大腸桿菌培養(yǎng)基的優(yōu)化及發(fā)酵罐操作

大腸桿菌培養(yǎng)基的優(yōu)化及發(fā)酵罐操作第1頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四目錄大腸桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基配置培養(yǎng)方式培養(yǎng)條件操作流程具體步驟參數(shù)控制注意事項(xiàng)第2頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四大腸桿菌大腸桿菌是基因工程中常用的宿主菌,許多有價(jià)值的多肽和蛋白在大腸桿菌中已成功地進(jìn)行了表達(dá),表達(dá)水平有些高達(dá)細(xì)胞總蛋白的30%以上.大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主,由于具有遺傳背景清楚,目的基因表達(dá)水平高,技術(shù)操作、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單,抗污染能力強(qiáng),大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),倍受遺傳工程專家重視,是目前應(yīng)用最廣泛,最成功的表達(dá)體系.第3頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四高密度培養(yǎng)技術(shù)高密度培養(yǎng)技術(shù)：是應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)和設(shè)備來(lái)提高菌體生物量和目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)空產(chǎn)率的發(fā)酵技術(shù)。

第4頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四利用一般的發(fā)酵工藝生產(chǎn)大腸桿菌或以其組建的基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)物,大腸桿菌的生物量,表達(dá)產(chǎn)物在菌體內(nèi)和發(fā)酵液中的濃度比較低,難以獲得理想的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。應(yīng)用高密度發(fā)酵不但可獲得較高的生物量,而且可顯著提高目的基因表達(dá)產(chǎn)物的濃度。高密度發(fā)酵對(duì)發(fā)酵設(shè)備有較高的要求,而且對(duì)發(fā)酵條件也有非常高的要求。影響高密度發(fā)酵的因素非常多,如細(xì)菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)抑制物的積累、溶氧濃度、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液的pH值、補(bǔ)料方式及發(fā)酵液流變學(xué)特性等。第5頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

大腸桿菌高密度培養(yǎng)最關(guān)鍵的問(wèn)題是代謝副產(chǎn)物乙酸積累所引起的抑制和毒害作用。預(yù)防措施：1、通過(guò)控制比生長(zhǎng)速率來(lái)減少乙酸的產(chǎn)生：比生長(zhǎng)速率越高，乙酸產(chǎn)生越多，當(dāng)比生長(zhǎng)速率超過(guò)某個(gè)值時(shí)，乙酸開始產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^(guò)降低溫度，調(diào)節(jié)酸堿度，控制補(bǔ)料等方法來(lái)降低比生長(zhǎng)速率。2、透析培養(yǎng)：在大腸桿菌的培養(yǎng)過(guò)程中可以用透析技術(shù)除去發(fā)酵液中的有害物質(zhì)，降低乙酸含量從而實(shí)現(xiàn)重組菌的高密度發(fā)酵和產(chǎn)物的表達(dá)。3、控制葡萄糖的濃度：葡萄糖是大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中重要的碳源之一，用其作碳源是要將其控制在一個(gè)較低的水平上，以減少乙酸的產(chǎn)生。第6頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基選擇

