凝膠電泳實驗報告模板

重慶大學(xué)研究生專業(yè)實驗教學(xué)實驗報告書實驗課程名稱：凝膠電泳實驗實驗指導(dǎo)教師：學(xué)院：專業(yè)及類別：生物學(xué)學(xué)號：姓名：實驗日期：成績：重慶大學(xué)研究生院制一、實驗?zāi)康?.理解凝膠電泳的分類及瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗的基本原理。2.熟練瓊脂糖凝膠電泳實驗的基本操作。3.通過實驗了解凝膠電泳實驗的注意事項并在以后的實驗中盡量避免。4.利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度、濃度和分子量以及分離大小不同的DNA片段。5.了解聚丙烯酰胺凝膠電泳測定DNA和蛋白分子量大小的方法。 二、實驗材料、用具及試劑1.材料：菌落PCR產(chǎn)物（待檢測DNA片段）；2.用具：①瓊脂糖凝膠電泳：電泳儀，水平板型電泳槽，電子天平，微量移液器（10μl），槍頭，三角瓶，點樣板，梳子，微波爐，凝膠成像儀；②聚丙烯酰胺凝膠電泳：垂直板電泳槽，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，梳子；3.試劑：瓊脂糖，1×TAE緩沖液，載樣緩沖液（Loadingbuffer），goldviwe染料，DL5,000DNAMarker(Takara)。三、實驗原理核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段，具有以下優(yōu)點：便于分離、便于檢測和便于回收。其工作原理相對而言比較簡單、主要用到了物理學(xué)的電荷理論。當(dāng)一種分子被放置在電場當(dāng)中時，它們就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O，這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率。它同電場的強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。也就是說，電場強度越大、電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度也就越快，反之則較慢。由于在電泳中使用了一種無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺膠等，從而降低了對流運動，故電泳的遷移率又是同分子的摩擦系數(shù)成反比的。已知摩擦系然后再被分離。當(dāng)通電后，在樣品膠和濃縮膠中，解離度最大的Cl—有效遷移率最大，被稱為快離子，解離度次之的蛋白質(zhì)則尾隨其后，解離度最小的甘氨酸離子(PI=6.0)泳動速度最慢，被稱為慢離子。由于快離子的迅速移動，在其后邊形成了低離子濃度區(qū)域，即低電導(dǎo)區(qū)。電導(dǎo)與電勢梯度成反比，因而可產(chǎn)生較高的電勢梯度。這種高電勢梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動。因而在高電勢梯度和低電勢梯度之間形成一個迅速移動的界面，由于樣品中蛋白質(zhì)的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間，所以，也就聚集在這個移動的界面附近，逐漸被濃縮，在到達(dá)小孔徑的分離膠時，已形成一薄層。⑵電荷效應(yīng)當(dāng)各種離子進(jìn)入pH8.9的小孔徑分離膠后，甘氨酸離子的電泳遷移率很快超過蛋白質(zhì)，高電勢梯度也隨之消失，在均一電勢梯度和pH的分離膠中，由于各種蛋白質(zhì)的等電點不同，所帶電荷量不同，在電場中所受引力亦不同，經(jīng)過一定時間電泳，各種蛋白質(zhì)就以一定順序排列成一條條蛋白質(zhì)區(qū)帶。

