微生物學(xué)實驗基本操作與培訓(xùn)

微生物學(xué)實驗基本操作與培訓(xùn)第1頁/共22頁微生物基本實驗操作技能

要領(lǐng)及注意事項第2頁/共22頁一、無菌操作

1、無菌概念：什么地方是有菌的，什么地方是無菌的；哪些地方要求基本無菌，哪些地方嚴格要求無菌。

2、操作環(huán)境：實驗室；接種箱；超凈工作臺；無菌工作室。

3、工作范圍：接種、轉(zhuǎn)管、倒平板、梯度稀釋、涂平板、平板劃線、菌體(菌懸液)轉(zhuǎn)移及其他需要無菌操作的實驗環(huán)節(jié)。第3頁/共22頁一、無菌操作4、要領(lǐng)及注意事項：（以實驗室接種、轉(zhuǎn)管為例）（1）斜面、接種環(huán)拿法；（2）火焰保護；（3）接種環(huán)滅菌；（4）接種環(huán)冷卻及輕快接觸斜面；（5）棉塞的制作及處理。第4頁/共22頁二、染色、制片

1、類型：分裝片和涂片；

2、操作步驟：（以涂片為例）

1）涂片：載玻片---滴加生理鹽水---挑菌涂成薄膜；

2）干燥：室溫自然干燥：

3）固定：菌面向上，火焰上過2-3次：

4）染色：滴加染色液（美藍）,覆蓋（2-3分鐘）；

5）水洗：自來水沖洗，至基本無色，晾干；

6）鏡檢：調(diào)節(jié)光源，低倍鏡觀察，高倍鏡觀察，油鏡觀察。第5頁/共22頁二、染色、制片4、要領(lǐng)及注意事項：（1）生理鹽水和菌體一定不能過多；（2）菌膜不能過厚，最好細胞分布疏密相間；（3）固定要到位，不能殘留水，也不能固定過度；（4）染色時間正確，一定要按規(guī)定計時；（5）水洗時，水流不宜過急；（6）鏡檢前片子一定要干燥無水。第6頁/共22頁三、油鏡頭的使用

1．工作范圍：觀察細菌及相近大小的微生物，真核微生物的細胞器。2、使用特點：一定要用油；操作要求較高。第7頁/共22頁三、油鏡頭的使用3、要領(lǐng)及注意事項：（1）所用裝片、涂片上一定不能有水；（2）先用低、高倍鏡觀察并選好視野，并將待觀察目標調(diào)至視野正中心；（3）注意保護鏡頭和片子，從側(cè)面觀察鏡頭進入油系；（4）油鏡頭觀察時，用微調(diào)調(diào)焦距，始終按鏡、片分離方向用微調(diào)調(diào)焦距；（5）調(diào)焦距速度一定要慢，避免焦躁,因為圖象出現(xiàn)的焦距范圍很??；（6）注意光線的強弱；（7）用擦鏡紙蘸取溶劑（二甲苯）擦凈鏡頭和裝片。第8頁/共22頁四、革蘭氏染色

1．工作范圍：細菌學(xué)中最重要的鑒別染色法之一，也可用于其他微生物的鑒別中。一般的微生物形態(tài)觀察不必用革蘭氏染色。2、基本步驟：

1）初染：結(jié)晶紫染色；

2）媒染：碘液媒染；

3）脫色：乙醇脫色；

4）復(fù)染：番紅復(fù)染;第9頁/共22頁四、革蘭氏染色3、要領(lǐng)及注意事項：

1）菌種的菌齡，要選擇生長旺盛期的典型菌體；

2）制片，按單染色的基本要求操作；

3）乙醇脫色時間是本實驗成功與否的關(guān)鍵，注意襯以白背景，用95%乙醇滴洗至剛剛無紫色為止，約20—30秒，立即用水沖凈乙醇；

4）觀察時，以分散開的細菌顏色為準。

5）對未知菌進行革蘭氏染色時，應(yīng)選擇兩株形態(tài)不同、染色結(jié)果不同的已知菌和未知菌一起混合制片、染色。第10頁/共22頁五．細菌、放線菌、酵母菌和霉菌的菌體形態(tài)的差別

（1）細菌、放線菌是原核生物，酵母菌和霉菌是真核生物，大小不同；（2）放線菌和霉菌是絲狀菌，細菌和酵母菌是非絲狀菌；（3）霉菌有孢子柄、子實體等特化形態(tài)，放線菌沒有。（4）一定要注意提問，不要理解為菌落形態(tài)。第11頁/共22頁六、用血球計數(shù)板計數(shù)微生物的數(shù)量

1．工作范圍：此法計得的是死、活菌的總數(shù)，故稱總菌計數(shù)法。2、基本步驟：

1）稀釋：將酵母菌懸液進行適當稀釋，菌液不濃，可不必稀釋。

2）鏡檢計數(shù)室：在計數(shù)前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則進行清洗。

3）加樣品：蓋上蓋玻片，用毛細管將菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓其自行滲進計數(shù)室。不可有氣泡。

