DB2310T 007-2019黑木耳液體菌種生產技術規(guī)程

ICS65.020.20B05牡丹DB2310江市地方標準DB/T007—2019牡丹江市市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB2310/T007—2019前言本標準依據(jù)GB/T1.1-2009的編寫規(guī)則起草。本標準由黑龍江省食用菌標準化技術委員會牡丹江分委員會提出并歸口。本標準起草單位：黑龍江省農業(yè)科學院牡丹江分院。本標準主要起草人：王延鋒、于海洋、張運岐、羅連富、賈利陽、楊峰山、丁仕波、史磊、張榮芳、高天一、董雪梅、王金賀、劉姿彤、谷維、潘春磊、盛春鴿、張鵬、宋佳鑫、趙鶴、趙靜。1DB2310/T007—2019黑木耳液體菌種生產技術規(guī)程1范圍菌種保藏及運輸、記錄與檔案。本標準適用于黑木耳液體菌種的生產。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB150壓力容器GB3095環(huán)境空氣質量標準GB5749生活飲用水衛(wèi)生標準GB/T12728食用菌術語GB/T13554高效空氣過濾器GB15618土壤環(huán)境質量農用地土壤污染風險管控標準GB22207容積式空氣壓縮機安全要求GB50073潔凈廠房設計規(guī)范NY/T528食用菌菌種生產技術規(guī)程NY/T2375食用菌生產技術規(guī)范3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1經不同方法選育出來的具有特異性、遺傳型、穩(wěn)定性，適用于液體發(fā)酵、固體栽培的食用菌菌種。3.2黑木耳液體菌種用液體培養(yǎng)基，在生物發(fā)酵罐中，通過深層培養(yǎng)(液體發(fā)酵)技術生產的液體形態(tài)的黑木耳菌種。3.3液體菌種發(fā)酵罐也稱之為食用菌液體菌種培養(yǎng)器，是指進行食用菌液體菌種培養(yǎng)的專用設備。要求不銹鋼材質，符2DB2310/T007—2019合GB150要求。3.4起始pH液體培養(yǎng)基配制后尚未滅菌的pH。3.5終止pH液體菌種達到放罐指標時的培養(yǎng)基pH。3.6發(fā)酵罐空消對尚未投料的空發(fā)酵罐進行高壓蒸汽滅菌。3.7發(fā)酵罐實消對投料后的發(fā)酵罐及發(fā)酵罐內培養(yǎng)基進行高壓蒸汽滅菌。3.8接種量接入發(fā)酵罐中的食用菌菌種的數(shù)量，以菌種體積與培養(yǎng)基體積的百分比表示。3.9通風量發(fā)酵罐培養(yǎng)液體菌種過程中每分鐘通入培養(yǎng)基的無菌空氣的量，以培養(yǎng)基體積/通入空氣體積表示。3.10液體菌種菌齡指菌種接入培養(yǎng)基后，液體菌種的生長發(fā)育時間。3.11放罐液體菌種菌絲生長旺盛，達到生長對數(shù)期時結束培養(yǎng)，在無菌條件下從發(fā)酵罐通過傳送管在0.15MPa壓力下，注射接種到栽培袋中。3.12鏡檢指通過顯微鏡觀察液體菌種的菌絲生長發(fā)育狀態(tài)以及是否有雜菌污染。4生產條件4.1廠址選擇3DB2310/T007—2019應建立在交通便利，地勢干燥，通風良好，水源充足，遠離禽畜舍、垃圾堆積場，無污水、廢氣、廢渣和粉塵等污染源。水質應符合GB5749的規(guī)定；大氣應符合GB3095的規(guī)定；土壤環(huán)境質量應符合GB8的規(guī)定。4.2廠房設置和布局液體發(fā)酵間和接種間按照GB50073潔凈廠房設計規(guī)范執(zhí)行，應按液體菌種生產工藝流程合理安排布局，無菌區(qū)與有菌區(qū)有效隔離。