微生物基因組學(xué)

微生物基因組學(xué)第1頁(yè)/共61頁(yè)一、概述1、微生物基因組學(xué)：是在微生物全基因測(cè)序的基礎(chǔ)上，對(duì)單個(gè)基因或多個(gè)基因的作用、功能以及它們之間的相互關(guān)系的一門學(xué)科。2、微生物基因組學(xué)是人類基因組學(xué)的一部分：1994年美國(guó)首先發(fā)起微生物基因組研究計(jì)劃，稱為MGP計(jì)劃（microbialgenomicproject,MGP），它是人類基因組計(jì)劃的一個(gè)重要組成部分。第2頁(yè)/共61頁(yè)3、微生物基因組學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容⑴從研究工作的內(nèi)容而言①結(jié)構(gòu)基因組學(xué)②功能基因組學(xué)③比較基因組學(xué)⑵從工作順序而言①微生物基因序列的測(cè)定②微生物基因組的注釋③微生物基因組的功能研究第3頁(yè)/共61頁(yè)二、微生物基因組的序列測(cè)定㈠測(cè)序目的研究基因組的前提和基礎(chǔ)。㈡測(cè)序策略1.應(yīng)根據(jù)待測(cè)序列的長(zhǎng)度、要求測(cè)序的精確度和現(xiàn)有的條件來(lái)制定測(cè)序策略。2.測(cè)序類型分為兩類:①確認(rèn)性測(cè)序②從頭測(cè)序第4頁(yè)/共61頁(yè)大規(guī)?；蚪M測(cè)序的幾個(gè)支撐技術(shù)

Sanger雙脫氧末端終止法

PCR技術(shù)1、克隆2、水生棲熱菌(Thermusaquaticus)3、羅氏制藥

DNA自動(dòng)測(cè)序儀的發(fā)展

AppliedBiosystems美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司

生物信息學(xué)分析軟硬件設(shè)施第5頁(yè)/共61頁(yè)DNA測(cè)序有幾種方法，但到目前為止最常用的是20世紀(jì)70年代中期發(fā)明的鏈終止（Sanger法）SangeristheonlychemisttohavereceivedtwoNobelPrizesinChemistry,thefirstasthesolerecipientin1958forhisworkoninsulin,andthesecondin1980,sharedwithPaulBergandWalterGilbert,forthesequencingofnucleicacids.

第6頁(yè)/共61頁(yè)“雙脫氧末端終止”的含義第7頁(yè)/共61頁(yè)Sanger雙脫氧末端終止法測(cè)序原理第8頁(yè)/共61頁(yè)自動(dòng)化測(cè)序

