免疫共沉淀事項

最近我們實驗室想做這個試驗，以前也沒有做過，如果有戰(zhàn)友做過這個試驗，希望介紹點經(jīng)驗和教訓(xùn)，謝謝樂。應(yīng)戰(zhàn)友要求，在網(wǎng)上找樂一下基礎(chǔ)資料，方便大家查看，雖然下面也列出了試驗方法，但在實際實驗室可能并不一樣，希望戰(zhàn)友們較少些自己的親身體會，讓大家和我本人在即將進行的試驗中少走彎路。先謝謝各位了免疫共沉淀免疫共沉淀(Co-lmmunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。其優(yōu)點為：(1)相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài)；(2)蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的,可以避免人為的影響；(3)可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點為：(1)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；(2)兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用；(3)必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么,以選擇最后檢測的抗體,所以,若預(yù)測不正確,實驗就得不到結(jié)果,方法本身具有冒險性。實驗流程為：轉(zhuǎn)染后24-48h可收獲細胞,加入適量細胞裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑),冰上裂解30min,細胞裂解液于4°C,最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清；取少量裂解液以備Westernblot分析，剩余裂解液加1pg相應(yīng)的抗體加入到細胞裂解液,4°C緩慢搖晃孵育過夜；取10plproteinA瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min；將預(yù)處理過的10plproteinA瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與proteinA瓊脂糖珠偶連；免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C以3,000rpm速度離心3min,將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3—4次；最后加入15pl的2xSDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；SDS,Westernblotting或質(zhì)譜儀分析。注意的問題：細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑(NP40或TritonX-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用使用對照抗體：單克隆抗體：正常小鼠的lgG或另一類單抗兔多克隆抗體：正常兔lgG在免疫共沉淀實驗中要保證實驗結(jié)果的真實性，應(yīng)注意以下幾點：確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；要確?？贵w的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀；確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。ChIP是個很郁悶的實驗，時間花費N長，如果做的不好非常打擊人，我也談不上什么成功經(jīng)驗?zāi)?） 顯然抗體來源要可靠，很多在WB上很好的商業(yè)化抗體并不能成功使用到ChIP上。2） 超聲處理要充分，處理完呢以后DNA一定要跑膠檢測看看，如果片段都很大，結(jié)果受到的影響很大，特別是如果ChIP組蛋白謝謝alixtardxy現(xiàn)在好多大牛文章上面都用IP，做的也很漂亮，摸索好了條件，應(yīng)該是不難做的，有個疑問，為什么在WB上能用的在IP上就不能用樂?。繉Σ黄?，我直接想到ChIP上去了,所以才出現(xiàn)了上面的那些說法。你的意思應(yīng)該是chip用的抗體是特殊的吧？