(28)-第3.2章單克隆抗體的制備二

第3.2章單克隆抗體的制備二大家好！本節(jié)課我要跟大家一起學(xué)習(xí)的內(nèi)容是單克隆抗體的制備二。如何應(yīng)用雜交瘤技術(shù)獲得針對(duì)特定抗原的單克隆抗體？單克隆抗體制備的具體操作流程是什么？對(duì)此，（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）下面我們將以人肌紅蛋白單克隆抗體的制備為例進(jìn)行具體的介紹。首先，用純的人肌紅蛋白去免疫小鼠，當(dāng)小鼠外周血中的抗體水平達(dá)到一定效價(jià)時(shí)，處死小鼠，分離小鼠脾臟，將其研磨成單個(gè)細(xì)胞，在這些細(xì)胞里面就有我們所需的致敏B細(xì)胞。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）然后，將獲得的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞在PEG的作用下進(jìn)行融合，這個(gè)時(shí)候就可獲得5種細(xì)胞：融合以及未融合的脾細(xì)胞、融合以及未融合的骨髓瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞。對(duì)于融合以及未融合的脾細(xì)胞，因其在體外不能長(zhǎng)期存活，故很快走向死亡；而對(duì)于剩下的融合以及未融合的骨髓瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞而言，因其具有腫瘤細(xì)胞的永生性，因而可以在體外長(zhǎng)期存活。那么，如何去除融合以及未融合的骨髓瘤細(xì)胞？這兒，（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）我們會(huì)用到一種特殊的培養(yǎng)基：HAT培養(yǎng)基。融合以及未融合的骨髓瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基的篩選下會(huì)慢慢走向死亡，這樣就只剩下我們想要的能產(chǎn)生人肌紅蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞。該細(xì)胞既具有B細(xì)胞的能分泌單克隆抗體的特點(diǎn)，也具有骨髓瘤細(xì)胞的能在體外長(zhǎng)期繁殖的特點(diǎn)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）該細(xì)胞既具有B細(xì)胞的能分泌單克隆抗體的特點(diǎn)，也具有骨髓瘤細(xì)胞的能在體外長(zhǎng)期繁殖的特點(diǎn)。接下來(lái)，我們來(lái)和大家一起具體的學(xué)習(xí)一下單克隆抗體制備的各個(gè)環(huán)節(jié)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）首先看第一個(gè)環(huán)節(jié)：親本細(xì)胞的選擇與制備。這兒的親本細(xì)胞包括致敏B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。其中，對(duì)致敏B細(xì)胞的要求是要達(dá)到“三高”：能產(chǎn)生高特異性、高效價(jià)和高親和力的抗體。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的要求有“4點(diǎn)”：第一、細(xì)胞株穩(wěn)定，易于傳代培養(yǎng)；第二、本身不分泌免疫球蛋白或細(xì)胞因子；第三、是次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（即HGPRT）缺陷的細(xì)胞株，此種骨髓瘤細(xì)胞不能在HAT選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；第四、與B細(xì)胞融合率高。另外，大家要知道，在雜交瘤技術(shù)中，我們所用的骨髓瘤細(xì)胞為B細(xì)胞系來(lái)源的惡性腫瘤。目前最常用的骨髓瘤細(xì)胞株是：BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞系NS-1、SP2/0和Ag8。為防止骨髓瘤細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)恢復(fù)HGPRT活性的返祖現(xiàn)象，融合前，應(yīng)將骨髓瘤細(xì)胞用含8-氮鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)基處理，以確保其對(duì)HAT選擇性培養(yǎng)基敏感。下面我們?cè)倏磫慰寺】贵w制備的第二個(gè)環(huán)節(jié)：細(xì)胞融合。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)中的第一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。融合的方法包括化學(xué)方法、物理方法和生物學(xué)方法。其中在化學(xué)方法中最常用的試劑是聚乙二醇1000-2000，簡(jiǎn)稱(chēng)為PEG1000-2000，濃度為30%-50%，它可能的原理是導(dǎo)致細(xì)胞膜上脂類(lèi)物質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜打開(kāi)，從而有助于細(xì)胞融合。下面我們來(lái)看一下細(xì)胞融合的基本步驟：（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）取適量的致敏B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按一定比例（常用比例為3：1）混合，1000rpm離心10min，棄上清，然后加入1ml50%PEG，1min內(nèi)加完，30秒后再加入40ml1640培養(yǎng)基，4min內(nèi)加完，1000rpm離心10min，棄上清，最后加入HAT培養(yǎng)基，輕輕顛倒混勻，將細(xì)胞懸液加入96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。接下來(lái)，我們來(lái)看單克隆抗體制備的第三個(gè)環(huán)節(jié)：雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)。這是制備單克隆抗體的第二個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。