熒光染料標(biāo)記物的發(fā)明：使鏈終止法用于自動(dòng)化測(cè)序，用不同的熒光色彩標(biāo)記ddNTP，如ddATP標(biāo)記紅色熒光，ddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光，ddGTP標(biāo)記黃色熒光，ddTTP標(biāo)記綠色熒光。由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色，而簡(jiǎn)化為由1個(gè)泳道同時(shí)判讀4種堿基。第9頁(yè)/共61頁(yè)第10頁(yè)/共61頁(yè)第11頁(yè)/共61頁(yè)第一代測(cè)序技術(shù)：Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法。第二代測(cè)序技術(shù)——循環(huán)陣列合成測(cè)序法第三代測(cè)序技術(shù)（單分子測(cè)序，直接測(cè)序）近期出現(xiàn)的Helicos公司的Heliscope單分子測(cè)序儀、PacificBiosciences公司的SMRT技術(shù)和OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子技術(shù)，被認(rèn)為是第三代測(cè)序技術(shù)。測(cè)序技術(shù)展望非光學(xué)顯微鏡成像：將核苷酸的空間線性排列方式可視化。第12頁(yè)/共61頁(yè)美國(guó)X獎(jiǎng)基金會(huì)2006年10月4日宣布設(shè)立一項(xiàng)金額高達(dá)1000萬(wàn)美元的獎(jiǎng)金，激勵(lì)科學(xué)家“多快好省”地繪制出人類基因圖譜。規(guī)則：在30天內(nèi)以高精確度測(cè)序100個(gè)百歲老人基因組樣本，并覆蓋98%的基因組，每個(gè)基因組的測(cè)序費(fèi)用控制在1000美元或以下。第13頁(yè)/共61頁(yè)㈢微生物基因組測(cè)序的策略1.隨機(jī)測(cè)序法即不考慮方向性，隨機(jī)對(duì)靶DNA進(jìn)行測(cè)序，最后采用計(jì)算機(jī)拼裝而得到完整的序列信息。該方法又包括兩種方法。⑴鳥槍法它包含有三種消化法①限制性內(nèi)切酶消化法②超聲波處理法③胰DNA酶消化法第14頁(yè)/共61頁(yè)⑵人工轉(zhuǎn)座子法轉(zhuǎn)座子是具有跳躍功能的DNA元件，是細(xì)菌或酵母染色體上的特定基因區(qū)，利用轉(zhuǎn)座酶可使轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入靶DNA。優(yōu)點(diǎn)：①一次體外反應(yīng)即可形成大量轉(zhuǎn)座子的插入。②可以在其上加入更有利于DNA測(cè)序（或制圖）的基因元件。③人工合成的轉(zhuǎn)座子兩頭帶有特殊的引物位點(diǎn)，所以插入位點(diǎn)的兩側(cè)序列可有效迅速地得以確定。第15頁(yè)/共61頁(yè)一段DNA順序可以從原位上單獨(dú)復(fù)制或斷裂下來(lái)，環(huán)化后插入另一位點(diǎn)，并對(duì)其后的基因起調(diào)控作用，此過(guò)程稱轉(zhuǎn)座。轉(zhuǎn)座子(transposons)在原核生物與真核生物基因組中存在著可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的一些DNA序列。（文獻(xiàn)上有時(shí)形象地稱其為是跳躍基因，jumpinggene）。

第16頁(yè)/共61頁(yè)1951.BarbaraMcClintock提出轉(zhuǎn)作和跳躍基因的概念DNA1967年Shapiro才在E.coli中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座因子第17頁(yè)/共61頁(yè)第18頁(yè)/共61頁(yè)2.定向測(cè)序法是指特定地從目的片段的某一端開(kāi)始測(cè)序，直至把靶片段測(cè)完。定向測(cè)序法包括引物測(cè)序法和定向缺失測(cè)序法。⑴引物測(cè)序法即在第一次測(cè)序結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)新的寡核苷酸，來(lái)充當(dāng)下一次測(cè)序反應(yīng)的引物，并依次類推，從而循序漸進(jìn)獲得靶DNA的全部序列。第19頁(yè)/共61頁(yè)⑵定向缺失法定向缺失法是將一個(gè)靶DNA變成若干套嵌套的缺失突變體，使靶序列中遠(yuǎn)不可測(cè)的區(qū)段逐漸落入可用通用引物進(jìn)行測(cè)序的方法。第20頁(yè)/共61頁(yè)第21頁(yè)/共61頁(yè)作圖法測(cè)序與序列組裝第22頁(yè)/共61頁(yè)

