動(dòng)物細(xì)胞的融合與單克隆抗體

2002年１２月３０日，

兩場(chǎng)籌備了10年的“太空婚禮”首次在神舟四號(hào)飛船上舉行，植物細(xì)胞“新人”—黃花煙草和革新一號(hào)煙草葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體，動(dòng)物細(xì)胞“新人”是小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，兩批新人同時(shí)在“產(chǎn)房”—電融合儀內(nèi)孕育新生命。一段時(shí)間后，我國(guó)首批”太空娃娃”終于順利誕生。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞融合率大大提高。STS“太空婚禮”現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四神舟放飛強(qiáng)國(guó)夢(mèng)現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四“太空婚禮”科研項(xiàng)目一：“太空婚禮”科研項(xiàng)目二：

挑戰(zhàn)自我植物體細(xì)胞雜交技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四溫故而知新：哪種植物細(xì)胞工程技術(shù)可以突破不同生物之間的生殖隔離，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，培育出新的作物類型？

植物體細(xì)胞雜交技術(shù)你能回憶出植物體細(xì)胞雜交的過(guò)程嗎？現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞脫分化再分化愈傷組織雜種植株溫故知新:植物體細(xì)胞雜交過(guò)程現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株思考：1、動(dòng)物細(xì)胞融合的概念是什么？2、動(dòng)植物細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上有何區(qū)別？這對(duì)它們雜交或融合過(guò)程有什么影響？3、植物體細(xì)胞雜交誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的方法有哪些？那動(dòng)物細(xì)胞融合呢？4、動(dòng)物細(xì)胞融合與植物原生質(zhì)體融合的基本原理是否相同？是什么原理？5、動(dòng)物細(xì)胞融合有什么意義？主要應(yīng)用在哪些方面？一、動(dòng)物細(xì)胞融合現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四動(dòng)物細(xì)胞A動(dòng)物細(xì)胞B誘導(dǎo)、融合雜合的細(xì)胞有絲分裂2個(gè)完整的雜交細(xì)胞AB討論：6、植物體細(xì)胞雜交可得到雜種植株，動(dòng)物細(xì)胞融合后能象電影上一樣形成雜種動(dòng)物個(gè)體嗎?為什么？植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四1970年，有兩位科學(xué)家做了一個(gè)著名的實(shí)驗(yàn)：人—鼠細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)，以證明細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子是運(yùn)動(dòng)的。人—鼠細(xì)胞是怎樣實(shí)現(xiàn)融合的？動(dòng)物細(xì)胞融合有什么實(shí)踐意義呢？現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四一、動(dòng)物細(xì)胞融合1.細(xì)胞融合：是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞融合為一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。⑴自然發(fā)生：

受精卵⑵人工誘導(dǎo)：

利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合

誘導(dǎo)因素：聚乙二醇、滅活的病毒或電激等。

現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四鼠細(xì)胞人細(xì)胞人工誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四仙臺(tái)病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）①什么是病毒的滅活？滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。②滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開(kāi)，細(xì)胞發(fā)生融合?，F(xiàn)在是11頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四因?yàn)闇缁畹牟《灸苁辜?xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開(kāi)，細(xì)胞發(fā)生融合現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性）現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四正在融合的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞正在融合的雞血細(xì)胞⑶動(dòng)物細(xì)胞融合的原理：細(xì)胞膜的流動(dòng)性現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四