4.3基礎設備菌種配制室、滅菌室、無菌凈化操作室、恒溫培養(yǎng)室、發(fā)酵罐培養(yǎng)室、化驗室和菌種室，要有調溫設施，排水系統(tǒng)，排氣設備，進入無菌區(qū)緩沖間，規(guī)模要配套，布局合理。4.4生產儀器和設備T凈化工作臺、冰箱、磅秤、天平、液體菌種接種槍、恒溫回旋式振蕩器應符合相關的使用規(guī)定。4.5檢驗設備恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、天平、酸度計等、玻璃三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、定量定性濾紙、精密pH試紙。5菌種選擇應選用適于當?shù)卦耘唷l(fā)菌出耳及轉潮快、抗逆性強、優(yōu)質、高產、商品性好，經省級以上農作物品種審定委員會審(認)定的品種。菌種生產應符合NY/T528的規(guī)定。6液體菌種生產技術要求6.1工藝流程生產。4DB2310/T007—2019程6.2母種制備6.2.1母種培養(yǎng)基的制作按照附錄A.1配方配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)或附錄A.2配方配制綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(CPDA)，分裝至試管長度五分之一處，使用棉塞或膠塞封住試管口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，溫度121℃，滅菌30min，滅菌結束擺放斜面冷卻凝固。6.2.2接種與培養(yǎng)無菌條件下，用接種鉤取黃豆粒大小的原始菌種接種在母種培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度避光培養(yǎng)10d-15d。6.3搖瓶菌種制備6.3.1搖瓶培養(yǎng)基的制作BGBminminL用封口膜封口，滅菌壓力為0.125Mpa，滅菌時間40min。滅菌時加蓋牛皮紙防潮。6.3.2接種與培養(yǎng)無菌條件下，用接種鏟將母種接入搖瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶接15-20塊，接種完成貼好標簽置于25℃培養(yǎng)溫度為25℃-28℃。培養(yǎng)期間定期檢查，除去污染或異常菌種，并留樣用于檢測。6.4液體菌種制備6.4.1投料前準備檢查發(fā)酵罐罐體有無變形，全部閥門、壓力表、控制面板，有內置電加熱棒的發(fā)酵罐，加熱棒是否完好，有無漏電，是否能夠正常工作。對罐體內、外用流水進行沖洗，達到無死角、內壁無任何培養(yǎng)料殘余物。5DB2310/T007—2019發(fā)酵罐每次使用前要對罐體進行空消，有內置加熱棒的空消時加水必須沒過加熱棒，121℃-124℃滅菌60min；用外源蒸汽滅菌的發(fā)酵罐，蒸汽壓力達到0.105Mpa-0.125Mpa，121℃-124℃滅菌40min。6.4.2液體培養(yǎng)基的制作6.4.3投料與定容將原材料用冷水溶解，倒入或用泵抽入發(fā)酵罐中，加水定容至罐體規(guī)定體積，如果用到馬鈴薯等固體原料需要提前用開水煮沸30min，宜用三層紗布過濾，再將濾液與其他培養(yǎng)料攪拌均勻。6.4.4起始pH6.4.5發(fā)酵罐實消發(fā)酵罐內蒸汽壓力達到0.125Mpa，溫度達到124℃時，內置罐需下排料1次，外置罐需要上下排料各1次，滅菌時間保持60min，溫度上升過程需將排氣閥微開防止罐體內形成假壓，保壓過程保持排氣閥微開。