兩種大規(guī)模基因組測(cè)序策略的比較

項(xiàng)目

策略全基因組霰彈法逐步克隆法

遺傳背景不需要需要（需構(gòu)建精確的物理圖譜）速度快慢費(fèi)用低高計(jì)算機(jī)性能高（以全基因組為單位進(jìn)行拼接）低（以BAC為單位進(jìn)行拼接）適用范圍工作框架圖精細(xì)圖代表測(cè)序物種果蠅、水稻人、線蟲第23頁(yè)/共61頁(yè)24目前常用的人造染色體載體細(xì)菌人工染色體載體（BAC）酵母人工染色體載體（YAC）黏粒載體（cosmid）P1人工染色體載體（PAC）第24頁(yè)/共61頁(yè)pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1YAC載體的復(fù)制元件和標(biāo)志基因YAC載體應(yīng)含有下列元件：酵母染色體的端粒序列酵母染色體的復(fù)制子酵母染色體的著絲粒序列酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子標(biāo)記YAC載體的裝載量為250-400kb第25頁(yè)/共61頁(yè)酵母人工染色體（Yeastartificialchromosomes簡(jiǎn)稱YAC），是一種能夠克隆長(zhǎng)達(dá)400Kb的DNA片段的載體，含有酵母細(xì)胞中必需的端粒、著絲點(diǎn)和復(fù)制起始序列。第26頁(yè)/共61頁(yè)細(xì)菌人工染色體（Bacterialartificialchromosome，BAC）是指一種以F質(zhì)粒（F-plasmid）為基礎(chǔ)建構(gòu)而成的細(xì)菌染色體克隆載體，常用來(lái)克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb個(gè)堿基對(duì)。第27頁(yè)/共61頁(yè)（四）影響測(cè)序的因素不管采用隨機(jī)測(cè)序還是定向測(cè)序都可碰到下列影響因素。1.計(jì)算機(jī)的設(shè)備。2.靶DNA的性質(zhì)。3.完成測(cè)序所需的時(shí)間。4.采用測(cè)序策略。第28頁(yè)/共61頁(yè)三．微生物基因組的注釋（一）概念：在微生物基因測(cè)序的基礎(chǔ)上，對(duì)其基本結(jié)構(gòu)和部件進(jìn)行認(rèn)定，以進(jìn)一步研究其功能。第29頁(yè)/共61頁(yè)（二）微生物基因組注釋的內(nèi)容1.堿基組成分析，即G+CMol%測(cè)定。G+C含量是物種的一個(gè)重要特征，在微生物的分類上具有重要意義，是重要參數(shù)之一。2．開(kāi)放閱讀框的鑒定：3．編碼序列分析第30頁(yè)/共61頁(yè)4.tRNA基因檢索：根據(jù)特異的三葉草結(jié)構(gòu)來(lái)鑒定，可采用專門的分析軟件。5.rRNA基因檢索：利用現(xiàn)有已知16srRNA序列來(lái)鑒定基因組含的rRNA基因。6.特殊序列檢索7.復(fù)制原點(diǎn)鑒定（1）鑒定目的復(fù)制原點(diǎn)即微生物基因組1號(hào)堿基的位置。（2）鑒定原理復(fù)制原點(diǎn)有其特殊的結(jié)構(gòu)。如E.coli的復(fù)制原點(diǎn)為為一段245個(gè)bp的序列，其中包含有四個(gè)核苷酸的9聚體“TTATCCACT”。（3）鑒定方法可采用特殊的分析軟件。第31頁(yè)/共61頁(yè)第32頁(yè)/共61頁(yè)8.同源性基因檢索（1）目的對(duì)每一未知基因均進(jìn)行同源性搜索以確定其基因的初步特性。（2）搜索原理根據(jù)其結(jié)構(gòu)、排列的同源性。（3）搜索方法采用美國(guó)的BLAST軟件。第33頁(yè)/共61頁(yè)四．微生物的基因組圖譜微生物的基因組圖譜主要包括兩種，即遺傳圖譜和物理圖譜。(一)遺傳圖譜1.概念是通過(guò)突變表型鑒定出來(lái)的其基因組上的一系列基因圖，包括各個(gè)基因在基因組中的排列順序和精確定位。第34頁(yè)/共61頁(yè)2.建立基因遺傳圖譜的方法(1)中斷雜交法即將兩個(gè)菌株共同培養(yǎng),并每隔一段時(shí)間中斷培養(yǎng),以鑒定其基因型,并以鑒定某些基因的轉(zhuǎn)化順序和位置。(2)噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)PI噬菌體是普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。它可在供體菌的DNA斷裂時(shí)，誤將DNA片段包裝于自身而帶入受體菌的基因組中，并形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。