即便和WB試驗一樣，抗同樣的抗原。樓主是否把免疫共沉淀的定義和實驗?zāi)康恼f下，這樣方便討論，呵呵這個試驗太陌生了，還望各位多多指教啊ChIP是ChIp（染色質(zhì)免疫沉淀），不是樓主說的Co-IP（免疫共沉淀），二者是風(fēng)馬牛不相及的兩個試驗和概念，原理和目的都不一樣，樓上很多人將二者搞混了.染色質(zhì)免疫沉淀的作用是鑒定蛋白與DNA的結(jié)合，相當于EMSA（凝膠滯留試驗）的體內(nèi)試驗?；驹硎怯每贵w將目標蛋白及其它可能結(jié)合的DNA沉淀下來，然后用引物擴增DNA的序列。因此這個目標蛋白通常具備轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，能夠結(jié)合DNA，目前也有做結(jié)合RNA的Chip。免疫共沉淀的作用是鑒定蛋白與蛋白的相互作用。用抗體將蛋白（A）及其可能結(jié)合的目標蛋白（B）沉淀下來。因此這個A蛋白可以是任何蛋白。"共”指反過來用B的抗體也能將A/B復(fù)合物沉下來。如果是單向的，通常叫免疫沉淀。樓主的帖子“免疫共沉淀的具體注意事項”不適合放在核酸版塊，更適合放在蛋白質(zhì)版塊。相反，“染色質(zhì)免疫沉淀CHIP”適合在該版塊。我做的不是很多，但是有幾點提出來和大家討論下。我想這個試驗最關(guān)鍵的就是細胞的處理和抗體來源。如二樓所說，的確很多WB的抗體是不一定可以用到ChIP上的，這個應(yīng)該是和抗體的制作過程有關(guān)系的。至于多抗還是單抗，我認為各有優(yōu)缺點。比如說單抗是特異性的針對某種表位的，這樣可以選擇幾種單抗混合使用效果會好些，而且背景也低很多。多抗雖然比較復(fù)雜，最主要的是非特異性反應(yīng)比較多，導(dǎo)致試驗結(jié)果不好判斷，但是經(jīng)過合理的純化，應(yīng)該會將這個缺點變小。做ChIP的抗體應(yīng)該是能夠針對空間表位的，雖然某些針對線性表位的抗體也能夠運用其中，但是那只是小部分，所以我認為抗體的來源很關(guān)鍵，無論是購買還是自己制作，都需要對其的特性比較了解。ChIP還有一個問題是細胞的處理，雖然很多公司都提供了現(xiàn)成的試劑可供選擇，但是那只是通用性的試劑，真正適合自己細胞的還需要做預(yù)試驗摸索下。其次是細胞內(nèi)相互作用的蛋白，可能會由于處理導(dǎo)致不發(fā)生作用等等因素導(dǎo)致相應(yīng)值變低，所以我覺得處理時間，溫度等等外部條件還是很重要的。以上是個人觀點，僅供參考！看來我也看錯了，不好意思！目前個人認為生物醫(yī)學(xué)研究的瓶頸就是是否能制備高質(zhì)量的適合多種用途的抗體。很多所謂的主流研究方法都要依賴抗體。例如Westernblot，免疫熒光，流式分析，ELISA，IP，CoIP,ChIP。個人對抗體制備的原理和方法不是很清楚，但是實際過程中很多并不想說明書上說的那樣，結(jié)果是否漂亮，只有用了才知道。Westernblot應(yīng)該是抗體的最基本功能，他的最后原理是抗體結(jié)合到膜上的抗原，然后通過二抗來顯示其位置。免疫共沉淀的抗體就不一樣了，他要保證能夠?qū)⒛愕哪繕说鞍准捌鋸?fù)合物牢固的結(jié)合并通過蛋白A或G將其沉下來。舉個簡單的例子說明二者的不同，不知道是否正確，一男（抗體）與一女（抗原）熱情的接吻，在床上（膜）可能很容易辦到，上述過程類似WB，抗體的功能只是識別固定物（轉(zhuǎn)膜）上的抗原，風(fēng)平浪靜。相反，一男（抗體）與一女（抗原）熱情的接吻，在激流中就不容易辦到，上述過程類似免疫沉淀，是動態(tài)環(huán)境下的識別，而且必須特異性的牢固結(jié)合，這種接吻要求是熱吻，緊密結(jié)合，并且最終用一個鉤子（免疫沉淀中叫蛋白A或G）將男的勾下來后，要保證男的還熱吻者那個女的（即抗原）。因此要求這個男的（抗體）要緊緊的抱住那個女的（抗原）?？上攵ち髦校庖叱恋恚δ械馁|(zhì)量要求更高，一定要保證不與女的分手。如果男的還三心二意，可能抱的是其他的女人，這在免疫沉淀中就會產(chǎn)生非特異性條帶。因此，免疫沉淀一定要設(shè)置對照IG抗體來沉淀，如果隨便一個男的（對照IG）也能將某個女的抱下來，那這個女的就是“博愛”，不是真正需要的最愛（特異條帶）。鑒于目前很多男的（抗體）質(zhì)量不可靠或者不能滿足，因此大量的文獻喜歡采用標簽蛋白（例如，HIS,HA,GFP，MYC等）作為“特異男”來勾引“女”的。個人認為需要一個個試，看那個能夠用于免疫沉淀，有的抗體是針對男的“嘴巴”來設(shè)計的，這種抗體當然能夠容易將女的抱下來，相反有的是針對其他部位設(shè)計制備抗體的，功能也就不一樣了。