檢驗技術PPT課件

1、一、顯微鏡一、顯微鏡 普通光學顯微鏡（light microscope）0 .2m 0 .2mm （油鏡）國產顯微鏡的油鏡常標有“油”字，國外產品則常用“oil”（oil Immersion）或“HI”（Hemcyeneous Immersion）字樣，以供識別 第1頁/共86頁一、顯微鏡一、顯微鏡 暗視野顯微鏡( dark - field microscope ) 鉤端螺旋體聚光器不同用途：觀察不染色標本活菌的形態(tài)、運動方式, 特別適合不染色螺旋體的檢查 第2頁/共86頁一、顯微鏡一、顯微鏡 相差顯微鏡（phase contrast microscope ）用途：觀察活細胞和未染色的生物標本

2、 相差物鏡環(huán)狀光闌合軸調中望遠鏡綠色的濾光片 第3頁/共86頁二、不染色檢查二、不染色檢查 觀察活體細菌的形態(tài)、大小、某些內部結構及運動方式, 但主要用于觀察細菌的動力。 懸滴法 壓滴法 注意事項：應選用新鮮幼稚的細菌培養(yǎng)物 觀察時應在20 以上的室溫中進行 細菌的真正運動和布朗運動的區(qū)別 第4頁/共86頁三、染色檢查法三、染色檢查法 （一）常用的染料(1 )單純染料 多為偶氮化合物, 化學親和力低, 不能與被染物結合形成鹽類, 不溶于水,但溶于脂溶劑, 其染色能力取決于能否溶于被染物, 如蘇丹染料。(2 )酸性染料 電離后帶色離子帶負電荷, 可與帶正電荷的物質結合。通常細菌均帶負電荷, 故不

3、易著色。如降低菌液的pH , 使其帶正電荷則可著色, 酸性染料如伊紅、剛果紅等。(3 )堿性染料 多以氯化物形式存在, 電離后帶色離子帶正電荷, 易與帶負電荷的物質結合而著色。由于細菌的等電點較低( pH2pH5)故在中性、堿性或弱酸性溶液中均帶負電荷,因而易與帶正電荷的堿性染料結合。堿性染料如亞甲藍、結晶紫和堿性復紅等。(4 )復合染料 是堿性染料與酸性染料的復合物, 故又稱為中性染料。如姬姆薩染料、瑞氏染料等。第5頁/共86頁三、染色檢查法三、染色檢查法（二）常用的染色法(1 )單染色法 是用一種染料染色的方法, 如用美藍或稀釋石炭酸復紅等, 使各種細菌均染成同一顏色, 故此法只能顯示細菌

4、的形態(tài)及大小, 對細菌鑒別價值不大。(2 )復染色法 是用兩種以上染料染色的方法, 此法除顯示細菌形態(tài)大小外, 還有鑒別細菌種類的價值, 因此也稱鑒別染色法。(3 )特殊結構染色法 細菌的某些結構, 如鞭毛、莢膜、細胞壁、芽孢及異染顆粒等, 用普通染色法不易著色, 故需用特殊染色法。這些染色法不僅能使特殊結構著色, 還可使特殊結構染成與菌體不同的顏色, 有利于觀察。在細菌檢驗工作中, 除異染顆粒染色法較常用外, 由于其他特殊結構染色操作費時, 故日常檢驗工作中較少使用這些特殊染色法。第6頁/共86頁三、染色檢查法三、染色檢查法（二）常用的染色法(4 )負染色法 是指背景著色而細菌本身不著色的染

5、色方法, 常用的有墨汁, 也可用酸性染料, 如剛果紅或水溶性苯胺黑等, 因酸性染料帶陰電, 故菌體不著色, 只能使背景著色。實踐中常用墨汁負染色法配合單染色法(如美藍)檢查細菌的莢膜, 背景呈黑色, 菌體染成藍色,莢膜不著色, 包繞在菌體周圍成為一層透明的空圈。(5 )熒光染色法 用熒光染料, 如金胺、吖啶橙等進行染色。此類染料分為酸性染料及堿性染料兩種, 易溶于水中, 離解出OH - 或H + 離子, 熒光染料在紫外線照射下, 能激發(fā)熒光。細菌用熒光染料著色后在熒光顯微鏡下檢查, 可在黑的背景中觀察到細菌發(fā)出的明亮熒光。第7頁/共86頁三、染色檢查法三、染色檢查法（三）鑒別染色 1、革蘭染色

