化學(xué)毒物致突變作用

化學(xué)毒物致突變作用第1頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四遺傳毒理學(xué)第一節(jié)基本概念第二節(jié)化學(xué)毒物致突變的類型第三節(jié)致突變作用機(jī)制和后果第四節(jié)機(jī)體對致突變作用的影響第五節(jié)觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法2第2頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四基本概念遺傳毒理學(xué)(GeneticToxicology)是毒理學(xué)的一個分支，研究外源化學(xué)物及其他環(huán)境因素對生物體遺傳機(jī)構(gòu)的損害作用及其規(guī)律。其主要目的是檢測那些能引起DNA損傷的環(huán)境因素，研究其遺傳毒作用的特點及對人類的潛在危害。3第3頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四基本概念突變(mutation)遺傳結(jié)構(gòu)本身的變化及其引起的變異稱為突變，突變實際上是遺傳物質(zhì)的一種可遺傳的變異。自發(fā)突變(spontaneousmutation)

由于自然界中誘變劑的作用或由于偶然的自制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)時的堿基配對錯誤所產(chǎn)生的突變。誘發(fā)突變(inducedmutation)誘變劑誘發(fā)的突變。4第4頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四致突變作用或誘變作用(mutagenesis)

廣義概念是外來因素，特別是化學(xué)因子引起細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的能力，而且此種改變可隨同細(xì)胞分裂過程而傳遞。簡單地說，突變的發(fā)生及其過程即為致突變作用?；瘜W(xué)誘變劑(chemicalmutagen)基因突變(genemutation)

一個或幾個DNA堿基對的改變

染色體畸變(chromosomeaberration)

染色體的結(jié)構(gòu)及數(shù)目改變

基本概念5第5頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四DNA與基因:

基因(gene)

基因組(genosome)

染色質(zhì)(chromatin)與染色體(chromosome)

體細(xì)胞(somaticcell)和生殖細(xì)胞(germcell)

基因型(genotype)與表型(pheotype)細(xì)胞周期(cellcycle)、有絲分裂(mitosis)與減數(shù)分裂(meiosis)

基本概念6第6頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四基本概念7第7頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四基本概念8第8頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四基本概念9第9頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四基本概念10第10頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四基因突變（genemutation）染色體畸變（chromosomeaberration）非整倍體和多倍體(aneuploidyandpolyloid)化學(xué)毒物致突變的類型11第11頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四化學(xué)毒物致突變的類型一、基因突變(genemutation)

1．堿基置換(base—pairsubstitution)指某一堿基配對性能改變或脫落所致的突變。

轉(zhuǎn)換(transition)顛換(transvertion)2．移碼突變(frameshiftmutation)指發(fā)生一對或幾對（三對除外）的堿基減少或增加，以致從受損點開始堿基序列完全改變，形成錯誤的密碼，并轉(zhuǎn)譯成為不正常的氨基酸。

12第12頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四一、基因突變(genemutation)化學(xué)毒物致突變的類型13第13頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四化學(xué)毒物致突變的類型一、基因突變(genemutation)14第14頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四二、染色體畸變(chromosomeaberration)

指染色體的結(jié)構(gòu)改變?nèi)旧珕误w型畸變(chromatid-typeaberration)染色體型畸變(chromosomeaberration)染色體畸變裂隙(gap)

斷裂(break)斷片(fragment)和缺失(deletion)

微小體(minutebody)

無著絲點環(huán)環(huán)狀染色體

雙著絲點染色體

倒位(inversion)

易位(translocation)

插入(insertion)和重復(fù)(duplication)輻射體

化學(xué)毒物致突變的類型15第15頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四

染色體缺失及環(huán)狀染色體的形成圖

染色體插入和重復(fù)示意圖

16第16頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四

染色體的臂間倒位

染色體相互易位示意圖

17第17頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四二、染色體畸變(chromosomeaberration)化學(xué)毒物致突變的類型18第18頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四三、基因組突變

1．非整倍體非整倍體(aneuploid)指細(xì)胞丟失或增加一條或幾條染色體。缺失一條染色體時稱為單體(monosome)，增加一條染色體時稱為三體(trisome)。染色體數(shù)目的改變會導(dǎo)致基因平衡的失調(diào)，可能影響細(xì)胞的生存或造成形態(tài)及功能上的異常。如21三體導(dǎo)致先天愚型(Down氏綜合征)。2．整倍體整倍體(euploid)指染色體數(shù)目的異常是以染色體組為單位的增減，如形成三倍體(triploid)、四倍體(tetroploid)等。在人體，3n為69條染色體，4n為92條染色體。在腫瘤細(xì)胞及人類自然流產(chǎn)的胎兒細(xì)胞中可有三倍體細(xì)胞的存在。發(fā)生于生殖細(xì)胞的整倍體改變，幾乎都是致死性的。化學(xué)毒物致突變的類型19第19頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四致突變作用的機(jī)制一、DNA損傷與突變(一)堿基損傷1.堿基錯配2.嵌入DNA鏈3.堿基類似物的取代4.堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞

