細(xì)菌實驗診斷技術(shù)與量控制

實訓(xùn)細(xì)菌實驗診斷技術(shù)與質(zhì)量控制

第一頁，共34頁。

細(xì)菌感染的檢驗：是指樣品的采集送檢、處理，運用表型和遺傳學(xué)方法檢查病原體的特征作出結(jié)果報告的全過程。1.保持檢驗過程的階段性、快速性和連續(xù)性顯微鏡檢查、分離培養(yǎng)、血清學(xué)實驗、生化和分子生物學(xué)試驗、藥敏實驗等。如能初步鑒定，可分別先后及時向臨床提供信息。第一節(jié)細(xì)菌感染的檢驗原則第二頁，共34頁。2.根據(jù)診斷目的決定鑒定的水平（1）病原學(xué)診斷→鑒定到細(xì)菌的種；（2）指導(dǎo)臨床治療→進(jìn)行直接或間接藥物敏感實驗（3）流行病學(xué)監(jiān)控和調(diào)查→鑒定到型（4）病原學(xué)研究、療效監(jiān)控→分子水平的檢測3.了解檢驗對象的背景（1）病人的背景（2）標(biāo)本的來源第三頁，共34頁。

1）盡早采集

一旦懷疑細(xì)菌感染，應(yīng)及時采集標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗，盡早獲得病原學(xué)診斷和抗生素敏感資料，對細(xì)菌感染的治療具有極其重要意義；2）標(biāo)本采集盡量在用藥前進(jìn)行；3）根據(jù)可疑病原菌和實驗方法的不同選擇合適的采集時期；

【例如】腸傷寒病程第1周采血培養(yǎng)陽性率最高，第2周開始下降；骨髓培養(yǎng)陽性率的趨勢和血培養(yǎng)一致但始終高于血培養(yǎng)，且持續(xù)至第五周陽性率仍達(dá)52%；糞便培養(yǎng)陽性率在第2～4周最高。4.重視樣品的采集和送檢☆第四頁，共34頁。4）注意無菌操作，盡量避免雜菌污染；5）注意采集的方法和部位；6）標(biāo)本必須新鮮，及時運送；7）標(biāo)本的保存、處理要嚴(yán)格。5.必須用純培養(yǎng)物鑒定——選用單個菌落第五頁，共34頁。1）選擇有價值的試驗：所選項目大結(jié)果可能為陰性/陽性，但陽性/陰性率應(yīng)大于90%，否則無意義。2）選擇快速簡便的項目：鞭毛染色、氧化酶、凝固酶、觸酶、O/F等應(yīng)做為首選項目。

3）一種試驗有多種方法時，應(yīng)了解不同試驗的敏感性和特異性。

6.鑒定實驗的選擇

第六頁，共34頁。第二節(jié)細(xì)菌感染的檢驗程序和方法臨床標(biāo)本預(yù)處理增菌接種培養(yǎng)基，分離單個菌落各種鑒定試驗涂片染色快速診斷試驗生化試驗血清學(xué)實驗涂片染色藥敏試驗動物試驗初步診斷報告最終診斷報告

一、一般檢驗程序第七頁，共34頁。2.染色標(biāo)本染色

1）單染色法2）鑒別染色法（復(fù)染色法）：革蘭染色（Gramstain，GS）二、形態(tài)學(xué)檢查—涂片染色

1.不染色標(biāo)本檢查

懸滴或壓跡法，觀察活細(xì)菌輪廓、動力等。結(jié)晶紫1min盧戈碘1min95%乙醇30s稀釋復(fù)紅30s第八頁，共34頁。

血液、分泌物、排泄物、穿刺液、腦脊液等標(biāo)本和液體培養(yǎng)物可直接涂片鏡檢，有些細(xì)菌可做出初步診斷。病種標(biāo)本方法結(jié)果鼠疫痰，腺穿刺液GS，亞甲蘭染色G-兩極弄染，多形態(tài)霍亂水樣便GS，制動試驗G-弧菌，流星樣運動炭疽痰，滲出物GS，亞甲蘭染色/串珠試驗G+大桿菌，竹節(jié)狀排列，有芽胞和莢膜白喉假膜，咽拭子GS，亞甲蘭染色G+棒狀，異染顆粒/特殊排列淋病尿道/陰道分泌物GSG-雙球菌，位于膿細(xì)胞內(nèi)/外流腦腦脊液、瘀血癍GSG-雙球菌，位于膿細(xì)胞內(nèi)/外肺結(jié)核痰抗酸染色蘭色背景中紅色桿菌梅毒病變滲出液暗視野白色折光活動的密螺旋體第九頁，共34頁。三、分離培養(yǎng)

（一）培養(yǎng)基：1.培養(yǎng)基的種類第十頁，共34頁。2.調(diào)整培養(yǎng)基的pH；2.培養(yǎng)基的配制1.根據(jù)組成準(zhǔn)確稱取，混懸于裝有蒸餾水燒瓶中，加熱溶解；3.過濾澄清；4.分裝5.滅菌6.質(zhì)量檢查7.保存第十一頁，共34頁。（二）接種與分離技術(shù)1.