LB培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基):胰蛋白胨5g,酵母粉2.5g,NaCl5g,溶于500mlH2O,NaOH調(diào)節(jié)pH7.0,2L三角瓶裝,滅菌鍋濕熱高壓滅菌121℃,20min,室溫保存.TB培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基):胰蛋白胨240g,酵母粉480g,甘油80g,消泡劑1ml,溶于H2O,定容至19L,B.Braun發(fā)酵罐在位滅菌121℃,15min.第7頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基配制配制種子固體培養(yǎng)基100mL，分裝試管，0.1MPa滅菌20min，然后擺成斜面。配制種子培養(yǎng)液600mL，分裝50mL于一個(gè)250mL三角瓶中（作一級(jí)種子瓶），余下550mL平均分裝于三個(gè)500mL三角瓶中（作二級(jí)種子用），同上滅菌。第8頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)方式微生物的培養(yǎng)方式主要有分批、連續(xù)和補(bǔ)料分批3種。大腸桿菌發(fā)酵大多采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)，這是在現(xiàn)代發(fā)酵工藝得到優(yōu)化的一種方式，能有效的優(yōu)化微生物培養(yǎng)過(guò)程中的化學(xué)環(huán)境。使微生物處于最佳的生長(zhǎng)環(huán)境。這種方式一方面可以避免某些營(yíng)養(yǎng)成分初始濃度過(guò)高出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，另一方面能夠防止限制性營(yíng)養(yǎng)成分被耗盡而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成。補(bǔ)料分批培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于各種各樣的初級(jí)、次級(jí)生物產(chǎn)品和蛋白等的發(fā)酵生產(chǎn)中。培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分過(guò)高會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，采用流加補(bǔ)料是提高細(xì)胞濃度和外源蛋白產(chǎn)量的有效方式，高密度培養(yǎng)通過(guò)調(diào)節(jié)限制性底物的流加速率來(lái)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。第9頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)條件1、溫度：36~38℃2、pH：73、攪拌速率：100~200r/min4、溶氧:20~50%5、通風(fēng)：2~3L/min6、接種量：1~2%第10頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四操作步驟1、菌種準(zhǔn)備2、上罐前的準(zhǔn)備及實(shí)罐滅菌3、發(fā)酵操作4、發(fā)酵管理5、發(fā)酵過(guò)程中各生化指標(biāo)的測(cè)定6、補(bǔ)料7、放罐8、清洗第11頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四菌種準(zhǔn)備1、上罐前兩天，從冰箱中取出菌種轉(zhuǎn)接斜面，37℃培養(yǎng)24h。2、上罐前一天，由斜面菌種轉(zhuǎn)接一級(jí)種子瓶，37℃振蕩培養(yǎng)12h，然后轉(zhuǎn)接二級(jí)種子瓶，37℃振蕩培養(yǎng)10h。第12頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四上罐前的準(zhǔn)備及實(shí)罐滅菌1、洗凈發(fā)酵罐及各聯(lián)接膠管2、配制發(fā)酵培養(yǎng)基5.0L，置發(fā)酵罐內(nèi)，加入幾滴泡敵。3、校正pH電極和溶氧（DO）電極。4、把電極插口、取樣管、補(bǔ)料口、消泡劑料瓶等固定、密封好后，開夾套出、進(jìn)水閥V2、W1，使夾套充滿水，用保護(hù)罩蓋住罐蓋及發(fā)酵罐，用傾倒螺釘鎖緊法蘭，開保護(hù)罩頂部排氣閥V4，啟動(dòng)蒸氣發(fā)生器，啟動(dòng)攪拌馬達(dá)，調(diào)轉(zhuǎn)速300r/min，開啟冷凝水出水閥V1，開啟蒸氣閥門S1，進(jìn)行在位滅菌。第13頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵罐第14頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四上罐前的準(zhǔn)備及實(shí)罐滅菌5、當(dāng)保護(hù)罩頂部閥門V4有蒸氣排出時(shí)，2min后關(guān)閉閥門，當(dāng)罐溫接近滅菌溫度時(shí)，微開閥V4適當(dāng)排氣，并調(diào)整蒸氣閥S1維持罐溫。保溫結(jié)束后，關(guān)蒸氣閥S1，全開冷凝水出水閥V1，開進(jìn)水閥W3，將溫度設(shè)定在37℃，切入自動(dòng)。6、當(dāng)溫度降到100℃以下，緩緩開排氣閥V4，使保護(hù)罩頂壓力表指示為零，移去保護(hù)罩。第15頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四上罐前的準(zhǔn)備及實(shí)罐滅菌7、連接通氣管路，將進(jìn)氣過(guò)濾器K7口與控制臺(tái)左側(cè)空氣出口連通，開彈簧夾，接通空氣壓縮機(jī)電源，對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行通氣，調(diào)整空氣流量3～5L/min。8、當(dāng)溫度達(dá)到37℃時(shí)，將預(yù)先滅菌的pH電極、DO電極（75%酒精消毒、UV消毒）接入發(fā)酵罐，連接各電極導(dǎo)線。第16頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四上罐前的準(zhǔn)備及實(shí)罐滅菌9、將流加堿的管線與泵和罐體連接，通過(guò)面板操作開關(guān)選擇堿泵，打開手動(dòng)開關(guān)，使膠管內(nèi)充滿液體，將輸出上限設(shè)在15%，下限設(shè)為“0”，待一切準(zhǔn)備就緒，將“手動(dòng)”開關(guān)調(diào)節(jié)到“自動(dòng)”狀態(tài)。10、設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min、空氣流量2～3L/min、pH7.0、DO100%，系統(tǒng)進(jìn)入發(fā)酵狀態(tài)。第17頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵操作