把兩個(gè)不同的動(dòng)物細(xì)胞放在一起，用滅活的病毒處理細(xì)胞，它們先發(fā)生質(zhì)融合，再出現(xiàn)核融合，進(jìn)而形成雜交細(xì)胞。融合后的雜交細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂后仍能形成兩個(gè)完整的雜交細(xì)胞現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四細(xì)胞膜的流動(dòng)性滅活病毒、PEG、電激等融合后的細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，形成完整的雜交細(xì)胞誘導(dǎo)的手段？融合后細(xì)胞的類型？AB雜種細(xì)胞遺傳物質(zhì)有什么特點(diǎn)？三種AA、AB、BB（A、B）含兩種生物的遺傳物質(zhì)動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程原理？現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四物理法的融合效率較高,且對(duì)細(xì)胞（原生質(zhì)體）的傷害小,易操作、控制和觀察。太空中處于失重狀態(tài)，不同種細(xì)胞（原生質(zhì)體）更容易親近；為什么在太空中細(xì)胞（原生質(zhì)體）融合率會(huì)大大上升？為什么選用物理法誘導(dǎo)？現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四2、動(dòng)物細(xì)胞融合的應(yīng)用1.突破有性雜交方法的局限,使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。2.成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等3、重要用途：制備單克隆抗體。現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四獲得雜種植株物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒

物理（離心、振蕩、電激）化學(xué)（聚乙二醇）直接誘導(dǎo)細(xì)胞融合去壁—原生質(zhì)體融合—誘導(dǎo)新壁—雜種植株細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性結(jié)果誘導(dǎo)方法步驟融合的原理動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項(xiàng)目植物、動(dòng)物細(xì)胞融合的比較獲得雜交細(xì)胞小結(jié)1現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四【例1】能使動(dòng)物細(xì)胞融合的特有的誘導(dǎo)因子是（）A.離心B.滅活的病毒C.電刺激D.振動(dòng)【例2】融合后的雜交細(xì)胞的遺傳物質(zhì)有何特點(diǎn)（）具有原來(lái)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的遺傳信息B.能無(wú)限增殖C.可形成新個(gè)體D.培養(yǎng)過(guò)程會(huì)貼壁【例3】動(dòng)物細(xì)胞融合的作用中最重要的是（）A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和B.制備單克隆抗體C.培育新物種D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞

BB初試牛刀A現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四使用相應(yīng)的抗體檢測(cè)乙肝病毒——抗原二、單克隆抗體的制備

醫(yī)院一般怎樣檢測(cè)人體內(nèi)是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式圖

凡能夠引起機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)叫做抗原。1、什么是抗原？例如花粉、病菌、病毒等。有時(shí)自身的組織或細(xì)胞也會(huì)成為抗原，如癌細(xì)胞等?，F(xiàn)在是21頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四抗原決定簇：抗原表面具有的某些特定的化學(xué)基團(tuán)，能決定抗原特異性，是免疫細(xì)胞識(shí)別抗原的重要依據(jù)。各種抗原的決定簇?cái)?shù)目不同，同一抗原的決定簇可能有多種。現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四

2、什么是抗體？由何種細(xì)胞產(chǎn)生？主要分布在哪里?起何作用？

當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激劑后由效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）產(chǎn)生的，并且能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白——抗體。

抗體分布于血清中，也分布于組織液及外分泌液中?，F(xiàn)在是23頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四抗體與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四

抗體由何種細(xì)胞產(chǎn)生？主要分布在哪里?現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四3、抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法：從血清中分離抗體多種漿細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)多種抗體抗原現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四血清抗體（也稱多克隆抗體）由血清中提取的抗體是由不同淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多種抗體的混合物，可達(dá)百萬(wàn)種以上，稱為多克隆抗體。特點(diǎn)：產(chǎn)量低、純度低、特異性差、反應(yīng)不夠靈敏。抗原不純抗體不純

抗原動(dòng)物體內(nèi)刺激效應(yīng)B抗體現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四

每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一，特異性強(qiáng)的抗體。如果利用單個(gè)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性繁殖（克隆），形成細(xì)胞群，這樣的細(xì)胞群就有可能產(chǎn)生出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體——單克隆抗體。問(wèn)題：怎樣獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體呢？現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四在體外培養(yǎng)的條件下，一個(gè)B淋巴細(xì)胞能無(wú)限增殖形成細(xì)胞群?jiǎn)幔渴裁礃拥募?xì)胞能夠在體外無(wú)限增殖呢？

——腫瘤細(xì)胞！現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四

抗體

抗原應(yīng)答抗體的不純性

動(dòng)物細(xì)胞受到抗原刺激,引起免疫反應(yīng)產(chǎn)生的球蛋白.不是自己的而又能引起免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)就是抗原.一種抗原有多種不同的決定簇,刺激的是多種B細(xì)胞,作用于不同的B細(xì)胞后,會(huì)產(chǎn)生多種抗體,這是多克隆的,故不純!