也可將緊密聯(lián)鎖的幾個(gè)基因也轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)去（此為共轉(zhuǎn)導(dǎo)）。第35頁(yè)/共61頁(yè)（二）物理圖譜1．物理圖譜的概念：是在DNA分子上指出限制性內(nèi)切酶的限制性位點(diǎn)、數(shù)目及其限制性片段大小與排列順序的圖譜，又叫限制性圖譜。2．構(gòu)建微生物基因物理圖譜的意義（1）用于基因克?。唬?）用于序列分析；（3）用于southern雜交和RFLP多態(tài)性分析。3．構(gòu)建物理圖譜的方法（1）限制性內(nèi)切酶部分消化法（2）雙酶消化法（3）內(nèi)外切酶混合消化（4）分子雜交（5）Southern十字雜交法第36頁(yè)/共61頁(yè)五、微生物基因組功能分析1、根據(jù)目的基因組的性狀而推測(cè)可能的基因組功能。如致病島的G+Cmol%與細(xì)菌本身的G+Cmol%有很大差異。致病島或耐藥島等。2、根據(jù)已知的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性搜索。美國(guó)NIH的GenBank；歐洲的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（FMBL）日本的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)3、利用不同條件、不同作用因素的影響而鑒定未知基因的功能。如用過(guò)氧化氫酶處理沙門氏菌而獲得該菌的對(duì)H2O2氧化應(yīng)激反應(yīng)的基因。4、采用基因敲除的方法來(lái)推測(cè)或確定基因的功能。第37頁(yè)/共61頁(yè)六、研究基因組功能的意義1．加速致病基因的研究2．尋找靈敏而特異性的病原分子標(biāo)記病原微生物的特異性DNA序列可以作為分子標(biāo)記用于疾病的診斷。3．促進(jìn)新藥的發(fā)現(xiàn)和疫苗的發(fā)展（1）促進(jìn)新藥的發(fā)現(xiàn)（2）疫苗的研究4．促進(jìn)微生物分類的發(fā)展第38頁(yè)/共61頁(yè)5.提高對(duì)人類相關(guān)基因功能的認(rèn)識(shí)（1）一些人類的遺傳性疾病，如結(jié)腸癌、肝豆?fàn)詈俗冃?、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良等，在細(xì)菌的基因組分析中，也存在類似的蛋白物。（2）可以利用微生物做模擬，去檢測(cè)高等生物的基因性狀和功能。（3）從基因水平去揭發(fā)人類疾病與病原微生物之間關(guān)系，如發(fā)病機(jī)理，人類與病原微生物之間相互作用的基因機(jī)理等。第39頁(yè)/共61頁(yè)七、微生物基因組功能學(xué)研究現(xiàn)狀（一）微生物基因組序列測(cè)定1.病毒的基因組序列測(cè)定2.原核細(xì)胞微生物的序列測(cè)定1994年美國(guó)發(fā)起微生物基因組計(jì)劃，實(shí)質(zhì)上就是以細(xì)菌基因組計(jì)劃為開(kāi)始的生物工程（不包括病毒）。3.真核細(xì)胞微生物的序列測(cè)定1996年第一個(gè)完成釀酒酵母的測(cè)序，至目前為止，已有數(shù)種真菌測(cè)序完畢，尚有246中正在測(cè)序之中。第40頁(yè)/共61頁(yè)（二）微生物基因組測(cè)序堿基數(shù)1.病毒基因堿基數(shù)：最小的病毒，如乙肝病毒，只有3kb堿基數(shù)，而最大的痘病毒則有300kb堿基數(shù)。2.細(xì)菌基因組的堿基數(shù)：細(xì)菌基因組的堿基數(shù)同樣差異很大，小至支原體為50萬(wàn)bp，大至黃色粘球菌為900萬(wàn)bp。3.真菌的堿基數(shù)：目前測(cè)定的微孢子蟲為300萬(wàn)bp。4．人類的堿基數(shù)為31.647億bp。第41頁(yè)/共61頁(yè)（三）微生物的基因組數(shù)1.病毒的基因組數(shù)由數(shù)個(gè)至數(shù)百個(gè)。2.細(xì)菌的基因組數(shù)由數(shù)百個(gè)至數(shù)千個(gè)。如百脈根中間根瘤菌為8000個(gè)基因組。3.真菌的基因組數(shù)基本上同細(xì)菌。如釀酒酵母為6000個(gè)。附：人類基因組數(shù)為2-2.5萬(wàn)個(gè)，線蟲2萬(wàn)個(gè)，果蠅1-1.5萬(wàn)個(gè)。第42頁(yè)/共61頁(yè)人類基因組計(jì)劃

