微生物生物轉(zhuǎn)化

微生物生物轉(zhuǎn)化第1頁/共37頁第九章

甾類激素的微生物轉(zhuǎn)化第2頁/共37頁第一節(jié)概述甾類激素是指分子結(jié)構(gòu)中含有環(huán)戊烷多氫菲核的一類藥物。甾體化合物的基本結(jié)構(gòu)見圖9－1。

甾類激素根據(jù)其生理活性可分為腎上腺皮質(zhì)激素、性激素和蛋白同化激素三大類。

在醫(yī)學上應用非常廣泛，用于風濕性關(guān)節(jié)炎、控制炎癥、哮喘病、皮膚病、避孕、利尿等各方面的治療上，對機體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。第3頁/共37頁早期甾類激素藥物的生產(chǎn)主要靠化學合成。脫氧膽酸--醋酸可的松甾體激素類藥物生產(chǎn)新的途徑——微生物轉(zhuǎn)化。少根根霉及黑根霉能使黃體酮轉(zhuǎn)化成11α-羥基黃體酮，收率達85％。第4頁/共37頁細菌、酵母、霉菌和放線菌的某些種類都可能使甾類化合物的一定部位發(fā)生有價值的轉(zhuǎn)化反應，微生物轉(zhuǎn)化已成為甾體工業(yè)中不可缺少的部分，在生產(chǎn)中常采用化學合成與微生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合的辦法。第5頁/共37頁微生物轉(zhuǎn)化在生產(chǎn)工藝上有如下特點:①可減少化學合成步驟，簡化生產(chǎn)流程，縮短生產(chǎn)路線。

②能提高產(chǎn)物的收率和產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本。③可進行化學法難以實現(xiàn)的反應。④

微生物轉(zhuǎn)化避免和減少了強酸、強堿或化學有毒物質(zhì)，改善了生產(chǎn)環(huán)境。第6頁/共37頁

第二節(jié)微生物轉(zhuǎn)化反應類型

對甾體激素藥物合成比較重要的主要有:氧化反應:其中氧化反應又包括甾體骨架上的羥基化和脫氫(生成雙鍵)、甾醇氧化成甾酮、支鏈降解作用以及D環(huán)的切斷和D環(huán)開裂形成內(nèi)酯環(huán)等。還原反應水解反應

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一、羥化反應

通過微生物羥化酶能非常專一地選擇某個碳位置上將某空間位置上的氫取代氧化成原來空間構(gòu)型的羥基。第8頁/共37頁

1．C9α羥化第9頁/共37頁2．C11α羥化第10頁/共37頁第11頁/共37頁第12頁/共37頁

C11α羥化是微生物轉(zhuǎn)化的特有反應，人體內(nèi)的酶也不能將甾體C11α羥化。在C11α羥化菌株中，以黑根霉為最好利用微生物轉(zhuǎn)化的方法實現(xiàn)、C11β、

C16α

、C17α和C19α位的羥化反應，這些也是制藥工業(yè)中很有價值的反應。第13頁/共37頁

二、環(huán)氧化反應

用微生物轉(zhuǎn)化法在甾體母核上引入環(huán)氧基團的反應。

第14頁/共37頁三、脫氫反應

當抗炎甾體激素等藥物的母核C1、C2位置導入雙鍵后，其抗炎作用會成倍增加。第15頁/共37頁第16頁/共37頁化學法脫C1、C2氫是采用二氧化硒法，由于硒在生產(chǎn)中難以除盡會使產(chǎn)品中帶有少量對人體有害的物質(zhì)，所以采用微生物轉(zhuǎn)化脫氫是甾體抗炎激素藥物合成中不可缺少的一步。微生物對甾體羥化與脫氫能力是相反的，細菌的脫氫能力比真菌大，特別以棒狀桿菌和分枝桿菌活力最大。球形芽孢桿菌、諾卡菌對可的松和皮質(zhì)醇也有較高的脫氫活力。第17頁/共37頁

四、還原反應

微生物催化的還原反應有各種類型：有的是甾類化合物上的醛或酮基被還原成伯醇或仲醇基；也有的是甾類核的A環(huán)或B環(huán)中的雙鍵被加氫還原成飽和鍵等。第18頁/共37頁

五、水解反應

微生物進行的水解反應包括脫?；磻?、環(huán)氧化物的水解反應等。

第19頁/共37頁第三節(jié)甾類激素的生產(chǎn)工藝過程

甾體的微生物轉(zhuǎn)化和一般的氨基酸、抗生素的生產(chǎn)不同，發(fā)酵的產(chǎn)物不是目的產(chǎn)物，而只是利用微生物的酶對甾體底物的某一部位進行特定的化學反應來獲得一定的產(chǎn)物。整個生產(chǎn)過程，微生物的生長和甾體的轉(zhuǎn)化完全可以分開。第20頁/共37頁一般先進行菌的培養(yǎng)，在菌生長過程中累積甾體轉(zhuǎn)化所需要的酶，然后利用這些酶來改造分子的某一部位。為了獲得較多的酶，首先需保證菌體的充分生長，但微生物的生長與酶的生產(chǎn)條件不是完全一致的。