4.制備單克隆抗體的思路抗原

B細(xì)胞漿細(xì)胞抗體

刺激現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四怎么才能得到純的抗體?光純還不行,還要大量.怎么辦?但，有問(wèn)題:找，什么細(xì)胞能無(wú)限繁殖呢?思路就出來(lái)了:要想獲單一的純抗體,就必須從一個(gè)B細(xì)胞出發(fā).讓B細(xì)胞大量繁殖(克隆)就可以產(chǎn)生大量抗體了.B細(xì)胞是不能無(wú)限繁殖的.怎么辦?癌!只有癌細(xì)胞.但它不能產(chǎn)生抗體.癌細(xì)胞能無(wú)限繁殖,但不能產(chǎn)生抗體.B細(xì)胞能產(chǎn)生抗體,但不能大量繁殖.融合呀!只要將兩個(gè)細(xì)胞融合即可互補(bǔ).現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四

5.技術(shù)思路的重點(diǎn)雜交瘤細(xì)胞

HAT篩選McAb大量培養(yǎng)PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合免疫B

脾礦物油骨髓瘤瘤問(wèn)題:在培養(yǎng)體系中,有5種細(xì)胞.B細(xì)胞、瘤細(xì)胞,和雜交細(xì)胞。我們還是拿不到McAb,怎么辦?篩選！篩出雜交瘤細(xì)胞。怎么篩?

又是一個(gè)思路問(wèn)題。關(guān)鍵一步現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四⑵如何誘導(dǎo)融合？

加入聚乙二醇（PEG）⑴如何得到B淋巴細(xì)胞？6.制備單克隆抗體的過(guò)程現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四⑶細(xì)胞兩兩融合后，有哪些類型？B-BB-瘤(雜交瘤細(xì)胞)瘤-瘤⑷如何篩選出雜交瘤細(xì)胞？

單克隆抗體制備過(guò)程中，總共有兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，兩次篩選的原理和方法是不相同的。

①首先用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四①細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。②人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒(méi)有S途徑，可是能不斷分裂增殖。你想到篩選雜交瘤細(xì)胞的方案了么？

小資料：現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四在培養(yǎng)液中加入氨基蝶呤，收集增殖細(xì)胞！加入氨基嘌呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的骨髓瘤細(xì)胞及其彼此融合的細(xì)胞就不能增殖，但人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜種細(xì)胞因?yàn)榭梢岳昧馨图?xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖。現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四例：已知細(xì)胞增殖時(shí)合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細(xì)胞中盡管沒(méi)有S途徑，但能不斷分裂增殖，將兩種細(xì)胞在培養(yǎng)液中混合，加聚乙二醇促融，在培養(yǎng)液中有種細(xì)胞。加入氨基喋呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的及其彼此融合的細(xì)胞不能增殖。人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜交細(xì)胞中可利用淋巴細(xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖。從培養(yǎng)液中分離出雜交細(xì)胞。如何篩選出培養(yǎng)液中的雜交瘤細(xì)胞？5骨髓瘤細(xì)胞現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過(guò)一個(gè)，再由這些單細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，然后檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。②再篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四陽(yáng)性孔方法——抗原-抗體雜交法

在單克隆抗體制備過(guò)程中，兩次篩選的原理和方法是不相同的。現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四⑻如何得到大量的單克隆抗體？