Co-Ip成功的關(guān)鍵主要有兩個：1）男的質(zhì)量。2）男女接吻時的環(huán)境（例如是否有其他干擾因素，沉淀的時間，溫度，比例，旋轉(zhuǎn)強度等）不對指正。tangdl2000的比喻很有意思，呵呵再次建議樓主把免疫共沉淀的實驗?zāi)康恼f下，這樣方便討論，呵呵想說下免疫沉淀，免疫沉淀是用你的抗體富集目的抗原，然后用WESTERN顯示，你的抗體是否結(jié)合抗原。由于是富集了目的抗原，WESTERN不容易做出來的，用免疫沉淀可能容易出結(jié)果，但是也容易出雜帶。如果看兩個分子是否相互作用，可以用免疫共沉淀。染色質(zhì)免疫沉淀（EMSA）主要用于研究轉(zhuǎn)錄因子的。實驗技巧是為了實驗?zāi)康姆?wù)的，撇開實驗?zāi)康?，單純討論實驗技巧，似不可取。另外建議：發(fā)現(xiàn)很多戰(zhàn)友發(fā)貼，不注明實驗?zāi)康模@樣討論，可能最后發(fā)現(xiàn)所討論的實驗技術(shù)并不是為你的實驗?zāi)康姆?wù)的。GOODLUCK呵呵，由于我的疏忽，把這個帖子置頂了。關(guān)于抗體的問題，我的看法是。1） 對應(yīng)WB而言，使用的抗體識別的抗原應(yīng)該是線性化的抗原（SDS）的作用，因此它識別的不是蛋白在具有正?？臻g結(jié)構(gòu)時的抗原決定簇，而是在蛋白一級結(jié)構(gòu)上相臨的幾個AA組成的抗原決定簇。2） 對應(yīng)FACS而言，多數(shù)情況下，它識別的是具有正常高級結(jié)構(gòu)的蛋白的抗原決定簇，這些抗原決定簇可能是由相鄰近的AA組成的或者是由于蛋白折疊后原本在一級結(jié)構(gòu)上相距比較遠的幾個AA組成的，因此WB和FACS的抗體有時能夠通用，有時不能通用。3） Co-IP的情況，我認為和FACS是相類似的。4） ChIP的情況最為頭痛，因為它涉及了一個crosslink的過程，這個可能造成一些抗原決定簇被封閉掉，而且在免疫共沉淀使用的buffer中含有一些變性劑，進一步影響了抗原抗體的結(jié)合，因此WB可以用的抗體并不一定能用于ChIP，按照現(xiàn)在的說法，如果不是被validated過的抗體，做ChIP可能需要對多個抗體進行優(yōu)化評估靈敏性和特異性。至于是固相雜交還是液像雜交我覺得到不是重點，事實上，和固態(tài)的蛋白芯片相比較，液態(tài)蛋白芯片（luminex）的效率更高，因為抗原抗體有更加充分的機會接觸。我們一般都稱之為IP試驗，這樣就包括染色質(zhì)和蛋白及蛋白和蛋白了謝謝版主的建議，我也是進入實驗室不到一年的時間，接觸IP的時間更短，試驗設(shè)計也是在完善階段，現(xiàn)在主要是實驗技術(shù)方面的知識太欠缺了另外實驗的目的，不便說的太詳細，因為這個實驗有可能投今年的基金，請各位戰(zhàn)友諒解謝謝LZ把你的經(jīng)驗?zāi)贸鰜泶蠹曳窒恚罱苍诖蛩阕雒庖叱恋?，學(xué)習(xí)了各位戰(zhàn)友的經(jīng)驗，受益匪淺。我有個問題想請問大家，我的目的蛋白是個跨膜蛋白，表達在哺乳動物細胞膜上我最終的目的是想把這個蛋白提出來作為抗原去檢測患者血清中的抗體，所以對蛋白的量有一定要求。原來標書寫的步驟是用免疫沉淀的方法來純化蛋白，但我認為這個方案不可行，原因是一、哺乳動物細胞蛋白表達量少、膜蛋白提取的量也少，二、免疫沉淀其實就是用抗體去抓取目的蛋白，代價較大，不可能獲得大量目的蛋白來作為抗原去行Elisa檢測抗體。三、就算我不惜花錢，免疫沉淀最后洗脫的是Beads，得到的是抗原抗體復(fù)合物，會不會影響目標蛋白的抗原性，因為目標蛋白的抗原表位已經(jīng)被確定的一抗結(jié)合了。請各位戰(zhàn)友幫忙看看，給些建議，謝謝了。IP本身的假陽性和假陰性和多，具體的操作過程上面的幾位談的挺多了。我想說的是不管是co-IP還是Chip—定要有陰性control，也就是和一抗相同來源的normalIgG。因為珠子本身可以吸附一定的蛋白和DNA,包括一些抗原抗體的非特異性結(jié)合，所以很多時候陰性control和實驗組時間是量的差別，而不是有或無的關(guān)系。這樣的結(jié)果還是可信的嗎？正好今天我也在第一次做這個實驗，步驟按著這個程序做的，有經(jīng)驗的人幫我看看。