6.4.6冷卻滅菌結束后將冷水通入發(fā)酵罐夾層或內置冷卻系統(tǒng)中循環(huán)降溫，降溫過程中向發(fā)酵罐內通入無菌空氣同時打開排氣閥，培養(yǎng)基溫度降溫至24℃-28℃停止通入冷凝水，罐內壓力維持在0.05Mpa。6.4.7接種按下列步驟完成：a)用無菌水噴灑發(fā)酵罐上方進行降塵處理；b)在接種口放置內徑略大于接種口并蘸有95%酒精的紗布火焰圈，點燃火焰圈；c)調節(jié)壓力表，使發(fā)酵罐內壓降至0.01Mpa，打開入料口同時關閉排氣閥，火焰旁打開已經表面消毒的搖瓶菌種封口膜，灼燒瓶口后迅速將菌種倒入發(fā)酵罐中；d)用火焰外焰灼燒接種口蓋，迅速擰緊，移走火焰圈同時打開排氣閥，調整壓力表保持發(fā)酵罐壓力6.4.8液體菌種培養(yǎng)培養(yǎng)階段應滿足下列條件：b)罐壓保持在0.03Mpa-0.05Mpa；6.4.9液體菌種檢測取樣：接種1d后進行隔天檢測，用酒精燈外焰灼燒取樣閥，棄掉最初流出液體，取一定量的液體流入無菌三角瓶中，備用。6DB2310/T007—2019檢測：將樣品在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察是否有雜菌污染，無雜菌污染觀察菌落生長情況，達到6.5留樣菌種和培養(yǎng)基均應留樣備查：b)搖瓶菌種使用時取樣30mL-40mL，用三角瓶留存；c)發(fā)酵罐實消后的空白培養(yǎng)基取樣30mL-40mL，用三角瓶留存；e)發(fā)酵終止后取樣80mL-100mL，用三角瓶留存。7菌種保藏及運輸液體菌種生產好后，應立即進入菌種生產或栽培袋接種使用，若因某些原因不能立即使用時需降溫保壓處理。一般在4℃－10℃下存放不超過2d。液體菌種不宜長途運輸。8記錄與檔案應建立生產檔案，內容包括產地環(huán)境、品種選擇和質量要求，母種、搖瓶液體種和發(fā)酵罐液體菌種生產的每個環(huán)節(jié)等。生產記錄由具體操作人員現(xiàn)場記錄填寫，定期由主管領導審核，簽字后歸檔，檔案保存7DB2310/T007—2019(規(guī)范性附錄)常用母種培養(yǎng)基及配方A培養(yǎng)基(PDA)配方：馬鈴薯200g(浸出汁)，葡萄糖20g，瓊脂20g，水定容至A.2綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(CPDA)配方：馬鈴薯200g(浸出汁)，葡萄糖20g，瓊脂20g，磷8DB2310/T007—2019B(規(guī)范性附錄)黑木耳液體菌種培養(yǎng)基參考配方AmL。9DB2310/T007—2019(規(guī)范性附錄)黑木耳液體菌種培養(yǎng)放罐指標項目指標發(fā)酵液色澤球狀菌絲體因品種而異，一般呈白色，濾液呈淡黃色或黃褐色，清澈透明。菌液形態(tài)菌液稍粘稠，菌絲體稠密且均勻分布，菌液不混濁。菌液氣味無酸、臭味、霉味、發(fā)酵酒精味等異味。pH5.5-6.0。顯微鏡下菌絲形態(tài)黑木耳菌種液體培養(yǎng)中特有的球狀和從狀菌絲形態(tài)，菌絲粗壯，分布均勻樣品無菌檢查無霉菌、細菌、酵母菌等雜菌菌落生長DB2310/T007—2019D(資料性附錄)黑木耳液體菌種培養(yǎng)檢驗項目項目指標檢驗方法菌液顏色和透明度呈淡黃色或黃褐色，清澈透明。感官鑒定菌液形態(tài)菌液稍粘稠，菌絲體稠密且均勻分布，菌液不混濁。感官鑒定菌液氣味無酸、臭味、發(fā)酵酒精味等氣味。感官鑒定菌絲形態(tài)可見黑木耳菌種液體培養(yǎng)中特有的菌絲形態(tài)，大量分枝菌絲分布，菌絲纖細，有鎖狀聯(lián)合，菌絲內原生質分布均勻、染色劑著色深。顯微鏡(低倍鏡、高倍鏡、