第21頁/共37頁一、甾類激素生產(chǎn)的原料早期合成甾類激素的起始原料大多來自動物的膽甾醇、膽酸等。因這些原料的來源少、含量低、成本高，不能滿足生產(chǎn)的需要。因而促使從植物中尋找起始原料并獲得成功。已經(jīng)大量投產(chǎn)的甾類原料：膽固醇、膽酸、薯蕷皂苷配基（穿龍薯蕷和盾葉薯蕷）、豆甾醇、澳洲茄堿等。第22頁/共37頁二、甾類激素的微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)流程

甾體的微生物轉(zhuǎn)化通常分兩個階段：第一階段是生長階段；第二階段是轉(zhuǎn)化階段第23頁/共37頁第24頁/共37頁大多數(shù)甾體化合物難溶于水，通常是先把底物溶于有機溶劑，如丙酮、乙醇、甲醇，濃度在2％時對微生物無毒性?；蛴帽砻婊钚詣?如吐溫80)來提高基質(zhì)溶解度。甾體氧化需要較大的通氣量，一般1：0.8(vvm)。甾體加入的速度隨菌種轉(zhuǎn)化能力和基質(zhì)的性質(zhì)而定，一般濃度約200～800mg／L，采用基質(zhì)的定期加入和連續(xù)加入的辦法來解決基質(zhì)或產(chǎn)物的毒性問題。第25頁/共37頁轉(zhuǎn)化時間隨菌種而異，一般范圍在12～72h。轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物大多不溶于水，所以采用溶劑萃取法進行提取。如果產(chǎn)物分泌在發(fā)酵液中，則發(fā)酵濾液采用離子交換樹脂吸附法吸附甾體化合物，洗脫后，減壓濃縮進行結(jié)晶。第26頁/共37頁二、甾體微生物轉(zhuǎn)化方式進行微生物轉(zhuǎn)化反應可以利用不同形式的微生物細胞，如菌體培養(yǎng)物、靜止細胞懸液、孢子懸液、混合培養(yǎng)物、固定化細胞或固定化酶等。靜態(tài)菌體懸液

優(yōu)點：能自由地改變反應液中的基質(zhì)和菌體量的比例，與生長培養(yǎng)法相比一般能縮短反應時間，在轉(zhuǎn)化生長物中雜質(zhì)較少，分離提純比較容易等。第27頁/共37頁混合培養(yǎng)

混合培養(yǎng)進行反應是將具有1，2脫氫能力和11β羥化能力的微生物并用進行轉(zhuǎn)化反應?？墒÷猿樘岵僮鳌?/p>

第28頁/共37頁第29頁/共37頁第30頁/共37頁第四節(jié)氫化可的松的制備

氫化可的松又稱為皮質(zhì)醇?；瘜W名稱為11β，17a，21一三羥基孕甾-4烯-1，20-二酮。其結(jié)構(gòu)式為：第31頁/共37頁氫化可的松為皮質(zhì)激素類藥物，具有影響糖代謝、抗炎、抗毒、抗休克及抗過敏等作用。主要用于腎上腺皮質(zhì)功能不足和自體免疫性疾??；應用于某些感染的綜合治療。消化性潰瘍病、骨質(zhì)疏松癥、精神病、重癥高血壓患者忌用，充血性心力衰竭、糖尿病、急性感染病慎用。由于氫化可的松療效確切，為重要的甾體激素類藥物之一，在國內(nèi)生產(chǎn)的激素類藥物中產(chǎn)量最大。第32頁/共37頁

1．反應原理第33頁/共37頁

2．工藝過程

將犁頭霉菌接種到土豆斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7～9天，成熟孢子用無菌生理鹽水制成孢子懸液后。種子培養(yǎng)基用葡萄糖、玉米漿、硫酸銨等配制，pH值為5．8～6．3，接入孢子懸液后，在通氣攪拌下28℃培養(yǎng)28～32h。待培養(yǎng)液菌濃度達到35％以上，無雜菌污染，即可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐。第34頁/共37頁將玉米漿、酵母膏、硫酸銨、葡萄糖及水投入發(fā)酵罐中攪拌，用NaOH調(diào)整物料pH值到5.7～6.3，加入O.03％豆油，滅菌溫度120℃

，通入無菌空氣，降溫至27～28℃

，接入犁頭霉孢子懸浮液，通氣攪拌發(fā)酵28～32h。用NaOH調(diào)pH值到5.5～6.0，投入發(fā)酵液體積0.15％的萊氏化合物S，氧化48h后，取樣做比色試驗檢查反應終點。

第35頁/共37頁到達終點后濾除菌絲，濾液用樹脂吸附，然后用乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)減壓濃縮至適量，冷卻到0～10