⑶分子篩效應(yīng)由于分離膠的孔徑較小，分子量大小或分子形狀不同的蛋白質(zhì)通過分離膠時，所受阻滯的程度不同，因而遷移率不同而被分離。此處分子篩效應(yīng)是指樣品通過一定孔徑的凝膠時，受阻滯的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各種蛋白質(zhì)按分子大小順序排列成相應(yīng)的區(qū)帶。3.1.3瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的特點瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳特點（1）因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲。（2）對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。（3）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用于分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。（4）透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。（5）不吸收紫外光，可直接利用紫外吸收法做定量測定。（6）有熱可逆性。（7）易破碎，濃度不能太低。（8）易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配置。（9）瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。（10）與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。（1）PAGE具有電泳和分子篩的雙重作用（2）PAGE是目前最常用的電泳方法。（3）設(shè)備簡單（4）樣品量?。?-100ug）（5）時間短（30-60min）（6）操作方便（7）分離范圍廣（多肽、蛋白、多糖等）（8）可提高靈敏度改為超微量測定(10-12-10-9)（9）可用于蛋白質(zhì)分子量測定3.2影響DNA遷移速率的決定因素(1)DNA分子的大小:雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比(2)瓊脂糖濃度:濃度越低，相同核酸分子遷移越快表1不同類型和濃度瓊脂糖分離DNA片段的范圍濃度（%）標(biāo)準(zhǔn)(kb)高強度(kb)低熔點(kb)0.31-500.50.7-250.80.5-150.8-100.8-1010.25-120.4-80.4-81.20.15-60.3-70.3-71.50.08-40.2-40.2-420.1-30.1-330.05-146(3)DNA的構(gòu)象:同一分子的遷移速率：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀(4)凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠:溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加(5)所用的電壓:低電壓時DNA片段遷移率與所用的電壓成正比3.3常見瓊脂糖種類及性質(zhì)常見瓊脂糖的種類有兩種,分別為：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點瓊脂糖表2不同類型瓊脂糖的性質(zhì)瓊脂糖類型凝結(jié)溫度/℃熔化溫度/℃標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖35~3890~95不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異40~4285~90高強度瓊脂糖修飾的低熔點/凝點瓊脂糖34~4325~3585~9563~653565超低熔點8~1540~45低黏性低熔點瓊脂糖25~3070388530753.4電泳緩沖液電泳緩沖液是指在進(jìn)行分子電泳時所使用的緩沖溶液，用以穩(wěn)定體系酸堿度，同時電泳緩沖液的另外一個重要作用是使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移。常用的電泳緩沖液有：TAE(Tris-乙酸）緩沖液、TBE（Tris-硼酸）緩沖液，兩者的區(qū)別主要有以下幾點：1）TAE的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE比TAE花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE中遷移快10%；4）對于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，對于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。3.5凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液是臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液，在電泳時具有以下作用：（1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；（2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；（3）其中的染料在電場中以可以預(yù)測的泳動速率向陽極遷移。表36×凝膠載樣緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍(lán)室溫0.25%二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍(lán)4℃40%(m/V)蔗糖水溶液3.6核酸染料電泳后，核酸需經(jīng)染色才能顯色出帶型，溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）是最常用的核酸染色劑，靈敏度高，它可嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出桔紅色熒光。EB-DNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光，比游離的凝膠中的EB發(fā)出的熒光強度大10倍，因此無需洗凈背景即可清楚觀察核酸帶型。但是EB是致癌物，對人體有害，操作時應(yīng)小心保護(hù)，使用EB時的注意事項主要有：（1）EB被認(rèn)為是一種強致癌物質(zhì)（2）EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸（3）EB使用時的配制、貯存及使用：EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml（4）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時，凝膠應(yīng)在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。針對EB的強致癌性，公司開發(fā)了很多其他比較安全的核酸染料，GoodView是目前使用量較多的一款。它與DNA發(fā)生結(jié)合并產(chǎn)生很強的熒光信號，靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈DNA呈現(xiàn)紅色熒光。GoldView特別適合大片段（＞1kb）DNA的檢測，靈敏度高。也可用于RNA的染色。但是在針對小片段的檢測效果不如EB。四、實驗步驟4.1PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)備表4菌落PCR反應(yīng)體系按照表4的體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的的結(jié)果用于凝膠電泳實驗。4.2凝膠電泳4.2.1瓊脂糖凝膠電泳⑴膠濃度的選取：取決于待檢測DNA片段大小，如下表：表5凝膠濃度所對應(yīng)的線性DNA長度本實驗中，DNA片段大小包含在500-10000之間，所以選取1.0%的膠濃度。⑵瓊脂糖稱取其所需取決于所用膠板大小（40ml，80ml、160ml）和濃度（常用范圍0.8%-2.0%）凝膠濃度（%）=瓊脂糖質(zhì)量（g）/膠板體積（ml）本實驗中，膠板大小為40ml，凝膠濃度為1.0%，所以稱取0.4g瓊脂糖。⑶TAE緩沖液配制①50×TAE：