6、法 第8頁/共86頁三、染色檢查法三、染色檢查法（三）鑒別染色 2、抗酸染色1 1）初染）初染用玻片夾夾持涂片標本，滴加石炭酸復紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現蒸汽即暫時離開，若染液蒸發(fā)減少，應再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標本冷卻后用水沖洗。 2 2）脫色）脫色3%鹽酸酒精脫色30秒1分鐘；用水沖洗。 3 3）復染）復染用堿性美蘭溶液復染1分鐘，水洗，用吸水紙吸干后用油鏡觀察。 第9頁/共86頁第10頁/共86頁第三節(jié) 細菌的分離培養(yǎng)方法Bacterium culture 目的：為了從樣本中獲得活的純化的細菌，以便作進一步的研究和鑒定。第11頁/共86頁 培養(yǎng)基制備 細

7、菌接種方法 細菌培養(yǎng)方法 細菌的生長現象第12頁/共86頁一、培養(yǎng)基制備一、培養(yǎng)基制備 培養(yǎng)基（culture medium）是指人工配制的供細菌生長繁殖需要的各種營養(yǎng)物質配制而成的基質。（一） 培養(yǎng)基的種類（二）培養(yǎng)基的主要成分及其作用第13頁/共86頁（一）（一） 培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的種類1、按用途分類1) 基礎培養(yǎng)基： 如普通肉湯、營養(yǎng)瓊脂等。2) 營養(yǎng)培養(yǎng)基： 如血液瓊脂培養(yǎng)基、血清肉湯培養(yǎng)基等。3) 增菌培養(yǎng)基： 多為液體培養(yǎng)基, 主要目的是為了增加標本中目的菌的數量, 以提高目的菌檢出率所用的培養(yǎng)基。該類培養(yǎng)基內一般均含有抑制劑, 且具有選擇性抑制作用的抑制劑。4) 選擇性培養(yǎng)基：

8、 在培養(yǎng)基中加有除營養(yǎng)成分以外的抑制物質, 使之具有選擇性, 有利于目的菌的檢出和識別, 而抑制其他非目的菌的生長或使其生長不佳。此類培養(yǎng)基多為固體培養(yǎng)基, 如HE培養(yǎng)基等。5) 鑒別培養(yǎng)基: 主要供細菌生化反應試驗用, 此類培養(yǎng)基中加有某些特定成分, 如糖、醇等, 用于檢查各種細菌的生化反應, 以鑒別和鑒定細菌, 如糖發(fā)酵培養(yǎng)基、七葉苷培養(yǎng)基等。6) 專用培養(yǎng)基: 有的細菌在培養(yǎng)中需要一些特殊的物質供其生長繁殖, 對于這類細菌應用專門的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。如培養(yǎng)結核分枝桿菌的羅氏培養(yǎng)基, 培養(yǎng)厭氧菌的庖肉培養(yǎng)基等。第14頁/共86頁（一）（一） 培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的種類2、按物理性狀分類 液體培

9、養(yǎng)基： 用于增菌, 做生化試驗 半固體培養(yǎng)基： 用于觀察細菌的動力、保存菌種用 固體培養(yǎng)基： 用于分離培養(yǎng)。分為平板、斜面、高層及高層斜面3 、按成分分類1) 合成培養(yǎng)基： 合成培養(yǎng)基是由化學物質和成分已知的各種物質所組成,。由于所用物質是已知的, 因此, 各批培養(yǎng)基的性質是一致的。所以, 在研究細菌的營養(yǎng)要求、代謝、分類鑒定、生物量測定、菌種選育、遺傳分析及藥物對細菌的作用等, 宜用合成培養(yǎng)基。2) 天然培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基指培養(yǎng)基由含有的化學成分不完全清楚, 或各批物質的成分很難一致的天然物質所組成, 如蛋白胨、牛肉膏、血液、雞蛋、馬鈴薯等。但這些物質成本較低,在細菌學研究中, 一般均以這

10、種培養(yǎng)基為常用。第15頁/共86頁（二）培養(yǎng)基的主要成分及其作用（二）培養(yǎng)基的主要成分及其作用1、營養(yǎng)物質（1）蛋白胨 蛋白胨是培養(yǎng)基中作為氮源應用最廣泛的基本成分，用于合成菌體蛋白質,酶類以及細菌的生長繁殖。特點：易溶于水, 吸水性強；具有緩沖作用。（2）肉浸液 可作為細菌的氮源和碳源。但因含氮物質較少, 尚不能滿足細菌生長的需要。因而在制作培養(yǎng)基時, 一般需加入1%2%的蛋白胨及0 .5%的氯化鈉。（3）牛肉浸膏 肉浸液加熱濃縮而成的膏狀制品。肉浸液中的不耐熱物質如糖類等已被破壞, 因而其營養(yǎng)價值不及肉浸液, 但因其不含糖, 故可作為腸道細菌鑒別培養(yǎng)基的基礎成分。由于牛肉浸膏使用方便, 所