體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)單克隆抗體——化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四注射抗原效應(yīng)B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合多種雜交細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基

篩選1抗原-抗體雜交法克隆化單克隆抗體

篩選24.第一次篩選出的雜交瘤細(xì)胞為何需進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和專一抗體檢測(cè)？現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四單克隆抗體篩選雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體外或體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)篩選骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合特異性雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系提取經(jīng)過(guò)免疫的B淋巴細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備過(guò)程：特點(diǎn)：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖特點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備注射抗原免疫現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四7、單抗隆抗體的應(yīng)用①作為診斷試劑②定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病

用于體外診斷人類和動(dòng)植物疾病及病原鑒定，純度高、特異性強(qiáng)，具有準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速的優(yōu)點(diǎn)。③用于治療疾病和運(yùn)載藥物

利用同位素標(biāo)記單抗，在特定組織成像

制成生物導(dǎo)彈，將藥物定向帶到癌細(xì)胞所在的位置，在原位殺死癌細(xì)胞，療效高、副作用小。單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，并可以大量制備?，F(xiàn)在是47頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四

現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四⑵用于治療疾病和運(yùn)載藥物①特異性強(qiáng)、靈敏度高

生物導(dǎo)彈——單克隆抗體＋抗癌藥物

②療效高、毒副作用小結(jié)合同位素的單抗-----生物導(dǎo)彈現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四結(jié)合同位素的單抗-----生物導(dǎo)彈單抗放射性同位素現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四項(xiàng)目動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性和植物細(xì)胞的全能性融合前提分散成單個(gè)細(xì)胞去除細(xì)胞壁誘導(dǎo)方法聚乙二醇、離心、振動(dòng)、電激、滅活病毒聚乙二醇、離心、振動(dòng)、電激、結(jié)果獲得雜種細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物獲得雜種植株用途制備單克隆抗體培育作物新品種意義使遠(yuǎn)緣雜交成為可能克服遠(yuǎn)緣雜交障礙現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四對(duì)比比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交單克隆抗體的制備原理融合前處理促融方法

用途過(guò)程第一步第二步第三步第四步細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞增殖酶解法去壁小鼠要免疫處理物理法化學(xué)法物理、化學(xué)、生物法原生質(zhì)體的制備融合親本細(xì)胞的準(zhǔn)備原生質(zhì)體的融合與篩選動(dòng)物細(xì)胞融合與兩次篩選雜種細(xì)胞的形成與培養(yǎng)對(duì)產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)雜種植株的鑒定單克隆抗體的分離提純單抗有助于疾病的診斷、治療

獲得具優(yōu)良性狀的雜種植株現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四動(dòng)物細(xì)胞工程小結(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：原理、營(yíng)養(yǎng)、條件、過(guò)程、細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)、結(jié)果、應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞融合：原理、誘導(dǎo)方法、過(guò)程、應(yīng)用單克隆抗體的制備：原理、過(guò)程、特點(diǎn)、應(yīng)用核移植與克隆動(dòng)物：供體、受體、核移植方法、克隆動(dòng)物的方法、克隆動(dòng)物的遺傳特性、應(yīng)用動(dòng)、植物細(xì)胞工程的比較：植物組培技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四⑶圖中B為_(kāi)_______過(guò)程，常用_________作為誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞繼承___________的遺傳特性，既能__________,又能___________

。B體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞足夠數(shù)量的細(xì)胞群注射到小鼠腹腔AC

1.下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計(jì)的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌的抗體實(shí)驗(yàn)方案⑴該實(shí)驗(yàn)方案的目是

