒和疤疹病毒，目前最有效的方法是使用經(jīng)過改造的、具有穿膜特性的病毒作為載體，定向地將目的基因?qū)爰?xì)胞。然而由于人體自身具有抗病毒的免疫系統(tǒng)，使用病毒載體作為媒介來傳遞DNA時(shí)就不得不面對(duì)宿主的免疫反應(yīng)。非病毒型載體包括:脂質(zhì)體、裸露DNA和DNA包裝顆粒,范圍從裸DNA顯微注射，電激法、基因槍技術(shù)等各類物理學(xué)方法到聚陽離子賴氨酸或陽離子脂質(zhì)體。1.4.4目的基因的表達(dá)與調(diào)控早期基因治療的疾病主要選擇如肺囊性纖維化、ADA-SCID等遺傳缺陷性疾病,治療基因?qū)塍w內(nèi)后即使不進(jìn)行精確的調(diào)控也可獲得較好療效。而在用基因治療其它多種疾病時(shí)，對(duì)目的產(chǎn)物的需要量要求嚴(yán)格，若目的基因表達(dá)由載體或病毒啟動(dòng)子自發(fā)激活,表達(dá)不受控制，目的產(chǎn)物表達(dá)過度或不適當(dāng)，不僅對(duì)疾病治療不利，甚至可能引起致命的副作用，如糖尿病的胰島素基因治療、腎性貧血的EPO基因治療等。目的基因表達(dá)的組織、時(shí)序及水平上的嚴(yán)格調(diào)控是這類基因治療進(jìn)入臨床前必需解決的問題，即如何有效地調(diào)控外源基因在體內(nèi)的表達(dá)，使其控制在適度水平。目前為止，外源基因?qū)氩⒃诎屑?xì)胞中表達(dá)已獲得成功，但外源基因的表達(dá)量與生理水平卻依舊有較大差距。因此，外源基因的表達(dá)與調(diào)控是目前基因治療的難點(diǎn)與研究熱點(diǎn)。目前人們正在通過定點(diǎn)插入以及連接強(qiáng)啟動(dòng)子等方法來提高導(dǎo)入基因的表達(dá)水平⑺。2基因治療的應(yīng)用現(xiàn)狀基因治療在臨床上的應(yīng)用[5,8]單基因疾病從1990年第1例SCID-ADA基因治療方案至今，已有18種單基因遺傳病開展了基因治療臨床試驗(yàn)。主要為肺囊性纖維化、戈歇病、血友病、a-抗胰酶缺失和嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥(SCID-ADA、SCID-X)等。Marina等進(jìn)行了SCID-X的H期臨床試驗(yàn)，通過體外逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)細(xì)胞因子YC受體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)患者造血干細(xì)胞，然后回輸,結(jié)果從T、B、NK淋巴細(xì)胞的數(shù)量、功能以及抗原特異性反應(yīng)方面均達(dá)到了與正常人相當(dāng)?shù)某潭?且患者已能正常生活。單基因遺傳病基因治療的關(guān)鍵是外源基因能在體內(nèi)長期穩(wěn)定的表達(dá)。因此，選擇合適的轉(zhuǎn)移載體以及合適的靶細(xì)胞十分關(guān)鍵。腺病毒具有強(qiáng)的免疫原性，且其介導(dǎo)的外源基因不能整合，可能難以達(dá)到長期穩(wěn)定表達(dá)的要求。雖然Marina等成功地運(yùn)用了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，但由于其滴度及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低，只適于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，因而需要進(jìn)一步改進(jìn)。研究人員認(rèn)為,免疫原性低、可感染多種分裂相和非分裂相細(xì)胞、能夠整合且適于體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的腺相關(guān)病毒和慢病毒，可能是治療單基因遺傳病的理想載體。惡性腫瘤幾種腫瘤治療的途徑正在研究中。首先是增強(qiáng)腫瘤的免疫反應(yīng)；第二是導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞“自殺(suicide)”基因;第三抑制腫瘤細(xì)胞的生成，如導(dǎo)入抗癌基因和癌基因的反義基因。