11、以常用于制備培養(yǎng)基。 第16頁/共86頁（二）培養(yǎng)基的主要成分及其作用（二）培養(yǎng)基的主要成分及其作用1、營養(yǎng)物質（4) 糖類 糖類是作為細菌生長繁殖所需的碳源、能源的基本成分。最常用的是葡萄糖和蔗糖。其他的糖類和醇類主要用于發(fā)酵反應以及鑒定細菌。糖不耐熱, 過久的高熱會被破壞,在堿性及與氮源一起高溫的情況下, 破壞更快, 因此, 制備這類培養(yǎng)基時, 通常不用高溫, 并與培養(yǎng)基中其他成分分別滅菌。（5)血液 培養(yǎng)基中加入血液, 可增加蛋白質、多種氨基酸、糖類、無機鹽等營養(yǎng)成分, 同時還能提供輔酶(如V 因子)、血紅素(X 因子)等特殊生長因子, 供某些對營養(yǎng)要求高的細菌生長繁殖之用。此外, 血液

12、在培養(yǎng)基中還可以用于測定細菌的溶血作用,作為細菌鑒定的一項指標。（6）雞蛋和動物血清 雞蛋和動物血清不是培養(yǎng)基的基本成分, 但對一部分細菌來說是必需的營養(yǎng)成分, 他們可以作為養(yǎng)料直接被細菌利用。故可利用此制備特殊的培養(yǎng)基, 如培養(yǎng)結核桿菌的羅氏培養(yǎng)基和白喉棒狀桿菌的呂氏血清培養(yǎng)基等。此外, 雞蛋和血清還具有凝固劑的作用, 便于觀察細菌的菌落形態(tài)和生長情況。第17頁/共86頁（二）培養(yǎng)基的主要成分及其作用（二）培養(yǎng)基的主要成分及其作用1、營養(yǎng)物質（7） 生長因子 在細菌生長繁殖過程中, 需要多種維生素等生長因子, 根據化學結構及代謝功能, 可將其分為三大類, 即維生素、氨基酸和嘌呤、嘧啶。細菌對

13、這些物質的需要量不大, 但如缺少, 某些細菌就不能生長。通常在肝浸液、肉浸液、酵母浸液和血液中含有這些生長因子的大部分, 但有時需要另外加入。（8） 無機鹽類 細菌生長繁殖需要多種無機鹽類, 如鉀、鈉、鎂、鐵、磷酸鹽、氯化物等。其中, 有的需要量極微, 如錳、鈷、鈣、銅等。這些無機離子的作用是，作為酶的激活劑和維持一定的滲透壓，或具有緩沖作用。2、水分 蒸餾水、去離子水或自來水。第18頁/共86頁（二）培養(yǎng)基的主要成分及其作用（二）培養(yǎng)基的主要成分及其作用3、凝固物質 最常用的是瓊脂, 特殊目的也用明膠等。瓊脂是從石花菜等海藻中提取出來的一種膠狀物質, 其化學成分主要為多糖類, 一般不被細菌分

14、解利用, 故無營養(yǎng)價值, 純屬培養(yǎng)基中的賦形劑。4、抑制劑和指示劑 抑制劑的作用。常用的抑制劑有膽鹽、煌綠、玫瑰紅酸、亞硫酸鈉、四硫磺酸鹽、疊氮鈉及一些染料和某些抗生素等。在選擇抑制劑時需注意抑制劑應是具有選擇性的抑制作用。 指示劑的作用。為了方便了解和觀察細菌是否利用和分解培養(yǎng)基中糖(醇)類物質, 而在培養(yǎng)基中加入的成分。常用的指示劑多為酸堿指示劑, 如酚紅、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍、中性紅、甲基紅、酸性復紅等。根據細菌分解糖( 醇)類物質產酸的情況, 選擇適當的指示劑, 亞甲藍為常用的氧化還原指示劑。此外, 一些新的氧化還原指示劑如四氮唑鹽類等, 也已廣泛用于細菌快速培養(yǎng)和鑒定, 以及快速藥

