絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備

項(xiàng)目三絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三第1組第2組第3組第4組第5組第6組第7組第8組一、匯報(bào)交流方案現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三二、討論確定方案SDS制備SHMTSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）是一種在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中加入SDS和巰基乙醇，以消除蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷和形狀對(duì)電泳遷移率影響的電泳技術(shù)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中待檢蛋白質(zhì)的遷移率主要依賴(lài)于其相對(duì)分子質(zhì)量，因此被廣泛用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三十二烷基硫酸鈉是一種陰離子去污劑，與蛋白質(zhì)結(jié)合可形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電，使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原來(lái)的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中加入SDS和巰基乙醇，能掩蓋不同蛋白質(zhì)間的電荷差異，并引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致變性后的蛋白質(zhì)分子在凝膠電泳中的遷移率取決于其相對(duì)分子質(zhì)量大小，而與其他因素（原有電荷、形狀）無(wú)關(guān)。通過(guò)這種電泳方式可將細(xì)胞中所有蛋白質(zhì)根據(jù)各自的相對(duì)分子質(zhì)量大小而分離開(kāi)來(lái)。現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三電泳方向混合樣品電泳帶孔膠大分子小分子現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三SHMT的電泳制備操作流程安裝電泳槽剝膠電泳上樣制膠染色現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三三、關(guān)鍵操作試劑配制制膠剝膠現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三四、方案實(shí)施清潔領(lǐng)取物料操作填寫(xiě)生產(chǎn)記錄清場(chǎng)與清潔現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三SHMT的電泳制備安裝電泳槽剝膠電泳上樣制膠染色現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三材料：大腸桿菌培養(yǎng)物懸液（含SHMT）器材：（1）夾心式垂直板電泳槽；（2）直流穩(wěn)壓電源（電泳儀）；（3）培養(yǎng)皿及竹夾子；（4）長(zhǎng)針頭（8~10cm）及普通針頭；（5）注射器（10ml）；（6）微量進(jìn)樣器（50μl）；（7）細(xì)長(zhǎng)皮頭吸管；（8）移液管架；（9）棕色試劑瓶；（10）白色試劑瓶；（11）1ml、2ml、5ml吸量管；（12）卷紙1包；（13）大平皿，（14）移液槍?zhuān)ㄅ?0μl槍頭）。（一）材料與儀器現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三夾心垂直板電泳槽示意圖1：導(dǎo)線接頭2：下貯槽3：凹形橡膠框4：梳子5：固定螺絲6：上貯槽7：冷凝管凝膠模示意圖1：梳子2：長(zhǎng)玻璃板3：短玻璃板4：凹形橡膠框現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三（二）試劑及配制（1）30%丙烯酰胺儲(chǔ)存液稱(chēng)取丙烯酰胺29g、甲叉雙丙烯酰胺1g，加熱至37℃溶解，蒸餾水定容至100mL，裝于棕色瓶，4℃保存。（2）1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）緩沖液稱(chēng)取Tris18.17g，加蒸餾水溶解，濃鹽酸調(diào)pH至8.8，定容至100mL。（3）1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）緩沖液稱(chēng)取Tris12.12g，加蒸餾水溶解，濃鹽酸調(diào)pH至6.8，定容至100mL。現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三（4）10%SDS溶液稱(chēng)取SDS10.0g，加蒸餾水，68℃助溶，定容至100mL。（5）10%過(guò)硫酸銨溶液稱(chēng)取1.0g過(guò)硫酸銨，加水定容至10mL，4℃保存。（6）5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（pH8.3）稱(chēng)取Tris15.1g、甘氨酸94g、SDS5g，加水定容至1L，室溫存放，使用時(shí)稀釋5倍使用?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三（7）考馬斯亮藍(lán)R250染色液在45mL甲醇、45mL水和10mL冰乙酸的混合液中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R250，用濾紙過(guò)濾染液以去除顆粒狀物質(zhì)。配制500mL。（8）脫色液75mL冰乙酸，50mL甲醇，875mL水，混勻即可。（9）2×SDS凝膠加樣緩沖液配5mL：取1mol/LTris-HCl（pH6.8）0.5mL，SDS0.2g，溴酚蘭10mg，甘油1mL，加水定容至5mL，與樣本混勻前加0.16gDTT。使用時(shí)與樣本l∶1（v/v）混勻?，F(xiàn)在是16頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三（10）樣品處理大腸桿菌培養(yǎng)物懸液→離心（3000r/min，5min）→蒸餾水懸浮細(xì)胞→加2×SDS加樣緩沖液（1:1）→沸水加熱10min→離心（5000r/min，10min）→取上清液加樣?，F(xiàn)在是17頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三（三）操作步驟（1）將長(zhǎng)、短玻璃板分別插到凹形橡膠框的凹形槽中。溫馨提示：注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。（2）在長(zhǎng)玻璃板下端與橡膠?？蚪唤绲目p隙處加入已融化的1%瓊脂，封住空隙。溫馨提示：封底用的瓊脂應(yīng)用1×TBE溶解，凝固后的瓊脂中應(yīng)避免有氣泡。（3）將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯槽。（4）將下貯槽的螺孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲釘?shù)纳腺A槽，旋緊螺絲帽，豎直電泳槽。溫馨提示：安裝電泳槽，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽，以免緩沖液滲漏。1.電泳槽組裝現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三（三）操作步驟2.膠體的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍

凝膠濃度（%）線性分離范圍（kD）1512～431016～687.536～945.057～212現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三（1）分離膠的制備