；⑵A是從小鼠的脾臟中取得_______,該細(xì)胞能夠產(chǎn)生

；制備單克隆抗體B細(xì)胞專一抗體細(xì)胞融合滅活病毒雙親細(xì)胞分泌專一抗體無(wú)限增殖現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四單克隆抗體的制備1、怎樣獲得能分泌專一抗體的B淋巴細(xì)胞？2、從何處獲得較多的B淋巴細(xì)胞？3、用什么方法可以使B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合？4、怎樣篩選出雜交瘤細(xì)胞？5、篩選出的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體都一樣嗎？6、怎樣獲得只產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞？7、怎樣獲得大量的單一抗體？反復(fù)注射特定的抗原，免疫小鼠。小鼠的脾臟PEG、滅活的病毒等利用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選否用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，稀釋度要保證每個(gè)孔內(nèi)不多于一個(gè)細(xì)胞。抗原抗體雜交法檢測(cè)——呈陽(yáng)性反應(yīng)體內(nèi)或體外大量培養(yǎng)特異的雜交瘤細(xì)胞，從中提取單一抗體。現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四單克隆抗體篩選雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體外或體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)篩選骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合特異性雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系提取經(jīng)過(guò)免疫的B淋巴細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備過(guò)程：特點(diǎn)：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖特點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備注射抗原免疫現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四單克隆抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)抗體檢測(cè)產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)增殖單克隆抗體多種雜交細(xì)胞1、該過(guò)程中用到了兩種技術(shù)小結(jié)2單克隆抗體的制備過(guò)程：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)2、單克隆抗體的制備過(guò)程的三個(gè)“一”：一種誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法，產(chǎn)生了一種新細(xì)胞，得到了一種優(yōu)勢(shì)抗體。滅活病毒誘導(dǎo)融合雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體優(yōu)勢(shì)：特異性強(qiáng)、靈敏度高，可大量制備現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四兩個(gè)過(guò)程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程單克隆抗體制備過(guò)程三個(gè)“一”一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法－－滅活病毒一個(gè)新細(xì)胞－－雜交瘤細(xì)胞一個(gè)優(yōu)勢(shì)－－單克隆抗體特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)本節(jié)小結(jié)重點(diǎn)現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四1975年Kohler和Milstein的單克隆抗體技術(shù)在生產(chǎn)和使用抗體方面開(kāi)創(chuàng)了新紀(jì)元，圖10示單克隆抗體制備流程階段示意圖。請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題：圖10（1）該技術(shù)是在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和

技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。（2）圖10中細(xì)胞A體外培養(yǎng)不具有分裂能力，但能分泌

，細(xì)胞B體外培養(yǎng)能夠

。（3）動(dòng)物細(xì)胞融合常用的方法是

。圖10（1）動(dòng)物細(xì)胞融合（2）分泌特異性抗體、無(wú)限增殖（3）PEG（滅活的病毒、電刺激）現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四（4）細(xì)胞融合是隨機(jī)的過(guò)程，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，要篩選出

細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，為了促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖，常向培養(yǎng)液中加入

（激素）。（5）培養(yǎng)2周后，即測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的特征，篩選出

細(xì)胞置于不同孔內(nèi)（如圖所示）培養(yǎng)。此操作前要將培養(yǎng)細(xì)胞稀釋到7～10個(gè)細(xì)胞/ml，每孔滴入0.1ml細(xì)胞稀釋液，其目的是

。（6）要獲得大量的單克隆抗體，可對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行

培養(yǎng)。（4）雜交瘤、胰島素（5）特異性分泌抗X蛋白抗體的、保證每個(gè)孔內(nèi)不多于一個(gè)細(xì)胞，達(dá)到單克隆培養(yǎng)的目的（單一細(xì)胞培養(yǎng)以保證抗體的純度）、（6）體外或體內(nèi)現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四單克隆抗體制備過(guò)程現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四8.已知細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般DNA不分裂增殖。鼠骨髓瘤細(xì)胞中盡管沒(méi)有S途徑，但能不斷分裂增殖，將這兩種細(xì)胞在試管中混合，加聚乙二醇促融，獲得雜種細(xì)胞。請(qǐng)回答：