15、敏試驗方面。第19頁/共86頁（三）制備培養(yǎng)基的一般程序（三）制備培養(yǎng)基的一般程序無菌試驗標準菌株驗證保存第20頁/共86頁二、細菌接種方法二、細菌接種方法 待檢標本的性質不同, 培養(yǎng)的目的及所用培養(yǎng)基的種類不同 （一）平板劃線接種法（二）斜面接種法（三）半固體培養(yǎng)接種法（四）液體培養(yǎng)基接種法第21頁/共86頁（一）平板劃線接種法 是常用的分離培養(yǎng)方法, 其目的就是使標本或培養(yǎng)物中混雜的多種細菌在培養(yǎng)基表面分散生長, 各自形成彼此分開的菌落, 以便根據菌落的形態(tài)和特征, 挑選所需的單個菌落, 經移種獲得純種細菌。 曲線接種法 分區(qū)劃線接種法 棋盤格劃線接種法 平板涂布接種法第22頁/共86頁二

16、、細菌接種方法二、細菌接種方法（二）斜面接種法 常用于細菌的傳代、純培養(yǎng)、菌種的保存及細菌的某些鑒別試驗。 劃線接種法 穿刺劃線接種法 第23頁/共86頁二、細菌接種方法二、細菌接種方法（三）半固體培養(yǎng)基接種法 用于觀察細菌動力和保存菌種 （四）液體培養(yǎng)基接種法第24頁/共86頁三、細菌培養(yǎng)方法三、細菌培養(yǎng)方法溫度需氧培養(yǎng)法二氧化碳培養(yǎng)法厭氧培養(yǎng)法氣體CO2 孵箱法燭缸法化學法第25頁/共86頁四、細菌的生長現象四、細菌的生長現象（一）細菌在固體培養(yǎng)基上的生長現象 1、細菌在營養(yǎng)瓊脂平板上的生長現象1) 菌落形狀 為菌落的幾何形狀及表面隆起情況, 如圓形、不整形、扁平、凸起、凹面等。2) 菌落

17、大小 以毫米(mm) 計算。3) 表面性狀 光滑、粗糙、有無光澤等。4) 邊緣情況 整齊、不整齊、鋸齒狀等。5) 顏色 白色、黃色、無色、灰色等。6) 透明度 透明、不透明、半透明等。7) 質地 硬、軟、脂狀、磨狀等。8) 粘度 奶油狀、粘液狀、膜狀易碎等。9) 乳化性 指在生理鹽水中, 將一菌落在鹽水中研磨形成均勻乳狀或為顆粒狀的程度。 第26頁/共86頁四、細菌的生長現象四、細菌的生長現象（一）細菌在固體培養(yǎng)基上的生長現象2、細菌在鑒定培養(yǎng)基上的特征（1）血平板 按溶血情況分類， 根據鏈球菌在血瓊脂平板上溶解紅細胞的能力分為甲型()乙型()丙型()鏈球菌三大類。 第27頁/共86頁四、細菌

18、的生長現象四、細菌的生長現象（一）細菌在固體培養(yǎng)基上的生長現象2、細菌在鑒定培養(yǎng)基上的特征（2）卵黃瓊脂產氣莢膜梭菌產生卵磷脂酶將可溶性的磷脂酰膽堿分解生成磷酸膽堿和不溶性甘油酯形成乳白色的混濁帶。 肉毒梭菌可產生脂酶，作用于卵黃中的游離脂肪，產生甘油和不溶性的游離脂肪酸，在菌落周圍培養(yǎng)基中形成局限的不透明區(qū)，并在菌落表面產生一層珠光層（為一薄脂肪酸，其融點在37以下，不能進入培養(yǎng)基，只能漂浮在菌落表面）第28頁/共86頁四、細菌的生長現象四、細菌的生長現象（一）細菌在固體培養(yǎng)基上的生長現象2、細菌在鑒定培養(yǎng)基上的特征（3) 蛋白水解作用 在菌落周圍出現清晰的環(huán)。（4) 色素 細菌在生長過程中