當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)溫度達(dá)到并維持在所需溫度后，進(jìn)行如下操作：

1、取樣：松開彈簧夾J2，用無(wú)菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內(nèi)，再夾緊J2，將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾J3，發(fā)酵液被壓入接料瓶，開J2、J3排出取樣管內(nèi)殘料，夾緊J2、J32、接種：將酒精棉置于接種口槽中，旋松接種口，點(diǎn)燃酒精棉，在火焰保護(hù)下，打開接種口，倒入二級(jí)種子，然后旋緊接種蓋，移去火焰圈。接種后立即進(jìn)行第一次取樣，用于測(cè)定細(xì)菌OD值。第18頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵管理控制發(fā)酵過(guò)程的各項(xiàng)參數(shù)（溫度、PH、溶解氧、攪拌速度、空氣流量、泡沫水平等），如參數(shù)出現(xiàn)異常現(xiàn)象，則應(yīng)及時(shí)排除。每小時(shí)取一次樣，每次取樣50ml。取樣時(shí)先將空氣流量計(jì)旋鈕調(diào)至0~1L/min，松開彈簧夾J2，用無(wú)菌空氣將取樣管殘液壓入發(fā)酵罐內(nèi)，再夾緊J2，將出料管放入接料瓶，松開取樣管彈簧夾J3，發(fā)酵液被壓入量筒，當(dāng)達(dá)到40mL，開J2排出取樣管內(nèi)殘料，夾緊J3、J2。將樣液入標(biāo)記有取樣時(shí)間的三角瓶，用保鮮膜封口，立即入冰箱冷藏，取完樣要及時(shí)清洗量筒。每次取樣前（每隔1小時(shí)）記錄發(fā)酵過(guò)程溫度、PH值、DO、通風(fēng)、轉(zhuǎn)速的測(cè)定數(shù)值，并記錄操作情況。第19頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵過(guò)程中各生化指標(biāo)的測(cè)定

發(fā)酵過(guò)程中，雖然能自動(dòng)控制溫度和pH兩個(gè)重要條件，但仍需專人負(fù)責(zé)照看。完成下列工作：（1）經(jīng)常注意發(fā)酵罐運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常，檢查各控制參數(shù)是否在合適的范圍內(nèi)，遇有故障及時(shí)排除。（2）每小時(shí)取樣測(cè)定細(xì)菌光密度值，進(jìn)行革蘭氏染色及鏡檢，以了解菌生長(zhǎng)情況及檢查是否有雜菌污染。（3）隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)進(jìn)氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，以維持一定的DO值。第20頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵過(guò)程中各生化指標(biāo)的測(cè)定（4）定時(shí)取樣用裴林快速定糖法測(cè)定培養(yǎng)液中還原糖的含量。測(cè)定步驟如下：①發(fā)酵液中糖含量小于4％時(shí)，直接取發(fā)酵液0.5ml于錐形瓶中，若糖含量大于4％時(shí)，先稀釋10倍后，取稀釋液0.5ml于錐形瓶中。②向錐形瓶加入裴林試劑甲液和乙液各5ml，混勻，加熱至沸騰。③用0.1％標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失，記錄消耗葡萄糖液的體積數(shù)（V）。④取0.5ml蒸餾水于錐形瓶中，同法進(jìn)行滴定，記錄消耗葡萄糖的體積數(shù)（V0）。⑤按下公式進(jìn)行計(jì)算：(V0-V)x0.1/0.5x稀釋倍數(shù)