20第20頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四一、DNA損傷與突變（二）DNA鏈?zhǔn)軗p

1.二聚體的形成2.DNA加合物（DNAadducts）形成3.DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物(DNA-Proteincrosslinks，DPC)形成二、引起突變的細(xì)胞分裂過程的改變（對紡鍾體的毒作用）三、其他的改變

對DNA合成和修復(fù)有關(guān)的酶系統(tǒng)作用可間接導(dǎo)致

DNA損傷，誘發(fā)基因突變或染色體畸變。

致突變作用的機(jī)制21第21頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四突變的不良后果突變的不良后果

體細(xì)胞突變生殖細(xì)胞突變癌變致畸衰老配子死亡死胎自發(fā)流產(chǎn)先天畸形22第22頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四一、機(jī)體修復(fù)DNA損傷的機(jī)制可分為兩大類：1.損傷耐受機(jī)制：指DNA遺傳可繞過那些阻止DNA復(fù)制的DNA損傷。

2.修復(fù)機(jī)制：DNA修復(fù)直接修復(fù)切除修復(fù)O6甲基鳥嘌呤修復(fù)光修復(fù)錯配堿基修復(fù)堿基切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)機(jī)體對致突變作用的影響復(fù)制后修復(fù)呼救性修復(fù)23第23頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四機(jī)體對致突變作用的影響二、遺傳因素對致突變作用的影響：

(一)代謝酶遺傳多態(tài)性

(二)修復(fù)功能的個體差異

24第24頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法一、觀察項目的選擇

1．觀察的效應(yīng)終點類型基因突變和染色體畸變的檢測可直接反映化學(xué)毒物的致突變性，是評價化學(xué)毒物致突變性唯一可靠的方法。還有許多試驗所觀察到的現(xiàn)象并不反映基因突變、染色體畸變和染色體分離異常，而僅反映致突變過程中發(fā)生的其他事件。因此，將試驗觀察到的現(xiàn)象所反映的各種事件統(tǒng)稱為遺傳學(xué)終點(geneticendpoint)。25第25頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法一、觀察項目的選擇遺傳學(xué)終點分為5類：①DNA完整性的改變(形成加合物，斷裂，交聯(lián))；②DNA重排或交換；③DNA堿基序列改變；④染色體完整性改變；⑤染色體分離改變。其中③實際上指基因突變，④指染色體畸變。26第26頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法2．成套的觀察項目遺傳毒理學(xué)評價程序通常為一組體內(nèi)、外遺傳毒理學(xué)試驗。因為：①化學(xué)毒物的種類和結(jié)構(gòu)多種多樣，其致突變的機(jī)制不盡相同，作用的靶細(xì)胞也不一樣，有的是體細(xì)胞，或生殖細(xì)胞，或兩者兼而有之，故在成套觀察項目中既要用體細(xì)胞檢測又要用生殖細(xì)胞；除了從分子水平還要從細(xì)胞水平來檢測化學(xué)毒物的遺傳毒性。②致突變物中僅少數(shù)具有直接致突變作用，大多數(shù)為間接致突變作用，即需要在體內(nèi)代謝活化后，才具有致突變作用。體內(nèi)試驗具有完整的活化系統(tǒng)，而體外試驗則通過加入模擬代謝系統(tǒng)，如S9來彌補(bǔ)缺乏活化系統(tǒng)的不足。這是體內(nèi)與體外試驗的主要差別。③化學(xué)毒物的致突變性有強(qiáng)，也有弱；有的在某一檢測系統(tǒng)中是強(qiáng)致突變物，而在另一系統(tǒng)中可能是弱的致突變物。對于弱致突變物在某些系統(tǒng)中比較容易漏檢，即出現(xiàn)假陰性。27第27頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四2．成套的觀察項目關(guān)于遺傳毒理學(xué)成套觀察項目中那些試驗可入選的原則有：①選擇的遺傳毒性試驗應(yīng)包括5種類型的遺傳學(xué)終點。②通常的實驗材料有病毒、細(xì)菌、真菌、培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞、植物、昆蟲及哺乳動物等。③體內(nèi)試驗與體外試驗配合。④應(yīng)包括生殖細(xì)胞和體細(xì)胞。通常，對于一種受試物應(yīng)當(dāng)先用原核細(xì)胞或體細(xì)胞的體外試驗按遺傳學(xué)終點合理配套進(jìn)行試驗，并對有陽性結(jié)果的遺傳學(xué)終點驗證其在體內(nèi)的真實性，再行選用生殖細(xì)胞致突變試驗進(jìn)行遺傳危害的評價。觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法28第28頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四二、常用的致突變試驗