19、可產生色素, 水溶性色素溶在培養(yǎng)基中, 如綠膿色素、熒光色素等, 使培養(yǎng)基著色, 而脂溶性色素則使細菌菌落著上顏色, 如金黃色葡萄球菌的金黃色菌落。（5) 氣味 有些細菌在生長過程中可產生氣味, 再結合細菌的生活特性, 有助于細菌的鑒定。能產生特殊氣味的細菌有: 假單胞菌屬細菌可產生葡萄汁氣味; 變形桿菌產生巧克力燒焦的臭味; 鏈球菌產生地窖里的霉臭; 梭菌可產生糞臭、腐敗味; 產黑色素類桿菌屬細菌產生辛辣味等。第29頁/共86頁四、細菌的生長現象四、細菌的生長現象（二）細菌在液體培養(yǎng)基上的生長現象(1 )發(fā)育程度 有無生長及生長程度, 以微弱、中等、旺盛來表示。(2 )渾濁度 有無渾濁以及渾

20、濁的程度( 一般以混、中等、微渾、透明表示) ; 均勻渾濁、有顆粒; 絮狀生長。(3 )液體表面性狀 有無表面生長以及生長的性狀, 如膜狀( 厚薄)、環(huán)狀、皺狀、是否光滑或呈顆粒狀。(4 )其他 有無色素, 有無氣味, 有無產酸情況, 有無氣體產生。第30頁/共86頁四、細菌的生長現象四、細菌的生長現象（三）細菌在半固體培養(yǎng)基上的生長現象 主要用于細菌動力的觀察, 有動力的細菌除在穿刺線有生長外, 在穿刺線的周圍均可見渾濁和細菌生長的小菌落; 無動力的細菌僅在穿刺線上有生長, 周圍的培養(yǎng)基透明清晰。 第31頁/共86頁第七節(jié) 細菌數量的測定物理計數法生物計數法 細菌數量的測定不僅可用于了解樣品

21、被細菌污染的程度, 判斷樣品的衛(wèi)生狀況, 確定食物中毒的種類, 也可用于確定實驗菌的濃度, 以便進行各種實驗, 如細菌的藥物敏感實驗、消毒劑的鑒定等。 第32頁/共86頁一、物理計數法一、物理計數法（一）Breed 計數法 每毫升菌數=N4104 d2式中N: 每視野所數平均菌數。d: 視野直徑。（二）比濁管計數法 第33頁/共86頁一、物理計數法一、物理計數法（三）分光光度計測定法 每種細菌細胞能吸收和散射通過它們的光, 每種菌的散射光強及吸收光度與細胞總數有相對應的關系。菌體愈多, 菌懸液濁愈大, 散射及吸收光愈多。利用分光光度計測定菌懸液減少光線透過的程度, 用吸光度( A) 表示 第3

22、4頁/共86頁二、生物計數法二、生物計數法 生物計數法是利用各種培養(yǎng)方法檢測樣本中細菌的數目, 又稱活菌計數法。假定每一個存活細菌發(fā)育成一個菌落, 則計數培養(yǎng)基上生長的菌落數即為樣品中活菌數。 （一）半定量計數法 本法是供尿液半定量細菌計數用。取未經沉淀的尿液0 .01ml 或0 .001ml 于定量接種環(huán)上, 在瓊脂平皿中心劃一條線, 在初次劃線的基礎上成直角均勻的連續(xù)劃線涂布培養(yǎng)物, 然后使平皿轉動90o 再劃線, 接種物完全覆蓋瓊脂表面。第35頁/共86頁二、生物計數法二、生物計數法（二）傾注平板法 （三）旋管計數法 本法是將稀釋好的樣本接種于裝有溶化培養(yǎng)基的試管(或小瓶)內, 然后作水

23、平轉動使培養(yǎng)基凝固, 經孵育后計數菌落。具體操作如下:在25ml 螺帽試管(或小瓶) 中裝2ml4ml 培養(yǎng)基(培養(yǎng)基應比平常多加0 .5%1%的瓊脂) , 在水浴中融化并冷卻至45 , 取稀釋樣液0 .1ml 加入培養(yǎng)基管中, 然后進行水平旋轉, 直至瓊脂在管壁凝固成均勻的薄層。然后倒置孵育, 使冷凝水集于頸部, 避免菌落在瓊脂表面蔓延。計數時, 沿培養(yǎng)管的長軸平行劃一線, 旋轉試管, 在低倍鏡下進行計數。 第36頁/共86頁二、生物計數法二、生物計數法（四）滴液計數法（五）瓊脂表面計數法 第37頁/共86頁二、生物計數法二、生物計數法（六）膜濾過濾計數法第38頁/共86頁二、生物計數法二、