1、 Add3mlicecoldRIPAbuffertocellmonolayerandincubateat4°Cfor10minutes.Forsuspensioncells,addtheRIPAbuffertowashedcellpelletina15mlconicalcentrifugetube.2、 Disruptcellsbyrepeatedaspirationthrougha21gaugeneedleandtransfertoa15mlconicalcentrifugetube.3、 Pelletcellulardebrisbycentrifugationat10,000xgfor10minutesat4°C.Transfersupernatanttoafresh15mlconicalcentrifugetubeonice.Preclearlysate(optionalstep)byadding1.0pgoftheappropriatecontrolIgG(normalmouse,rat,rabbitorgoatIgG,correspondingtothehostspeciesoftheprimaryantibody),togetherwith20plofresuspendedvolumeofProteinA/GPLUS-Agarose.Incubateat4°Cfor30minutes.Pelletbeadsbycentrifugationat2,500rpm(approximately1,000xg)for5minutesat4°C.Transfersupernatant(celllysate)toafresh15mlconicalcentrifugetubeonice.4、 Transfer1mloftheabovecelllysate,orapproximately100-500pgtotalcellularprotein,toa1.5mlmicrocentrifugetube.Add1-10pl(i.e.,0.2-2pg)primaryantibody(optimalantibodyconcentrationshouldbedeterminedbytitration)andincubatefor1hourat4°C.5、 Add20plofresuspendedvolumeofProteinA/GPLUS-Agarose.Captubesandincubateat4°Conarockerplatformorrotatingdevicefor1hourtoovernight.6、 Collectimmunoprecipitatesbycentrifugationat2,500rpm(approximately1,000xg)for5minutesat4°C.Carefullyaspirateanddiscardradioactivesupernatant.7、 Washpellet4timeswith1.0mlRIPAbuffer(morestringent)orPBS(lessstringent),eachtimerepeatingcentrifugationstepabove.8、 Afterfinalwash,aspirateanddiscardsupernatantandresuspendpelletin40plof1xelectrophoresissamplebuffer.9、 Boilsamplesfor2-3minutesandanalyze20plaliquotsbySDSandautoradiography.Unusedsamplesmaybestoredat-20°C.10、 Optional:Afterboiling,samplesmaybecentrifugedtopellettheagarosebeadsfollowedbySDSanalysisofthesupernatant.不能理解第三步中Preclearlysate(optionalstep)byadding1.0pgoftheappropriatecontrolIgG(normalmouse,rat,rabbitorgoatIgG,correspondingtothehostspeciesoftheprimaryantibody),togetherwith20plofresuspendedvolumeofProteinA/GPLUS-Agarose.Incubateat4°Cfor30minutes.Pelletbeadsbycentrifugationat2,500rpm(approximately1,000xg)for5minutesat4°C.Transfersupernatant(celllysate)toafresh15mlconicalcentrifugetubeonice.這是什么作用？肯定不是對照了啰?。?！