V0為葡萄糖滴定空白時(shí)消耗的毫升數(shù)。V為葡萄糖滴定樣品時(shí)消耗的毫升數(shù)。第21頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵過(guò)程中各生化指標(biāo)的測(cè)定（5）定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中氨基氮的含量，測(cè)定步驟如下：①取發(fā)酵液經(jīng)3500r／min離心10min。②分別吸取上清液2.0ml于兩個(gè)磨口具塞錐形瓶中，各加蒸餾水5ml。向另一磨口具塞錐形瓶中加入7ml蒸餾水，作空白對(duì)照。③向上述3個(gè)瓶各加中性申醛溶液5.0ml，混勻，加0.5％溴麝香草酚蘭液2滴和0.5％酚酞液4滴。④用標(biāo)準(zhǔn)0.100mol／LNaOH溶液滴定至紫色，分別記錄消耗的NaOH液毫升數(shù)。⑤按下式計(jì)算:(V0-V)x1.4008V為滴定發(fā)酵液時(shí)消耗NaOH溶液的毫升數(shù)。V0為滴定空白時(shí)消耗NaOH溶液的毫升數(shù)。1.4008為1ml0.1mol／LNaOH溶液相當(dāng)?shù)牡量藬?shù)，氨基氮的含量是每毫升中的含量。第22頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵過(guò)程中各生化指標(biāo)的測(cè)定（6）測(cè)定OD值⑴大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取10mL離心管，與105℃烘2h至恒重，用鑷子夾取入干燥器，待冷卻后于分析天平上稱重（W0），精確到小數(shù)后4位，然后準(zhǔn)確取10mL發(fā)酵液，于3000rpm離心10min，棄去上清液，用蒸餾水洗滌沉淀，同上離心，棄上清液，與100℃烘至恒重，用鑷子夾取如干燥器中冷卻，于分析天平上稱重（W1），精確至小數(shù)后4位，得細(xì)胞干重為W1-W0。取同一發(fā)酵液，稀釋2、5、10、20、50倍，于600nm下測(cè)OD值。以0D值為縱坐標(biāo)，菌液濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑵均勻取樣品5mL于編號(hào)試管中，用空白發(fā)酵液稀釋至一定濃度，在721分光光度計(jì)上測(cè)定A600，根據(jù)菌體濃度與吸光度之間關(guān)系地標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出菌體濃度。⑶其余發(fā)酵液于3℃，2000r/min條件下離心分離8min,上清液裝入編號(hào)三角瓶，用于測(cè)糖。第23頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵過(guò)程中各生化指標(biāo)的測(cè)定（7）當(dāng)發(fā)酵到一定時(shí)候，光密度值達(dá)到1～1.5，發(fā)酵液中還原糖和氨基氮含量較低時(shí)，開始補(bǔ)料，并在發(fā)酵結(jié)束前一小時(shí)終止。（8）每小時(shí)記錄發(fā)酵過(guò)程溫度、pH和DO的測(cè)定數(shù)值，并記錄操作情況。第24頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四大腸桿菌流加發(fā)酵策略

大腸桿菌是迄今為止遺傳背景最清楚的菌株，廣泛用于基因工程的研究中。大腸桿菌高密度培養(yǎng)時(shí)最關(guān)鍵的問(wèn)題是如何盡量減少乙酸的產(chǎn)生，因?yàn)楦邼舛绕咸烟腔蚋弑壬L(zhǎng)速率帶來(lái)的高濃度乙酸會(huì)嚴(yán)重抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和重組蛋白的生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，即使葡萄糖濃度只有0.25～0.5g/L，大腸桿菌仍會(huì)產(chǎn)生乙酸。因此，高細(xì)胞密度發(fā)酵所采用的流加策略必須按照一定的算法制定，以保持反應(yīng)器中底物濃度處于較低的水平。營(yíng)養(yǎng)物最好以它們的消耗速率加入反應(yīng)器中，這樣不僅可以防止底物積累到毒性水平，也不會(huì)使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)。第25頁(yè)，共29頁(yè)，2023年，2月20日，星期四補(bǔ)料方式

采用簡(jiǎn)單反饋控制補(bǔ)料，又稱單一循環(huán)法，此法控制與營(yíng)養(yǎng)物利用相偶聯(lián)的pH或溶解氧濃度等參數(shù),使之保持恒定。例如,預(yù)先設(shè)定pH恒定值,發(fā)酵中菌體代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)或銨