前面我們提到，去除融合以及未融合的骨髓瘤細(xì)胞時(shí)，會(huì)用到一種特殊的培養(yǎng)基：HAT培養(yǎng)基。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）那么，HAT培養(yǎng)基究竟是什么培養(yǎng)基？這兒的H指次黃嘌呤，A指甲氨蝶呤，T指胸腺嘧啶。它是如何發(fā)揮篩選作用的？下面我們來(lái)看一下：在生物化學(xué)這門(mén)課中，我們已經(jīng)學(xué)過(guò)DNA的合成。對(duì)于真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)，合成DNA的途徑主要有兩種：主要途徑和旁路途徑。正常情況下，DNA的合成是通過(guò)主要途徑來(lái)完成的，即：細(xì)胞以糖、氨基酸及其小分子化合物作為底物，在二氫葉酸還原酶的作用下合成DNA。在這一過(guò)程中，葉酸作為輔酶，發(fā)揮了重要作用。而甲氨蝶呤是葉酸的拮抗劑，因而可阻斷DNA合成的主要途徑。在這個(gè)時(shí)候，DNA合成的主要途徑被阻斷了，只剩下旁路途徑可供利用。在旁路途徑中，細(xì)胞可以次黃嘌呤為原料，在次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的催化下合成鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤；另以胸腺嘧啶為原料，在胸腺嘧啶激酶的催化下合成胞嘧啶，從而完成DNA的合成。次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶大家已經(jīng)比較熟悉了，我們前面已經(jīng)提到過(guò)，它的英文簡(jiǎn)稱(chēng)是HGPRT，胸腺嘧啶激酶的簡(jiǎn)稱(chēng)是TK。由于HAT培養(yǎng)基中含有葉酸拮抗劑—甲氨蝶呤，故細(xì)胞DNA合成的主要途徑被阻斷，只能依靠旁路途徑來(lái)合成DNA。然而，用于融合的骨髓瘤細(xì)胞是經(jīng)含8-氮鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)基篩選得到的HGPRT缺陷的細(xì)胞株，故不能利用次黃嘌呤，也就不能合成鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤。盡管有TK存在可以合成所需的嘧啶，但是細(xì)胞終因缺乏嘌呤而不能合成完整的DNA導(dǎo)致融合以及未融合的骨髓瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中不能增殖而死亡。而雜交瘤細(xì)胞由于從致敏B細(xì)胞中獲得HGPRT，可以通過(guò)旁路途徑合成DNA，同時(shí)又保留了骨髓瘤細(xì)胞在體外無(wú)限生長(zhǎng)繁殖的特性。因此，經(jīng)過(guò)篩選，到最后只有雜交瘤細(xì)胞能夠在HAT培養(yǎng)基中得以生存而被篩選出來(lái)。下面我們?cè)賹?duì)前面所講的內(nèi)容幫大家梳理一下：HAT培養(yǎng)基的篩選原理是基于DNA合成的兩條途徑。在A存在的情況下，DNA合成的主要途徑就被阻斷了，只剩旁路途徑。對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞，因HGPRT缺乏，旁路途徑也不能合成完整的DNA，故細(xì)胞經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選后死亡，這樣只剩下我們想要的雜交瘤細(xì)胞。這兒需要大家搞清楚3種細(xì)胞的酶特征：只有骨髓瘤細(xì)胞的HGPRT是缺乏的，而B(niǎo)細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞兩種酶都有。接下來(lái)，我們來(lái)看一下HAT培養(yǎng)基的篩選流程：（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和流程圖）在融合后的細(xì)胞懸液中加入HAT培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)10天，期間半量換液2次，10天培養(yǎng)結(jié)束后加入HT培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)7天，期間換液一次，最后加入完全的1640培養(yǎng)基。以上就是雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)的技術(shù)要點(diǎn)。下面，我們來(lái)學(xué)習(xí)單克隆抗體制備的第4個(gè)環(huán)節(jié)：陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化。雜交瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和形成集落后，其中僅少數(shù)是分泌特異性抗體的細(xì)胞，對(duì)此，我們可以通過(guò)ELISA方法篩選培養(yǎng)孔上清液中是否含有目標(biāo)抗體，從而確定哪些孔中含有我們想要的雜交瘤細(xì)胞。另外，在有的培養(yǎng)孔中，可能有多個(gè)細(xì)胞集落，分泌的抗體也可能不同，所以很有必要有針對(duì)性的進(jìn)行單個(gè)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)。單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)又稱(chēng)克隆化，其目的是為獲得單一細(xì)胞系的群體。陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化需反復(fù)多次（至少3-5次）才可以從細(xì)胞群體中淘汰遺傳性不穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，最終獲得穩(wěn)定分泌我們想要的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞克隆化培養(yǎng)之初，可加入飼養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，從而輔助雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，一段時(shí)間后飼養(yǎng)細(xì)胞會(huì)自然死亡。