24、生物計數法（七）微菌落快速計數法 此法需醋酸纖維素薄膜及透明固定液( 95%乙醇80ml 與冰醋酸20ml 混和而成)。測定時, 將滅菌濾紙放入滅菌培養(yǎng)皿中, 倒入適量肉湯培養(yǎng)基浸潤制成培養(yǎng)襯墊。醋酸纖維膜按需要剪成適當大小并打上加樣標記。對于菌濃度 103 cfu/ ml 的標本, 則將膜先貼在培養(yǎng)襯墊上, 加樣10l , 接種后37培養(yǎng)5 小時, 取下膜放玻片上加熱干燥, 然后放入透明液中0 .5min , 再貼玻片上, 加熱使其完全透明, 最后用結晶紫液染色, 水洗后鏡檢, 用低倍鏡對形成的微菌落進行計數。此法最大的優(yōu)點是省時, 特別適合對臨床標本( 如尿液) 進行細菌菌數的測定。第39

25、頁/共86頁二、生物計數法二、生物計數法（八）最可能數(most probable numbe r ,MPN)的估計 這種方法對樣品進行連續(xù)系列梯度稀釋，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應呈陽性管數的出現率，用概率論來推算樣品中菌數最近似的數值。對某種細菌選擇性計數對菌數少的樣品進行選擇性計數第40頁/共86頁第五節(jié) 細菌的血清學檢驗 用含有已知特異性抗體的免疫血清, 與從樣本中分離培養(yǎng)出的未知純種細菌進行血清學試驗, 可以確定致病菌的種或型, 此種血清學試驗稱為血清學鑒定( serological identity ) , 常用方法是玻片凝集試驗。 例如：沙門菌血清學鑒定主要借助于沙門菌O抗原

26、多價血清與O、H、Vi抗原的單價因子血清 生化和形態(tài)疑似A-F組多價“O”診斷血清“+”“-”Vi凝集試驗不同“O”群的單價因子血清多價H血清H單因子血清第41頁/共86頁第42頁/共86頁第五節(jié) 細菌的血清學檢驗 沙門菌具有和其他腸桿菌科細菌類似的抗原結構，如菌體抗原(O)，鞭毛抗原(H)和表面抗原(Vi)，菌體抗原是作沙門菌血清學分型的主要依據，其化學成分是脂多糖，現已發(fā)現60多種菌體抗原，有些沙門菌的菌體抗原可在生長繁殖中發(fā)生量的變異，沙門菌的鞭毛抗原為蛋白質，根據其鞭毛抗原的特性，可將其分為相菌和相菌，相菌可與同種H因子抗血清發(fā)生凝集反應;相菌可在含同種H因子抗血清的培養(yǎng)基中誘生，它們

27、失去與同種H因子抗血清發(fā)生凝集反應的能力，可見，相菌的鞭毛抗原特異性較強，而相菌的鞭毛抗原特異性較弱。 第43頁/共86頁 O抗原：為脂多糖，性質穩(wěn)定。能耐100達數小時，不被乙醇或0.1%石炭酸破壞。決定O型原特異性的是脂多糖中的多糖側鏈部分，以1、2、3等阿拉伯數字表示。例如乙型副傷寒桿菌有4、5、12三個。鼠傷寒桿菌有1、4、5、12四個；豬霍亂桿菌有6、7二個。其中有些O抗原是幾種菌所共有，如4、5為乙型副傷寒桿菌和鼠傷寒桿菌共有，將具有共同O抗原沙門氏菌歸為一組，這樣可將沙門桿氏菌屬分為AZ、O51O63、O65O67共有42組。我國已發(fā)現26個菌組、161個血清型。使人類致病的沙門

28、氏桿菌大多屬于AF組。O抗原刺激機體主要產生lgM抗體。 第44頁/共86頁 H抗原：為蛋白質，對熱不穩(wěn)定，60經15分鐘或乙醇處理被破壞。具有鞭毛的細菌經甲醇液固定后，其O抗原全部被H抗原遮蓋，而不能與相應抗O抗體反應。H抗原的特異性取決于多肽鏈上氨基酸的排列順序和空間構型。 沙門氏桿菌的H抗原有兩種，稱為第1相和第2相。第1相特異性高，又稱特異相，用a、b、c等表示，第2相特異性低，為數種沙門氏桿菌所共有，也稱非特異相，用1、2、3等表示。具有第1相和第2相H抗原的細菌稱為雙相菌，僅有一相者稱單相菌。每一組沙門氏桿菌根據H抗原不同，可進一步分種或型。H抗原刺激機體主要產生lgG抗體。 第4