⑴試管中除融合的雜種細(xì)胞外，還有

種融合細(xì)胞

2

現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四⑵設(shè)計(jì)一方法（不考慮機(jī)械方法），從培養(yǎng)液中分離出雜種細(xì)胞，并說(shuō)原理。

培養(yǎng)液中加入氨基嘌呤，收集增殖的細(xì)胞。

加入氨基嘌呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的骨髓瘤細(xì)胞及其彼此融合的細(xì)胞就不能增殖，但人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜種細(xì)胞因?yàn)榭梢岳昧馨图?xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖。現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四（1）融合后的雜種細(xì)胞容易成活嗎？（2）制備單克隆抗體的過(guò)程應(yīng)用了哪些細(xì)胞工程技術(shù)手段？

（3）在整個(gè)制備的過(guò)程中要經(jīng)過(guò)幾次篩選？思考：細(xì)胞的同源性越近，融合形成的雜種細(xì)胞越易成活細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)Ⅰ.篩選得到雜交瘤細(xì)胞，Ⅱ.篩選先在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞下培養(yǎng)篩選出特異抗體的細(xì)胞群現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四⑷怎樣篩選出B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞間融合所形成的能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞？用抗體檢測(cè)和克隆化培養(yǎng)得到能分泌所需抗體的雜種細(xì)胞——專一抗體檢測(cè)。18.如何利用雜交瘤細(xì)胞來(lái)大量生產(chǎn)單克隆抗體？①將雜交瘤細(xì)胞在體外大規(guī)模培養(yǎng)，從細(xì)胞培養(yǎng)液中就能提取大量的單克隆抗體；②把雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖，再?gòu)男∈蟾骨恢刑崛慰寺】贵w?，F(xiàn)在是66頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四⑸如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測(cè)及克隆化培養(yǎng)？融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，通常用“有限稀釋法”來(lái)選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過(guò)一個(gè)，通過(guò)培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。陽(yáng)性孔中的細(xì)胞還不能保證是來(lái)自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4次，直至確信每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過(guò)程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)?，F(xiàn)在是67頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四第二次篩選的原理和方法：在實(shí)際免疫過(guò)程中，由于采用連續(xù)注射抗原的方法，且一種抗原決定簇刺激機(jī)體形成相對(duì)應(yīng)的一種效應(yīng)B淋巴細(xì)胞，因此，從小鼠脾臟中取出的效應(yīng)B淋巴細(xì)胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選的雜交瘤細(xì)胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細(xì)胞群中篩選出能產(chǎn)生針對(duì)某一預(yù)定抗原快定簇的特異性雜交瘤細(xì)胞。通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每一孔含一個(gè)或幾個(gè)雜交瘤細(xì)胞（理論上30%的孔中細(xì)胞數(shù)為0時(shí)，才能保證有些孔中是單個(gè)細(xì)胞），再由這些單細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四思考與探究1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不同？植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動(dòng)物細(xì)胞融合是兩個(gè)體細(xì)胞直接融合。誘導(dǎo)融合方法不同：動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)融合所用的方法比植物體細(xì)胞雜交多一類滅活的病毒誘導(dǎo)；結(jié)果不同：植物體細(xì)胞雜交培養(yǎng)成了雜種植株，而動(dòng)物細(xì)胞融合只培養(yǎng)出了雜交細(xì)胞?，F(xiàn)在是69頁(yè)\一共有73頁(yè)\編輯于星期四2.制備單克隆抗體時(shí)，為什么要選用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？哺乳動(dòng)物感染抗原后，其體內(nèi)會(huì)形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動(dòng)物在免疫反應(yīng)的過(guò)程中，每一種B淋巴細(xì)胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖。B淋巴細(xì)胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細(xì)胞是一種癌細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無(wú)限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，它會(huì)兼有兩個(gè)親本細(xì)胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時(shí)能產(chǎn)生出某種特異性的抗體?，F(xiàn)在是70頁(yè)\一共有73頁(yè)\