研究表明多種細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-4、腫瘤壞死因子(TNF)、Y-干擾素等基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，或腫瘤組織浸潤的淋巴細(xì)胞(TIL)等,經(jīng)擴(kuò)增后輸回人體，可以促進(jìn)腫瘤抗原和MHC(主要組織相容性復(fù)合物)的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)的能力。另一進(jìn)展是將MHC-I型基因用脂質(zhì)體包裹直接導(dǎo)入腫瘤內(nèi)以提高免疫反應(yīng)。免疫組化證實(shí),經(jīng)這樣處理后緩解的腫瘤內(nèi)有大量CD8+T細(xì)胞,提示該機(jī)制是CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)?！凹?xì)胞自殺”涉及插入單純皰疹病毒的胸腺核苷酸激酶(TK)基因。其原理為HSV-TK可將一種核酸類似物抗病毒藥物gancyclovier(GCV)磷酸化成一種細(xì)胞毒藥物,干擾靶細(xì)胞DNA合成,選擇性殺死分裂細(xì)胞。Culver等將HSV-TK基因?qū)肽孓D(zhuǎn)錄病毒載體,讓其在包裝細(xì)胞中復(fù)制包裝。然后把轉(zhuǎn)染后的包裝細(xì)胞直接注入膠質(zhì)瘤,一周后給GCV,使腫瘤基本消失。抑癌基因p53已被FDA批準(zhǔn)治療非小細(xì)胞肺癌患者,該病為p53基因缺陷。此外反義K-rasDNA已被注射到肺癌患者體內(nèi)，試圖抑制已活化的癌基因活性。AIDSAIDS是由HIV感染引起的。HIV是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒,與靶細(xì)胞膜上的CD4分子結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞,HIV基因組RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后整合至宿主染色體。HIV感染的基因治療的策略主要有抗病毒基因治療(細(xì)胞內(nèi)免疫)和基因免疫治療兩方面。前者指將人工構(gòu)建的一個(gè)重組基因?qū)胍赘屑?xì)胞內(nèi)，該重組的基因可在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)病毒基因的反義核酸或病毒蛋白的突變體，以便有效地干擾野生病毒的復(fù)制和增殖。如對(duì)HIV蛋白的基因修飾、反義RNA和核酶(ribozyme)等。后者包括體內(nèi)直接注射DNA(基因免疫接種)，以及轉(zhuǎn)移針對(duì)HIV-1抗原特異性的攜帶自殺基因的CD8+T細(xì)胞，以治療HIV感染。此外，阻斷HIV和CD4結(jié)合也是治療HIV感染的策略之一，即將重組的可溶性CD4基因直接注射或?qū)塍w外培養(yǎng)的人T細(xì)胞再輸回體內(nèi)?；蛑委熢谄渌I(lǐng)域中的應(yīng)用幾種釋放激素、凝血因子、抗凝血?jiǎng)┖推渌委熞蜃拥南到y(tǒng)正用于基因治療。當(dāng)這些基因被導(dǎo)入成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞后，他們的表達(dá)產(chǎn)物可在血液中檢測到。最近對(duì)小鼠的研究結(jié)果表明，成肌細(xì)胞是釋放重組蛋白的最佳靶細(xì)胞,它們可與鄰近的肌纖維隨機(jī)融合,并成為血管平滑肌組織中的一部分。如通過這種方式導(dǎo)入的人生長激素基因的小鼠，可在循環(huán)血液中檢測出表達(dá)產(chǎn)物達(dá)6個(gè)月之久。通過體外基因轉(zhuǎn)移制備工程細(xì)胞，將其植入腦內(nèi)，也正用于慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療，以恢復(fù)功能。如果這種基因轉(zhuǎn)移/移植的聯(lián)合技術(shù)被證明有效的話,則將提供一個(gè)治療諸如帕金森氏病和早老性癡呆等癥的新方法。3基因治療中存在的問題及前景存在的問題基因治療應(yīng)用到臨床只有短短幾年,雖然它對(duì)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)或臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展均起到了推動(dòng)作用，但應(yīng)清醒地看到，目前的基因治療尚存在許多問題?