29、5頁/共86頁 Vi抗原：因與毒力有關而命名為Vi抗原。由聚-N-乙酰-D-半乳糖胺糖醛酸組成。不穩(wěn)定，經60加熱、石碳酸處理或人工傳代培養(yǎng)易破壞或丟失。新從患者標本中分離出的傷寒桿菌、丙型副傷寒桿菌等有此抗原。Vi抗原存在于細菌表面，可阻止O抗原與其相應抗體的反應。Vi抗原的抗原性弱。當體內菌存在時可產生一定量抗體；細菌被清除后，抗體也隨之消失。故測定Vi抗體有助于對傷寒帶菌者的檢出。 第46頁/共86頁第五節(jié) 細菌的血清學檢驗 用已知的細菌或其特異性抗原檢測患者體液中有無相應特異抗體和其抗體效價的動態(tài)變化, 作為某些傳染病的輔助診斷。一般采取病人的血清進行試驗, 故這類方法通常稱為血清學診

30、斷( serological diagnosis) , 常用方法是試管凝集試驗。 第47頁/共86頁第一節(jié)第一節(jié) 細菌噬菌體分型技術細菌噬菌體分型技術一、概述（一）噬菌體化學組成：化學組成：噬菌體主要由核酸和蛋白質組成。核酸為噬菌體的遺傳物質，為DNA或RNA，并由此將噬菌體分成DNA噬菌體和RNA噬菌體。蛋白質構成噬菌體頭部的衣殼及尾部，起著保護核酸的作用，并決定噬菌體外形和表面特征。抗原性：抗原性：噬菌體具有抗原性，能刺激集體產生特異性抗體。抵抗力：抵抗力：噬菌體對理化因素及多數化學消毒劑的抵抗力比一般細菌的繁殖體強，75 30min滅活。噬菌體能耐受低溫和冰凍，但對紫外線和X射線敏感。第

31、48頁/共86頁第一節(jié)第一節(jié) 細菌噬菌體分型技術細菌噬菌體分型技術一、概述（一）噬菌體毒性噬菌體（virulent phage）能在宿主菌細胞內復制增殖，產生許多子代噬菌體，并最終裂解細菌，稱為毒性噬菌體溫和噬菌體（temperate phage）/溶原性噬菌體（lysogenic phage）噬菌體基因與宿主菌染色體整合，不產生子代噬菌體，但噬菌體DNA能隨細菌DNA復制，并隨細菌的分裂而傳代第49頁/共86頁第50頁/共86頁第一節(jié)第一節(jié) 細菌噬菌體分型技術細菌噬菌體分型技術一、概述噬菌現象噬菌現象液體培養(yǎng)基 混濁 澄清固體培養(yǎng)基中，出現噬菌斑（plaque）一定體積內的噬斑形成單位數目（

32、pfu）第51頁/共86頁prophage: 整合在細菌基因組中的噬菌體基因組溶原性細菌第52頁/共86頁第一節(jié)第一節(jié) 細菌噬菌體分型技術細菌噬菌體分型技術（二）噬菌體在細菌的鑒定與分型方面的應用 高度特異性-分類 型特異性-分型第53頁/共86頁第一節(jié)第一節(jié) 細菌噬菌體分型技術細菌噬菌體分型技術四、細菌的噬菌體分型技術（一）培養(yǎng)基（二）噬菌體和宿主菌 制備符合要求的RTD噬菌體 確認宿主菌的裂解模式（三）噬菌體的增殖 液體增殖法 固體增殖法第54頁/共86頁第一節(jié)第一節(jié) 細菌噬菌體分型技術細菌噬菌體分型技術四、細菌的噬菌體分型技術（四）細菌的噬菌體分型方法的操作程序單菌落培養(yǎng)物雙層瓊脂法（菌

33、苔）滴加噬菌體培養(yǎng)結果觀察大于20個噬菌斑：+融合性裂解(CL) 次融合性裂解( CL)半融合性裂解( SCL)不透明融合性裂解( OL )第55頁/共86頁第二節(jié) 細菌素分型技術一、概述細菌素（bactericin）是某些細菌產生的蛋白類抗菌物質，這種物質只對產生菌親緣關系近的細菌有抗菌作用，而對產生菌本身不敏感。產生細菌素受質?？刂啤？蛇M行細菌分型和流行病學調查大腸菌素、綠膿菌素、葡萄球菌素與敏感菌特異受體結合，觀察抑菌斑第56頁/共86頁第二節(jié) 細菌素分型技術二、細菌素的分型方法（一）、細菌素分型試驗法（二）平板交叉劃線分型法（三）細菌素產生菌的分型法能被X型細菌素所抑制者即為X型菌制備