4）顯微鏡計數(shù)：五分鐘后，先低倍鏡找計數(shù)室，后高倍鏡計數(shù)。一般以每小格5—10個菌體為宜。常選四角和中央五個中格計數(shù)。格線上菌體只數(shù)上線和左邊線。芽大于母體一半方計。同法計另一室。5）清洗血球計數(shù)板：自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，自行晾干。鏡檢，洗凈為止。第12頁/共22頁六、用血球計數(shù)板計數(shù)微生物的數(shù)量3、要領(lǐng)及注意事項：（1）計數(shù)結(jié)果是微生物總數(shù)，含死、活菌；（2）菌懸液要搖勻；（3）計數(shù)格數(shù)和分布要合理；（4）對壓線、出芽等情況處理；（5）菌懸液稀釋要適當，不要過濃或過??；（6）光線要適中（尤其不要太強），否則找不到計數(shù)室；（7）要先低倍鏡，后高倍鏡。第13頁/共22頁七、微生物大小的測定

1．工作范圍：原核微生物的測定一般要用油鏡頭；真核微生物的測定一般用高倍鏡即可；測微尺多用來測定細菌和酵母菌，放線菌和霉菌較少。2、操作步驟

1）目鏡測微尺的標定

(1)放置目鏡測微尺：測微尺刻度朝下；

(2)放置鏡臺測微尺：測微尺刻度朝上；

(3)校正目鏡測微尺：按低、高、油順序，使兩種測微尺某一區(qū)間的兩對刻度線完全重合，按下式計算：兩對重合線間鏡臺測微尺格數(shù)×10目鏡測微尺每小格長度（um）=———————————————

兩對重合線間目鏡測微尺格數(shù)

2）菌體大小的測定：換上裝片，測出菌體長寬格數(shù)，算出菌體大小。

3）取出目鏡測微尺，將兩種測微尺用擦鏡紙擦凈，入盒。第14頁/共22頁七、微生物大小的測定

3、要領(lǐng)及注意事項：（1）鏡臺測微尺刻度務(wù)必朝上；（2）目鏡測微尺刻度朝下，放于目鏡與鏡頭之間；（3）按低、高、油順序校正目鏡測微尺；（4）兩對刻度線要整格完全重合；（5）鏡臺測微尺線條太粗時，可與線條的同邊對齊。（6）測細菌等原核微生物時，用油鏡頭要嚴格按油鏡頭的使用要求操作，要特別注意光線的強弱。（7）對不到一格的數(shù)值的判斷一定要盡量準確，不能馬虎；（8）對各類微生物的大小要心中有數(shù)，如計算的結(jié)果與理論值差距很大，要驗算。第15頁/共22頁八、斜面、平板、搖瓶的制作

1．工作范圍：斜面：培養(yǎng)和保存菌種；平板：微生物分離、純化和活菌計數(shù)；搖瓶：微生物液體培養(yǎng)，模擬發(fā)酵罐。2、操作步驟：

1）按培養(yǎng)基配方稱量各種藥品、試劑；

2）斜面和平板按要求稱量瓊脂，搖瓶不用瓊脂；

3）溶化：加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，在電熱套上加熱使其溶解。加入瓊脂，加熱，攪拌溶化，補充水分至所需的總體積；

4）調(diào)pH：測pH值，用滴管向培養(yǎng)基中加入NaOH或

HCl,邊調(diào)邊測，直至要求的pH范圍；

第16頁/共22頁八、斜面、平板、搖瓶的制作5）分裝：將配制的培養(yǎng)基分裝入試管和三角燒瓶（250ml）內(nèi)，試管裝1/4。6）加塞：在管（瓶）口塞上棉塞，既保證通氣又可阻止外界微生物進入造成污染：搖瓶用八層紗布蓋口；7）包扎8）滅菌9）擱置斜面：趁熱將試管棉塞端擱在玻棒上，使斜面長度不超過試管長度的一半；倒平板：用無菌操作的方法將三角燒瓶中的培養(yǎng)基趁熱倒入培養(yǎng)皿中，6-7個/100ml；10）無菌檢查：將斜面37℃恒溫培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。第17頁/共22頁八、斜面、平板、搖瓶的制作3、要領(lǐng)及注意事項：

1）各種藥品、試劑的稱量要注意精確性；

2）微生物培養(yǎng)用培養(yǎng)基一般用自來水配制；

3）斜面的瓊脂溶化要徹底；

4）調(diào)pH（除“自然”外）千萬不要省略；

5）分裝培養(yǎng)基應(yīng)用培養(yǎng)基分裝器（移液管、玻璃漏斗）分裝，不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上；

6）倒平板時，注意避免燒、燙手。第18頁/共22頁九、滅菌1、操作步驟：

1)通電，打開開關(guān)，觀察指示燈，視狀態(tài)添加水；

2)放置滅菌物品；

3)設(shè)定溫度、時間（121℃，20min），通電加熱；

4)完全排凈冷空氣，關(guān)上排氣閥；

5)滅菌結(jié)束后，切斷電源，使鍋內(nèi)溫度自然降至壓力為0，打開排氣閥

6)取出滅完菌的培養(yǎng)基、物品，自然冷卻，排盡水。第19頁/共22頁九、滅菌2、要領(lǐng)及注意事項：

1）一定要檢查水位；

2）溫度和時間設(shè)置方法按說明書要求操作；

3）排凈冷空氣是關(guān)鍵，要理解原理；

4）應(yīng)開蓋蒸發(fā)一定時間后