；蛑委煴旧泶嬖诘膯栴}盡管現(xiàn)代科技的發(fā)展使得基因治療日趨完善，但其仍存在目的基因少、缺乏高效的載體系統(tǒng)以及目的基因表達(dá)的可控性差等問題。因此，研究疾病的發(fā)病機(jī)制，更好地了解致病基因及其作用機(jī)理；提高基因轉(zhuǎn)移的效率、靶向性和安全性；深入研究基因的表達(dá)及其調(diào)控；建立良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為臨床應(yīng)用提供更可靠的數(shù)據(jù)等是目前基因治療研究中應(yīng)當(dāng)著力解決的問題⑼。倫理問題基因治療價(jià)格昂貴，并不是每個(gè)公眾所能享受的，這一點(diǎn)與醫(yī)學(xué)是一種社會(huì)公益性福利事業(yè)的本質(zhì)是相違背的。另外，就生殖細(xì)胞的基因治療而言，基因治療將改變性細(xì)胞中的DNA序列，并將這種改變傳遞給后代。同時(shí)，基因治療還會(huì)加大老齡化程度，進(jìn)而加重社會(huì)負(fù)擔(dān)。除此之外，基因治療還涉及患者知情權(quán)以及隱私問題等⑼。安全性問題基因治療的安全性是指基因治療應(yīng)確保不因外源基因的導(dǎo)入而引起新的有害遺傳變異，因此，在進(jìn)行基因治療時(shí)選擇一個(gè)安全有效的載體是相當(dāng)關(guān)鍵的，載體不當(dāng)引起的插入突變可能引發(fā)一個(gè)重要基因的失活，或者激活一個(gè)原癌基因，后果不堪設(shè)想。同時(shí)導(dǎo)入的外源基因一般不具有表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，其表達(dá)水平的高低可能會(huì)影響機(jī)體的一些生理活動(dòng)。此外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功使生殖細(xì)胞的基因治療成為可能，但這種治療所帶來的遺傳特征的變化是否會(huì)世代相傳，這個(gè)問題科學(xué)界仍持有不同的態(tài)度。前景展望基因治療將是醫(yī)學(xué)史上的一次革命,因?yàn)槿俗约?、甚至人的疾病組織（如腫瘤）本身成為“基因工程的藥廠”，生長出的藥物（基因產(chǎn)物）治療人的疾病。但是，關(guān)鍵問題是何時(shí)才能實(shí)現(xiàn)［10］。不能否認(rèn)過去幾十年基因治療取得的巨大成就，它已被看成是對(duì)先天和后天基因疾病的潛在有效的治療方法,并建立起安全有效的調(diào)控體系。從相對(duì)完善的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過渡到臨床治療實(shí)驗(yàn)階段，經(jīng)改進(jìn)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)顯然要比傳統(tǒng)方法更加安全。然而正當(dāng)基因治療展現(xiàn)出美好前景時(shí),對(duì)它的懷疑和信任相互之間的爭論愈加激烈，懷疑常處于上風(fēng)。盡管目前對(duì)于基因治療還有許多技術(shù)難題有待解決，但可以相信：隨著人類基因組計(jì)劃（通過破譯人體10萬個(gè)基因的全部核苷酸序列及搞清它的結(jié)構(gòu)和功能）的實(shí)施,基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的闡明，以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和轉(zhuǎn)基因方法的完善,基因治療必將成為21世紀(jì)人類攻克疑難病癥的一種常規(guī)治療手段［11］。參考文獻(xiàn)［1］張嬋，邵艷軍.基因治療的病毒載體系統(tǒng).生物技術(shù).2007,17（1）:91［2］陶銘.基因治療及其研究仃］.生物學(xué)通報(bào)，2008,43（4）：16-18.［3］陳詩書，戴冰冰.基因治療的研究現(xiàn)狀與評(píng)價(jià)J］.中華腫瘤雜志，2002，24(4)：313-315.[4]刁勇，王廣基，許瑞