第五步，照上面戰(zhàn)友的說法孵育的溫度、時間、搖床的轉(zhuǎn)速都是很重要的哦？我還準備就在室溫呢，會增加非特異性結(jié)合？抗體的量以及總蛋白的量(或者說他們的比值)重要不？需要嚴格控制不？還是需要調(diào)整？買的是santacruz的抗體，聽說是沒有驗證過的，但說明書上寫明了是可以進行免疫共沉淀的。心里沒底阿。謝謝BecausesomeproteinssuchascomplementcomponentsmaybindtotheFcregionoftheIgG,step3candepletetheseproteinsfromyoursamples.大家的發(fā)言都很精彩，我對IP的了解也是最近才開始的，受益匪淺啊這個protocol繁瑣而且效果很差。1?做co-IP是不宜采用變性能力強的去垢劑的lysisbuffer,所以不能用RIPA應(yīng)采用NP40等弱去垢為基礎(chǔ)的lysisbuffer.而且‘protocol中沒有說明多少的細胞加入3ml的lysisbuffer,我個人的經(jīng)驗是每組一個10cmplate的細胞足夠了，加入1mllysisbufferwithcompleteproteaseinhibitorcocktails。步驟3中的預(yù)處理需不需要的問題。我個人認為，如果抗體質(zhì)量足夠好(沒有明顯的雜帶，或者雜帶確實不會產(chǎn)生影響)，則沒有必要。protocol中為什么有"radioactivesupernatant"?co-IP和CHIP都不會用同位素啊。而且protocol中離心的轉(zhuǎn)速我感覺太低了，通常5000-10000rpm均可，10000rpm30s或者5000rpm2min都不會對抗體抗原-beads復(fù)合物產(chǎn)生影響。4?所有的步驟均需要在4度，主要是抑制蛋白酶活性；抗體的量0.2ug-2ug之間可以，蛋白表達的量最好盡可能的高。santacruz的抗體既然寫了可以做IP,那說明還是沒有問題的。呵呵，devil19840一棒子把這個操作步驟打得這么死啊。明天看看結(jié)果就知道了。建議：有一種免疫沉淀的方案是有"radioactivesupernatant”，我們一般做的是不用同位素的免疫沉淀方案的，看具體的實驗?zāi)康牧恕antacruz的抗體寫了可以做IP,但是出廠不檢驗，看你的運氣了，要多摸索條件。你的抗原是在細胞膜上還是在細胞核上，可根據(jù)情況選擇裂解液。4?免疫沉淀的結(jié)果最好同時有WESTERN對照，這樣可以知道是否成功沉淀了特異性條帶。免疫沉淀本身還有個陰性對照。5.實驗注意低溫，操作細心。GOODLUCK無以為報，投上一票，謝謝。我做的目的蛋白是做成了轉(zhuǎn)基因小鼠了，在肝細胞的胞漿和胞核均有表達的。這次只是預(yù)試驗一下，熟悉整個實驗流程，沉淀得到的產(chǎn)物和提取的總蛋白一起做了個western看有沒有特異性條帶，但沒有陰性對照。沉淀得到的產(chǎn)物和提取的總蛋白sds電泳后考染效果還行，至少沉淀得到的產(chǎn)物除了抗體的兩條粗條帶還有一些細條帶，盡管現(xiàn)在還不能排除是否為非特異性的。但好像在目的蛋白的位置沒有條帶哦，太少？太弱？Godblessme!!作了快半年IP了，都不好意思說，到現(xiàn)在也沒得到好的結(jié)果，同樣也是第一次接觸這個實驗，實驗室沒人做過，只好在網(wǎng)上找方法，**里比較少，只有幾個帖子轉(zhuǎn)貼的方法，未見有討論的。我的實驗?zāi)康氖菣z測細胞轉(zhuǎn)染一種蛋白之后，培養(yǎng)基中的該蛋白分泌情況，在人體中這種蛋白分泌量極低，而且對培養(yǎng)基直接westernblot未見條帶，但對細胞裂解物作western有很強的條帶。該蛋白有信號肽，應(yīng)該分泌出細胞，因無抗體，構(gòu)建載體時在尾部加上了myc和his片段，我的大致試驗過程是：1。 轉(zhuǎn)染該蛋白入HepG2細胞，3小時之后換有或無血清培養(yǎng)基（擔心血清里蛋白影響IP過程），24小時之后收集細胞和培養(yǎng)基。2。 westernblot檢測細胞裂解物和培養(yǎng)基中表達情況，每次細胞中表達都很好。培養(yǎng)基中都沒有見條帶。3。 對培養(yǎng)基的IP：a。1/1000的anti—myc50ul加入到1000ul培養(yǎng)基（直接1000ul,500ul培養(yǎng)基加500ulRIPAbuffer，500ul培養(yǎng)基加500ulTBS都試過），3小時和過夜都嘗試過，boProteinG凝膠50ul加入，1一3小時，（在加抗體之前precl