(一)細(xì)菌回復(fù)突變試驗(Ames試驗)

鼠傷寒沙門氏菌原養(yǎng)型(his+)組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株。(his-)正向突變回復(fù)突變代謝活化系統(tǒng)受試物觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法29第29頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四二、常用的致突變試驗(二)微核試驗

微核(Micronucleus)的產(chǎn)生與染色體損傷有關(guān)，是染色體或染色單體的無著絲點斷片或紡錘絲受損傷而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期遺留在細(xì)胞質(zhì)中，末期之后，單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱微核。在細(xì)胞質(zhì)中微核來源有二：斷片或無著絲粒染色體在細(xì)胞分裂后期不能定向移動，而遺留在細(xì)胞質(zhì)中；有絲分裂毒物的作用使個別染色體或帶苔絲粒的染色體環(huán)和斷片在細(xì)胞分裂后期被留在細(xì)胞質(zhì)中。微核試驗(Micronucleustest，MNT)是觀察受試物能否產(chǎn)生微核的試驗。其主要可檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑。

觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法30第30頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法(二)微核試驗31第31頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四MNNCE觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法32第32頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四二、常用的致突變試驗(三)染色體畸變分析

(四)姐妹染色單體交換試驗（SCE）

觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法33第33頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四二、常用的致突變試驗(五)果蠅伴性隱性致死試驗(六)顯性致死試驗(七)程序外DNA合成試驗

(八)轉(zhuǎn)基因動物致突變試驗(九)哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(十)SCCE試驗(十一)熒光原位雜交技術(shù)觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法34第34頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四三、致突變試驗中的一些問題

(一)陰性和陽性對照的設(shè)立

1．陰性對照它是空白對照，即不加任何處理?；蛘呤侨軇φ铡ｊ幮詫φ粘藷o處理因素外，與實驗組完全相同。其目的是獲得實驗的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。例如，Ames試驗的陰性對照可了解所用的細(xì)菌的自發(fā)回復(fù)突變率；證實除處理因素外無任何使回復(fù)突變率增加或減少的因素。2．陽性對照是用某種已知能產(chǎn)生陽性反應(yīng)的物質(zhì)作為對照。其目的是通過對陽性物質(zhì)的試驗證明實驗方法的可靠；驗證實驗者在本實驗條件下，完成技術(shù)和鑒定致突變物的能力；證實經(jīng)一段時間后，本實驗的重復(fù)性。例如，Ames試驗中陽性對照未出現(xiàn)陽性結(jié)果，應(yīng)考慮突變菌株可能發(fā)生問題，另一種可能是代謝活化能力不足。所以，當(dāng)陽性對照結(jié)果未呈陽性，其實驗組的實驗數(shù)據(jù)可靠性亦大大降低。觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法35第35頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四三、致突變試驗中的一些問題(二)體外試驗的活化系統(tǒng)

1．哺乳動物細(xì)胞介導(dǎo)使用完整的細(xì)胞，特別是大鼠肝原代細(xì)胞，與測試細(xì)菌或細(xì)胞一起培養(yǎng)。這也是一種活化系統(tǒng)。它有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各種酶及內(nèi)源性輔助因子，代謝能力優(yōu)于無細(xì)胞系統(tǒng)如S9，但不如體內(nèi)活化系統(tǒng)。2．S9S9指經(jīng)酶誘導(dǎo)劑處理后制備的肝勻漿，再經(jīng)9000g離心分離所得上清液，加上適當(dāng)?shù)木彌_液和輔助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是國內(nèi)常規(guī)應(yīng)用于體外致突變試驗的代謝活化系統(tǒng)，其缺點是S9隨實驗動物種屬或器官不同而有差異；S9含有的大量親核物質(zhì)有可能影響試驗的敏感性。3．純化酶和基因工程應(yīng)用純化細(xì)胞色素P-450、谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶及過氧化物水解酶，可嚴(yán)格控制代謝產(chǎn)物誘發(fā)突變的條件，但技術(shù)難度大。利用基因工程，將人的細(xì)胞色素P-450基因，插入組合細(xì)胞內(nèi)，用上述細(xì)胞進(jìn)行致突變試驗，使細(xì)胞具有代謝活化系統(tǒng)。觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法36第36頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四三、致突變試驗中的一些問題(三)致突變試驗與致癌試驗的關(guān)系

①已知大多數(shù)化學(xué)致癌物具有致突變作用，遺傳學(xué)改變在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物誘致關(guān)鍵靶基因遺傳改變的直接作用等在哺乳動物實驗中證實。②發(fā)現(xiàn)人類接