幾種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)

幾種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)第1頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)分子遺傳標(biāo)記概述1主要分子標(biāo)記技術(shù)4分子遺傳標(biāo)記優(yōu)越性2分子遺傳標(biāo)記分類3幾種分子標(biāo)記的比較5第2頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

分子遺傳標(biāo)記概述20世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相繼建立了RFLP、RAPD、AFLP、SNP、SSCP等分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。

分子遺傳標(biāo)記（MolecularGeneticMarkers）是以個(gè)體遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)第3頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三多為共顯性在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無(wú)限的檢測(cè)手段簡(jiǎn)單快捷，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)分子遺傳標(biāo)記的優(yōu)越性第4頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

分子遺傳標(biāo)記的分類動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)Southern雜交為核心的分子標(biāo)記，如RFLPDNA芯片技術(shù)為基礎(chǔ)分子標(biāo)記，如SNPPCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如RAPDPCR與酶切技術(shù)結(jié)合的分子標(biāo)記，如AFLP分子標(biāo)記第5頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

主要的分子遺傳標(biāo)記

原理：用限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA后，基因組DNA在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)發(fā)生了重排、插入、缺失或點(diǎn)突變，導(dǎo)致酶切位點(diǎn)發(fā)生改變，從而形成了大小不等、數(shù)量不同的酶切片段，當(dāng)這些片段通過(guò)凝膠電泳時(shí)就形成不同的帶，用分子探針雜交并利用放射自顯影成像時(shí)，不同程度的RFLP譜帶表示其多態(tài)性。動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)1、RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性第6頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)第7頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RFLP的優(yōu)點(diǎn)樣品純度要求較高，樣品用量大；多態(tài)信息含量低；步驟繁瑣、工作量大、成本較高。動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)較高的可靠性；標(biāo)記數(shù)目是無(wú)限的；標(biāo)記為共顯性；標(biāo)記之間無(wú)干擾；不受年齡性別以及外界環(huán)境的影響。RFLP的缺點(diǎn)第8頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RFLP的應(yīng)用分子水平上選擇目的性狀進(jìn)行品種或品系遺傳純度的測(cè)定改良回交育種技術(shù)生物進(jìn)化和分類疾病診斷方面的應(yīng)用特別適應(yīng)于構(gòu)建遺傳連鎖圖動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)第9頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2、AFLP

(Amplified

Restriction

Fragment

Polymorphism)

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性:原理：基因組DNA經(jīng)兩種限制性內(nèi)切酶酶切，形成分子量大小不等的隨機(jī)酶切片段，將特定的人工合成的短的雙鏈接頭連在這些片段的兩端，形成一個(gè)帶接頭的特異片段，用含有選擇性堿基的引物對(duì)摸板DNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據(jù)凝膠上擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性來(lái)檢出多態(tài)性。動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)第10頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)第11頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三AFLP的優(yōu)點(diǎn)動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)多態(tài)性豐富且清晰可辨，一次AFLP分析可檢測(cè)到100~150個(gè)標(biāo)記；被認(rèn)為是指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最豐富的一項(xiàng)技術(shù)；可靠性好，重復(fù)性高；DNA需要量少；引物在不同物種間是通用的；AFLP分析的擴(kuò)增片段較短（30-700bp)，分辨率高。AFLP的缺點(diǎn)對(duì)DNA模板質(zhì)量要求高，對(duì)其濃度變化不敏感；顯性標(biāo)記，只能表明目的條帶的有無(wú)，不能區(qū)分純合子和雜合子；操作復(fù)雜，耗時(shí)，成本高。第12頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三AFLP的應(yīng)用

動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)遺傳圖譜的構(gòu)建；基因標(biāo)記及定位；種及種下階元的分類鑒定；遺傳距離及雜種優(yōu)勢(shì)的利用；遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化的研究。第13頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3、SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism)

單鏈構(gòu)象多態(tài)性

單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。原理：?jiǎn)捂淒NA分子內(nèi)的相互作用力使其呈現(xiàn)復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，其空間構(gòu)象發(fā)生變化，這些空間構(gòu)象存在差異的單鏈DNA分子在凝膠中受排阻大小不同。因此，通過(guò)電泳可以將構(gòu)象上有差異的分子分離開(kāi)，形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)第14頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)第15頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)