SDS%分離膠配方

溶液成分不同體積（mL）凝膠液中各成分所需體積（mL）510152025304050蒸餾水1.63.34.96.68.29.913.216.530%丙烯酰胺溶液2.04.06.08.010.012.016.020.01.5mol/LTris（pH8.8）1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸銨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02按表配制12%分離膠，混勻后迅速將配好的分離膠倒入凝膠模長(zhǎng)、短玻璃板間的間隙內(nèi)，高度約8cm。然后沿長(zhǎng)玻璃板板壁緩慢注入少許蒸餾水，進(jìn)行水封。待凝膠完全聚合（約30min），傾去水封層的蒸餾水，并用濾紙條吸去殘余水分。溫馨提示：若凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合?，F(xiàn)在是20頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三（2）濃縮膠的制備

SDS%濃縮膠配方

按配制5%濃縮膠，混勻后迅速加到已聚合的分離膠上方（高度以插入梳子不溢出為宜），輕輕將梳子插入濃縮膠內(nèi)，待凝膠完全聚合（約30min）后小心拔去梳子。溫馨提示：丙稀酰胺為神經(jīng)毒劑，使用時(shí)要小心，操作務(wù)必戴手套。過(guò)硫酸銨需新鮮配制，并注意濃度，否則影響膠凝固。殘余膠液可暫時(shí)留存，便于參考膠凝固時(shí)間。溶液成分不同體積（mL）凝膠液中各成分所需體積（mL）123456810蒸餾水0.681.42.12.73.44.15.56.830%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831.01.31.71.0mol/LTris（pH6.8）0.130.250.380.50.630.751.01.2510%SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110%過(guò)硫酸銨0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三3．上樣

（1）將Tris-甘氨酸電泳緩沖液倒入上、下貯槽中，高度應(yīng)沒(méi)過(guò)短玻璃板約0.5cm。（2）用微量注射器吸取10～20μL樣品液加入上樣孔，加樣體積可根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握。溫馨提示：若樣品槽中有氣泡，可用注射器針頭挑除；加樣時(shí)，微量注射器針頭應(yīng)盡量接近加樣槽底部，但針頭勿碰破凹形槽膠面。（三）操作步驟現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三4．電泳連接電泳儀，打開(kāi)電源，按8V/cm確定所需電壓，待指示劑（溴酚藍(lán)）進(jìn)入分離膠后將電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部（約3h），停止電泳，關(guān)閉電源。溫馨提示：正極應(yīng)接下槽。（三）操作步驟現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三5．剝膠電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下橡膠框，輕輕撬開(kāi)兩層玻璃，取出凝膠，切角作記號(hào)。溫馨提示：剝離凝膠應(yīng)戴手套，防止污染膠面。（三）操作步驟現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三6．染色經(jīng)SDS分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍(lán)R250染色。（1）染色將凝膠浸泡在染色液中，在室溫下緩慢搖動(dòng)染色30min。（2）脫色回收染色液，凝膠先用蒸餾水漂洗一次，再浸入脫色液中，放在脫色搖床上于室溫平緩搖動(dòng)3～5h，其間更換脫色液3～4次，直至條帶清晰。（3）漂洗脫色后，用蒸餾水漂洗凝膠3～5次。（三）操作步驟現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三五、結(jié)果展示與評(píng)價(jià)SDS-PAGE電泳示意圖1：對(duì)照2：樣品M：蛋白質(zhì)Marker12M現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三1、SHMT2、電泳3、電泳技術(shù)4、PAGE5、SDS6、IFE六、總結(jié)與拓展現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三1、SHMTSerinehydroxymethyltransferase絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶glyA現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三2、電泳電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)。帶電粒子（帶電顆粒）在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱(chēng)為電泳(electrophoresis)。現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三3、電泳技術(shù)利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱(chēng)為電泳技術(shù)。利用電泳現(xiàn)象使物質(zhì)分離的技術(shù)稱(chēng)為電泳技術(shù)。不同物質(zhì)由于所帶電荷、分子大小和形狀不同，在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同。

現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三4、PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis

聚丙烯酰胺凝膠電泳

以聚丙烯酰胺凝膠為支持介質(zhì)的電泳技術(shù)廣泛用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離、制備及定性、定量分析?，F(xiàn)在是31頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑的作用下聚合而成。丙烯酰胺單體和N，N'-甲叉雙丙烯酰胺單獨(dú)存在或混合存在時(shí)是穩(wěn)定的，當(dāng)遇到自由基時(shí)，二者發(fā)生聚合反應(yīng)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的聚合體系有化學(xué)聚合和光聚合兩種?，F(xiàn)在是32頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三聚合方式催化劑加速劑聚合條件凝膠特點(diǎn)化學(xué)聚合過(guò)硫酸銨（AP）N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺（TEMED）堿性環(huán)境膠孔徑較小，多用于制備分離膠光聚合核黃素（VB2）無(wú)光膠孔徑較大，不穩(wěn)定多用于制備濃縮膠現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點(diǎn)

①在一定濃度時(shí)，膠體透明，有彈性，機(jī)械性能好。②化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)。③對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定。④幾乎無(wú)電滲作用，只要丙烯酰胺單體純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好。⑤樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g。⑥凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，改變單體及交聯(lián)劑的濃度可調(diào)節(jié)凝膠的孔徑。⑦分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。

現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有39頁(yè)\編輯于星期三凝膠濃度和交聯(lián)度是影響聚丙烯酰胺凝膠性能的主要因素。通常用100mL凝膠溶液中含有Acr及Bis的總克數(shù)表示凝膠濃度（T%）。交聯(lián)度（C%）是指交聯(lián)劑Bis占單體Acr與Bis總量的百分?jǐn)?shù)。一般分離蛋白質(zhì)和核酸的聚丙烯酰胺凝膠標(biāo)準(zhǔn)濃度分別為7.5%和2.