基因工程操作的程序

基因工程操作的程序第1頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是從原核生物中分離純化出來的一種酶。能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性核酸內(nèi)切酶。4000種。1、來源：2、種類：3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端一、“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶粘性末端平末端第2頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制酶什么叫黏性末端？第3頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四限制酶什么叫黏性末端？第4頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四什么叫黏性末端？

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。第5頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四什么叫平末端？

當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。第6頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四第7頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四限制酶所識別的序列有什么特點？限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。圖1-1限制酶識別序列的中心軸線第8頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四二、“分子縫合針”——DNA連接酶1、種類：2、作用部位：E·coliDNA連接酶:T4DNA連接酶:

磷酸二酯鍵

DNA連接酶可把兩個DNA片段之間的縫隙“縫合”起來，這樣一個重組的DNA分子就形成了。只能連接黏性末端連接黏性末端和平末端第9頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四T磷酸二酯鍵1234512345A第10頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四第11頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四右圖示某DNA片段，有關(guān)該圖的敘述中，不正確的是A．②③④可形成DNA的基本組成單位B．②③④構(gòu)成的結(jié)構(gòu)在DNA中特定排列順序可代表遺傳信息C．某限制性內(nèi)切酶可選擇⑦作為切點D．DNA連接酶可連接①處斷裂的化學(xué)鍵C第12頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四第13頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？答：不是一回事?；蚬こ讨兴玫倪B接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E·coli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4連接酶。這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口（nick），而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團的羥基之間形成），那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？第14頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四（1）DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。第15頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四三、“分子運輸車”—基因進入受體細胞的載體：第16頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四第17頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四第18頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四§1.2基因工程的基本操作程序第19頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四補：原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點，并與其結(jié)合。

轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。

轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。第20頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點。啟動子第21頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四補：真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：第22頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子第23頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第24頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定第25頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的基因請舉出三個以上的例子2、獲取目的基因的常用方法有哪些?（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴增（3）人工合成第26頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四(一)從基因文庫中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）1.基因文庫第27頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系第28頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四2.基因文庫的構(gòu)建方法①鳥槍法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶與載體連接載入受體細胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴增目的基因分離(直接分離法)(一)從基因文庫中獲取目的基因第29頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四②反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶H2.基因文庫的構(gòu)建方法DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)(cDNA)第30頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四③根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成2.基因文庫的構(gòu)建方法第31頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因?qū)Ｒ恍詮姴僮鬟^程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因思考:為什么要構(gòu)建基因文庫?直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎?第32頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________(做啟動子)、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈式反應(yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增(二)利用PCR技術(shù)擴增目的基因有一段已知目的基因的核苷酸序列第33頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四PCR三步曲

預(yù)變性保溫變性90~95℃延伸70~75℃退火55~60℃第34頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四PCR反應(yīng)參數(shù)：

變性94℃20s退火52℃20s延伸72℃20s

預(yù)變性94℃30s

保溫72℃30s循環(huán)次數(shù)30第35頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第36頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四(二)利用PCR技術(shù)擴增目的基因第37頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四PCR反應(yīng)的特點特異性強靈敏度高完全自動化標本純度要求低第38頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

PCR儀的介紹中學(xué)專用PCR儀科研用PCR儀第39頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

中學(xué)專用PCR儀是我公司根據(jù)生物新課標要求，結(jié)合中學(xué)教學(xué)特點研制而成的。本產(chǎn)品也是經(jīng)過教儀所專家質(zhì)檢認證的，專門為中學(xué)教學(xué)而設(shè)計，與科研用儀器相比具有許多優(yōu)點：

1.操作簡便，實驗直觀

2.PCR原理完整展現(xiàn)

3.彩色大屏幕，中文菜單，便于學(xué)習(xí)加深理解第40頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。(二)基因表達載體的構(gòu)建——

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同第41頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）——

核心同一種(二)基因表達載體的構(gòu)建4.過程:第42頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四5.基因表達載體的組成：復(fù)制原點+啟動子+目的基因+終止子+標記基因它們有什么作用？第43頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞轉(zhuǎn)化——目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達第44頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四1、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ恨r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）農(nóng)桿菌介紹（2）原理及適用范圍(雙子葉植物和裸子植物)(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞第45頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞轉(zhuǎn)化方法將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞第46頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四2、將目的基因?qū)雱游锛毎?）方法：顯微注射法（2）程序：(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?）思考：為什么選用微生物作為受體細胞？（2）方法：第47頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定——①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交第48頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第49頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡單,大小適中能在宿主細胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個多個限制酶切位點具標記基因質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒第50頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四1）以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體

C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接

D