Tris242g

Na2EDTA37.2g

冰醋酸57.1ml

加水定容至1L

②1×TAE：將上述液體稀釋50倍。⑷凝膠的制備①將瓊脂糖加入盛有所需體積電泳緩沖液的三角燒瓶中；②用塞子塞住三角燒瓶頸部，在微波爐中加熱至瓊脂糖融化；③取出待融化的凝膠冷卻至65℃左右加入核酸染料，至終濃度0.5μg/ml，輕輕地旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液；④瓊脂糖溶液冷卻時，用一個合適的梳子插入凝膠托板，置于水平板上；⑤灌入濕熱的瓊脂糖溶液進(jìn)入模具至凝膠溶液完全凝結(jié)，拔出梳子，安放到電泳槽內(nèi)；⑥添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板約1mm為止，等待加樣（提前將凝膠放入到緩沖液中，有利于凝膠中的緩沖體系和外界平衡）。⑸加樣①用10μl微量移液器吸取3μlLoadingbuffer于PE手套上，再吸取5μlPCR產(chǎn)物，將其與Loadingbuffer混勻；②然后將上述混合液加入到凝膠板的點樣孔內(nèi)，加樣時要注意不要弄破凝膠，以防止樣品漏出。⑹電泳①加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60-100V，樣品由負(fù)極(黑色)向正極(紅色)方向移動；②當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳。⑺觀察與拍照①254nm紫外燈下初步觀察；

②凝膠成像系統(tǒng)詳細(xì)觀察、拍照。4.2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳⑴安裝夾心式垂直板電泳槽；⑵配膠；⑶制備凝膠板；⑷樣品的處理及加樣；⑸電泳；⑹染色與脫色；⑺結(jié)果處理。五、實驗結(jié)果及分析瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示圖1瓊脂糖凝膠電泳圖 電泳結(jié)果顯示：⑴擴(kuò)增出目的條帶；⑵電泳條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。結(jié)果分析如下：從圖1中可以看出，本次實驗跑出了條帶，但是存在很多的問題：Mark跑的效果比較差，起到的指示作用相對而言也就比較差；同時PCR產(chǎn)物的各條帶也不亮；拖尾現(xiàn)象比較嚴(yán)重，紅線框標(biāo)定的條帶為我們組的實驗結(jié)果，結(jié)果顯示有輕微的拖尾現(xiàn)象，并且條帶不太亮。針對實驗中出現(xiàn)的各種問題，現(xiàn)將原因總結(jié)如下：⑴拖尾在目的條帶的前面，原因可能是:①樣品破碎或是被降解；②樣品DNA本身不純，存在RNA。⑵拖尾在電泳條帶的后面，原因可能是:①DNA樣品濃度太高，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，這種情況可以通過稀釋模板來解決；②樣品DNA本身不純，蛋白雜質(zhì)阻礙DNA的泳動。(3)Mark跑的條帶效果較差可能的原因有：①Mark加的量較少②瓊脂糖膠做的效果不是太好，核酸染料加的較少。（4）PCR產(chǎn)物不是太亮的問題可能是：①加樣時上樣較少②制膠時添加的核酸染料較少六、實驗小結(jié)6.1瓊脂糖凝膠電泳⑴緩沖系統(tǒng)：①在沒有離子存在時，電導(dǎo)率最小，DNA不遷移，或遷移極慢；高離子強度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確；②長時間高壓電泳時，常更新緩沖液或在兩槽間進(jìn)行緩沖液的循環(huán)是可取的。⑵瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應(yīng)有選擇地使用。⑶凝膠的制備：①凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致；②溶解的凝膠應(yīng)及時倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊；③倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果；④倒膠時，膠的溫度不要高于65℃，溫度太高會使制板變形；⑤膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，不要弄壞點樣孔。⑷加樣：①加樣時槍頭下伸，點樣孔內(nèi)不能有氣泡，緩沖液不要太多；②加樣量勿超過加樣孔最大容納量，避免因樣品過多而溢出，污染鄰近樣品；