SSCP的優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)步驟少，周期短；具有高的靈敏性，僅單個(gè)堿基差異亦可檢測(cè)出來(lái)，拓展了檢測(cè)范圍；能得到更多的圖譜信息，更詳細(xì)的分型結(jié)果。SSCP的缺點(diǎn)只能作為突變檢測(cè)方法，要確定突變的位置和類型，還需進(jìn)一步測(cè)序；受外界影響較大，電泳條件要求較嚴(yán)格；易造成漏檢。第16頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三SSCP的應(yīng)用動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)基因點(diǎn)突變的監(jiān)測(cè)大量樣本的篩選

cDNA的篩查檢測(cè)人類遺傳性疾病病毒的分型和分類保種和育種第17頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4、RAPD（RandomamplifiedpolymorphismDNA）

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA原理：以基因組DNA為模板，以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列（通常為10個(gè)堿基對(duì)）為引物，在Taq酶作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測(cè)多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)第18頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)第19頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三RAPD的優(yōu)點(diǎn)引物可隨機(jī)合成和隨機(jī)選定，長(zhǎng)度一般為9-10bp；不同生物基因組可以共用一套引物；退火溫度低，一般為36℃，允許適當(dāng)?shù)腻e(cuò)配；每個(gè)RAPD反應(yīng)中，僅加單個(gè)引物，就可通過(guò)引物和模板DNA隨機(jī)配對(duì)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，擴(kuò)增無(wú)特異性；RAPD分析所需的DNA樣品量極少。動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)RAPD的缺點(diǎn)重復(fù)性差，易受到各種因素的影響；標(biāo)記呈顯隱性遺傳。第20頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5、TRS（TandemRepeatedSequence)

串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記微衛(wèi)星DNA又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SampleSequenceRepeats，SSR)，廣泛存在于真核生物基因組中，以1~6個(gè)堿基為核心序列，首尾相連組成的串聯(lián)重復(fù)序列。動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)小衛(wèi)星（MinisatelliteDNA)微衛(wèi)星（MicrosatelliteDNA）第21頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)原理：每個(gè)微衛(wèi)星兩側(cè)一般是相對(duì)保守的單拷貝序列，據(jù)此可設(shè)計(jì)專一引物，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后，不同個(gè)體間因核心序列的重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生DNA多態(tài)性。

單拷貝序列在單倍體基因組中只出現(xiàn)一次，但儲(chǔ)存了巨大的遺傳信息，可以編碼各種不同功能的蛋白質(zhì)，因此對(duì)這些序列的研究有特別重要的意義。

第22頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)第23頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)數(shù)量多且均勻分布在基因組中；具有豐富的多態(tài)性；等顯性遺傳，因此檢測(cè)可以顯示純合子和雜合子；檢測(cè)容易、重復(fù)性較好、省時(shí)，適合于進(jìn)行自動(dòng)化分析。微衛(wèi)星DNA的優(yōu)點(diǎn)微衛(wèi)星DNA的缺點(diǎn)相對(duì)的物種專一性；開(kāi)發(fā)困難，費(fèi)用較高，耗時(shí)長(zhǎng)；實(shí)際分析時(shí)一般每次只分析單個(gè)位點(diǎn)；不同引物退火溫度不同，需要探索。第24頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三個(gè)體及親緣關(guān)系鑒定種群(品種、品系)內(nèi)遺傳純度和彼此之間遺傳距離構(gòu)建遺傳連鎖圖譜定位功能基因及QTL雜交優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及遺傳關(guān)系的分析在標(biāo)記輔助選擇和標(biāo)記輔助導(dǎo)入等方面的研究監(jiān)測(cè)育種和遺傳操作效應(yīng)親子鑒定、胚胎移植、混合受精、親緣關(guān)系分析動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)微衛(wèi)星DNA的應(yīng)用第25頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三6、SNP（SingleNucleotidePolymorphism)

單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記概念：SNP指染色體上某個(gè)位點(diǎn)單個(gè)核苷酸的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失或插入等。

特性：高密度；代表性；易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析，標(biāo)記為雙等位標(biāo)記。動(dòng)物遺傳標(biāo)記課程作業(yè)第26頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三SNP的應(yīng)用人類基因單體型圖的繪制描述人類常見(jiàn)的遺傳多態(tài)性模式和染色體上具有