接種工具1）接種環(huán)和接種針

是細(xì)菌學(xué)實驗必需的工具。2）接種罩、無菌工作臺、無菌室、生物安全柜第十二頁，共34頁。2.接種與分離技術(shù)1）平板劃線分離：連續(xù)劃線放射劃線分區(qū)劃線第十三頁，共34頁。2）斜面的接種：3）半固體和液體培養(yǎng)基的接種：第十四頁，共34頁。第十五頁，共34頁。1.溫度：

——37℃、22℃、4℃、42℃（三）培養(yǎng)條件：第十六頁，共34頁。2.氣體：1）普通培養(yǎng)法2）CO2培養(yǎng)厭氧手套箱燭缸厭氧袋厭氧罐3）厭氧培養(yǎng)CO2培養(yǎng)箱第十七頁，共34頁。四、生化試驗

1.糖（碳水化合物）分解試驗第十八頁，共34頁。2.氧化一發(fā)酵試驗（O/F試驗）

【原理】又稱Hugh—Leifson（HL）試驗。細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中，必須以分子氧作為電子受體的，稱為氧化型（O）；可以進(jìn)行無氧降解的，稱為發(fā)酵型（F），此類細(xì)菌無論在有氧或無氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖；不分解葡萄糖的，稱為產(chǎn)堿型（-）。利用此試驗可區(qū)分細(xì)菌的代謝類型。

F型O型—型第十九頁，共34頁。3.甲基紅（MR）試驗和VP試驗【原理】↓甲基紅紅色乙酰甲基甲醇↓加入堿，被空氣中的氧氧化為丁二酮↓培養(yǎng)基pH在6.2以上↓加入甲基紅呈黃色VP試驗【培養(yǎng)基】葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。葡萄糖↓丙酮酸乳酸、乙酸、甲酸等↓培養(yǎng)基的pH下降至4.5以下與培養(yǎng)基中精氨酸所含的胍基發(fā)生反應(yīng)，生成紅色化合物α-奈酚加速反應(yīng)→轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)←MR試驗第二十頁，共34頁。【原理】氧化酶或稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶。作氧化酶試驗時，此酶首先使細(xì)胞色素C氧化，然后氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)?！痉椒ā咳V紙一角，沾取菌落少許，加試劑一滴，陽性者立即粉紅色，并于5-10秒內(nèi)呈現(xiàn)深紫色。4.氧化酶試驗第二十一頁，共34頁。【原理】過氧化氫酶可使過氧化氫分解為分子態(tài)氧。【方法】滴加3%過氧化氫溶液數(shù)滴于玻片上，挑取固體培養(yǎng)基上的菌落少許于過氧化氫溶液，觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果】30s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡者為陽性。

5.過氧化氫酶（觸酶）試驗第二十二頁，共34頁?！驹怼磕承┘?xì)菌能產(chǎn)生尿素酶分解尿素，產(chǎn)氨使培養(yǎng)基變堿。

【方法】將被檢菌接種尿素培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18～24h觀察結(jié)果。陰性時應(yīng)繼續(xù)觀察4d。

【結(jié)果】酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮?/p>

6.尿素酶試驗第二十三頁，共34頁?！驹怼考?xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚與試劑中的對二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色?！痉椒ā刻羧〖兣囵B(yǎng)物接種蛋白胨水培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)1～2d，沿管壁徐徐加入吲哚試劑少許，使成兩層，觀察結(jié)果。

【結(jié)果】兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。7.吲哚試驗

第二十四頁，共34頁?！驹怼慨?dāng)細(xì)菌能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源時，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長分解枸櫞酸鈉，使培養(yǎng)基變堿?！痉椒ā吭阼蹤此猁}瓊脂斜面上濃密劃線，接種被檢菌，于35℃培養(yǎng)1～4d，逐日觀察結(jié)果。

【結(jié)果】枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上有細(xì)菌生長，培養(yǎng)基變藍(lán)為陽性；無細(xì)菌生長、顏色不變（綠色）為陰性。

8.枸櫞酸鹽利用試驗第二十五頁，共34頁。五、免疫學(xué)試驗

人體受致病菌感染，免疫系統(tǒng)被刺激后發(fā)生免疫應(yīng)答而產(chǎn)生特異性抗體?？贵w的量常隨感染過程而增多，表現(xiàn)為效價（滴度）的升高。因此，用已知的細(xì)菌或其特異性抗原檢測患者體液中有無相應(yīng)特異抗體和其效價的動態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。一般采取病人的血清進(jìn)行試驗，故稱為血清學(xué)診斷。血清學(xué)診斷試驗最好取患者急性期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本，當(dāng)后者的抗體效價比前者升高大于等于4倍時方有意義。常用方法：直接凝集試驗、乳膠凝集試驗、沉淀試驗、補體結(jié)合試驗、中和試驗、ELISA。（一）血清學(xué)診斷(serologicaldiagnosis)第二十六頁，共34頁。以細(xì)菌的菌體成分為待測抗原，用特異性的抗體進(jìn)行檢測，用于細(xì)菌的分型或鑒定常用方法：

1.凝集試驗

2.莢膜腫脹試驗

3.免疫熒光技術(shù)

（二）免疫學(xué)鑒定第二十七頁，共34頁。六、藥物敏感試驗

七、分子生物學(xué)試驗1.核酸雜交

2.核酸擴(kuò)增技術(shù)（PCR、RFLP、SSCP等）3.基因芯片、蛋白質(zhì)芯片

第二十八頁，共34頁。八、微生物商品化及自動化檢測和鑒定系統(tǒng)

API數(shù)碼鑒定系統(tǒng)VITECK全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)血標(biāo)本培養(yǎng)系統(tǒng)第二十九頁，共34頁。第三十頁，共34頁。第三節(jié)

實驗室質(zhì)量控制一、室內(nèi)質(zhì)量控制是由實驗室內(nèi)部制定并實施的，是質(zhì)量保證的核心和基礎(chǔ)二、室間質(zhì)量控制評價

是由實驗室外部的組織或機(jī)構(gòu)對實驗室進(jìn)行的質(zhì)量評價第三十