34、細菌素（誘導劑）細菌素敏感試驗細菌素分型試驗第57頁/共86頁第三節(jié) 細菌的藥物敏感試驗與分型一、概述 細菌的藥物敏感試驗(drug susceptibility test,簡稱藥敏試驗) 是指在體外測定藥物抑制或殺死細菌能力的試驗。 紙片擴散法（K-B法） 稀釋法（肉湯、瓊脂稀釋法） 第58頁/共86頁第三節(jié) 細菌的藥物敏感試驗與分型二、紙片擴散法（disc agar diffusion test, K-B法）（1)原理：是將含有定量抗菌藥物紙片(藥敏紙片)貼在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，其濃度逐漸遞減，使紙片周圍的敏感細菌在一定距離內的生長受到抑制，形成抑菌圈，再測量

35、抑菌圈的直徑來判定待檢菌對被測藥物的敏感程度。（2）優(yōu)點：簡單易行、價格便宜、藥物選擇性靈活，適用對生長快的細菌進行藥敏試驗。第59頁/共86頁第三節(jié) 細菌的藥物敏感試驗與分型二、紙片擴散法（3）方法藥敏紙片 培養(yǎng)基（M-H）菌液 1)藥敏試驗標準比濁管的制備:0.048m0l/L(1.175%)氯化鋇0.5m1加0.18m0l/L(1%)硫酸溶液99.5ml充分混勻，其濁度為0.5麥氏比濁標準（約108），分裝試管，置室溫下暗處保存。使用前應充分混勻，每半年重配一次。 第60頁/共86頁第三節(jié) 細菌的藥物敏感試驗與分型二、紙片擴散法（3）方法2)被檢菌液的制備:用接種環(huán)挑取已分純的被檢菌菌落

36、4-5個，接種于3-5mlMH肉湯，35培養(yǎng)4小時。鏈球菌屬和嗜血桿菌屬需在5%羊血MH肉湯中培養(yǎng)過夜，淋病奈瑟菌需在5%-7%C02條件下培養(yǎng)。用生理鹽水或肉湯校正菌液濃度至0.5麥氏比濁標準，校正后的菌液應在15分鐘內接種。3)用無菌棉拭蘸取制備好的菌液，在管內壁擠去多余菌液均勻涂布接種于瓊脂表面，一般涂布3次，每次平板旋轉60度，最后沿平板內沿涂抹一周，置室溫干燥30分鐘后，用無菌鑷子或貼紙機將藥敏紙片緊貼于含菌瓊脂表面。紙片位置要適當，各紙片中心距離不小于24mm，紙片距平皿內緣應大于l5mm。直徑9Omm的平皿可貼6張紙片，貼后要盡量避免移動，置于35培養(yǎng)16-18小時觀察記錄結果。

37、第61頁/共86頁MHMH平板的厚度要求平板的厚度要求4mm4mm第62頁/共86頁第63頁/共86頁菌液濃度菌液濃度0.50.5麥氏單位麥氏單位, ,無菌棉簽蘸取菌液無菌棉簽蘸取菌液第64頁/共86頁均勻涂布均勻涂布第65頁/共86頁貼紙片畢貼紙片畢, ,輕輕按壓輕輕按壓第66頁/共86頁也可以用紙片分配器貼紙片也可以用紙片分配器貼紙片第67頁/共86頁用游標卡尺量取直徑用游標卡尺量取直徑第68頁/共86頁第三節(jié) 細菌的藥物敏感試驗與分型二、紙片擴散法（4）結果 一般宜在黑色無反光背景上觀察，如培養(yǎng)基含有血液須打開皿蓋觀察，測量抑菌圈直徑(單位為mm)，判斷結果。每批試驗應做標準菌株對照，只有對照菌株的敏感度符合標準，實驗結果才可靠。 根據最新NCCLS標準指南判斷出:S或I或R第69頁/共86頁第70頁/共86頁第71頁/共86頁第三節(jié) 細菌的藥物敏感試驗與分型三、稀釋法是體外定量測定抗菌藥物抑制細菌生長活性的方法。液體稀釋法和固體稀釋法 將藥物按一定規(guī)律稀釋成一系列濃度后, 與等量的細菌作用, 經培養(yǎng)后觀察其能抑制細菌生長的最低濃度即MIC（minimal inhibitory concent