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）克隆化培養(yǎng)方法包括有限稀釋法、顯微操作法、流式細(xì)胞分選法和軟瓊脂平板法等。目前，實(shí)驗(yàn)室最常用的方法是有限稀釋法，其原理是將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液做一定稀釋?zhuān)罱K使96孔板每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)平均含1個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)3-4天后，選擇僅有1個(gè)細(xì)胞群落生長(zhǎng)并且目標(biāo)抗體呈陽(yáng)性的孔，再反復(fù)多次克隆，即可獲得由單個(gè)細(xì)胞增殖形成的同源性雜交瘤細(xì)胞克隆。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需特殊設(shè)備，克隆出現(xiàn)率高，是實(shí)驗(yàn)室最常用的方法。顯微操作法是在倒置顯微鏡下用特制的彎頭毛細(xì)滴管吸出單個(gè)細(xì)胞，然后放入96孔板中培養(yǎng)。該法的優(yōu)點(diǎn)是直觀，鋪板均勻，缺點(diǎn)是容易污染。流式細(xì)胞分選法是應(yīng)用流式細(xì)胞儀篩選出能特異性表達(dá)目的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。本法是目前分離細(xì)胞最先進(jìn)的方法，篩選效率高，細(xì)胞純度高達(dá)90%，缺點(diǎn)是需要特殊的儀器才能完成。軟瓊脂平板法是將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)在軟瓊脂平板上，待單個(gè)細(xì)胞形成集落后，再分離培養(yǎng)。本法中需要用到瓊脂，瓊脂融化溫度比較難掌握，過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，過(guò)低使細(xì)胞分布不均勻，克隆出現(xiàn)率也不夠穩(wěn)定。接下來(lái)，我們來(lái)了解一下單克隆抗體制備的第5個(gè)環(huán)節(jié)：（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）雜交瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇。雜交瘤細(xì)胞的凍存方法跟其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凍存方法一樣，均需要凍存在液氮中，凍存液中需要加入二甲基亞砜，均需遵循“緩凍速溶”的原則。下面，我們來(lái)學(xué)習(xí)一下單克隆抗體制備的最后一個(gè)環(huán)節(jié)：（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）單克隆抗體的生產(chǎn)。獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株后，就可以大量制備單克隆抗體了。制備的方法主要有兩種：動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。首先來(lái)看動(dòng)物體內(nèi)誘生法。雜交瘤細(xì)胞保留了骨髓瘤細(xì)胞的腫瘤特性，故將它接種到同系小鼠體內(nèi)后，雜交瘤細(xì)胞就會(huì)大量增殖，同時(shí)分泌單克隆抗體。該實(shí)驗(yàn)一般這樣來(lái)做：（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）通常先給BALB/c小鼠腹腔注射降植烷或醫(yī)用石蠟，造成無(wú)菌性腹膜炎，7-10天后將0.5ml含100萬(wàn)個(gè)雜交瘤細(xì)胞的懸液注射入小鼠腹腔，等到誘生出小鼠腹腔腫瘤并產(chǎn)生含單克隆抗體的腹水時(shí)，即可分次采集腹水。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）第二種制備單克隆抗體的方法是體外培養(yǎng)法。應(yīng)用培養(yǎng)基大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，在培養(yǎng)上清中即含有較多量的單克隆抗體。該方法與動(dòng)物體內(nèi)誘生法相比，生產(chǎn)成本高。為什么這么說(shuō)呢？一只普通小鼠的價(jià)格是25元左右，但是每瓶約500ml培養(yǎng)基的價(jià)格約在100元左右。那么，與動(dòng)物體內(nèi)誘生法相比，該方法產(chǎn)生的單克隆抗體效價(jià)高還是低呢？答案是低，這意味著體外培養(yǎng)法的抗體產(chǎn)量也不高。所以，在制備單克隆抗體時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)誘生法要優(yōu)于體外培養(yǎng)法。這樣，單克隆抗體制備的6個(gè)環(huán)節(jié)我們就講完了。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）下面，我們以人肌紅蛋白單克隆抗體為例，來(lái)幫大家再梳理一下單克隆抗體的制備流程，同時(shí)幫助同學(xué)們把這6個(gè)環(huán)節(jié)再?gòu)?fù)習(xí)一下：首先用人肌動(dòng)蛋白免疫小鼠，待血清抗體效價(jià)達(dá)到一定水平時(shí)，處死小鼠，分離脾臟，制備致敏B細(xì)胞；同時(shí)準(zhǔn)備好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞，將二者在PEG存在的情況下進(jìn)行融合，然后加入HAT培養(yǎng)基，對(duì)于融合以及未融合的B細(xì)胞，其不能在體外長(zhǎng)期存活，對(duì)于融合以及未融合的骨髓瘤細(xì)胞，再加上甲氨蝶呤阻斷了它DNA合成的主要途徑，又因其HGPRT缺陷，故DNA合成的旁路途徑也被阻斷。兩條合成DNA的途徑都被阻斷了，所以骨髓瘤細(xì)胞也慢慢走向死亡。這時(shí)候培養(yǎng)基中就只剩下我們想要的雜交瘤細(xì)胞。為了篩選到能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，需進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，最常用的克隆化培養(yǎng)方法是有限稀釋法。本法不需特殊設(shè)備，克隆出現(xiàn)率高。