HGP(HumanGenomeProjects)凱克加州大學(xué)第43頁(yè)/共61頁(yè)2000年6月26人類基因組工作草圖繪制成功。2000年3月果蠅。12月擬南芥基因組的完整圖譜。2001年:HGP和美國(guó)塞萊拉公司將各自測(cè)定的人類基因組工作框架圖分別發(fā)表在Nature和Science上。2002年，

12月

《Nature》小鼠的基因組。在人類基因組計(jì)劃中，包括對(duì)五種生物基因組的研究：大腸桿菌、酵母、線蟲、果蠅和小鼠，稱之為人類的五種“模式生物”。第44頁(yè)/共61頁(yè)第45頁(yè)/共61頁(yè)2000,4以楊煥明在Science水稻全基因組框架序列圖。基因總數(shù)：約為人類的2倍；其中10000個(gè)基因的功能已確定；水稻的“垃圾”序列多位于基因外，人類的“垃圾”序列多位于基因內(nèi)；水稻的基因平均4500bp,人類基因平均72000bp。擬南芥約有25000個(gè)基因，80%在水稻中都存在，二者之間有關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)的基因差別最大。第46頁(yè)/共61頁(yè)第47頁(yè)/共61頁(yè)第48頁(yè)/共61頁(yè)

中國(guó)家蠶基因組計(jì)劃項(xiàng)目主持人、中國(guó)工程院院士向仲懷

中國(guó)家蠶基因組計(jì)劃主要攻關(guān)專家，西南農(nóng)業(yè)大學(xué)教授夏慶友正在做測(cè)試。第49頁(yè)/共61頁(yè)2003年人類表觀基因組計(jì)劃(HumanEpigenomeProject)于10月7日正式啟動(dòng)。這是世界上首項(xiàng)針對(duì)控制人類基因“開(kāi)”和“關(guān)”的主要化學(xué)變化進(jìn)行的圖譜繪制工作，它將幫助科學(xué)家建立人類遺傳與疾病之間的關(guān)鍵聯(lián)系。2004年10月國(guó)際人類基因組計(jì)劃合作組織在《Nature發(fā)了雜志上宣布誤差小于10萬(wàn)分之一的人類基因組完成圖已成功繪就。已將原來(lái)15萬(wàn)個(gè)“缺隙”減少到341個(gè)。完成圖顯示人類基因組只含有2～2.5萬(wàn)個(gè)基因。2005年8月

在（Nature）雜志發(fā)表了水稻基因組“精細(xì)圖”，覆蓋率達(dá)95.3％，中國(guó)對(duì)國(guó)際水稻基因組計(jì)劃的貢獻(xiàn)率達(dá)20％，共定位了37,500個(gè)基因，還率先完成了對(duì)著絲粒的測(cè)序。2005年9月1日出版的《Nature》和9月2日出版的《Science》雜志，黑猩猩和人類基因組的ＤＮＡ序列相似性達(dá)到99％；即使考慮到ＤＮＡ序列插入或刪除，兩者的相似性也有96％。封面文章。2014年10月28日

迄今最古老人類基因組測(cè)序完成，來(lái)源：《中國(guó)科學(xué)報(bào)》

線粒體第50頁(yè)/共61頁(yè)（四）微生物基因組的結(jié)構(gòu)和功能的一些特點(diǎn)1.病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)（1）病毒小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，與細(xì)菌和真核細(xì)胞生物相比，其基因組很小，各種病毒間也差異很大，約相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。（2）病毒的基因組（3）多數(shù)RNA病毒的基因組是連續(xù)的，也有一部分RNA病毒的基因組是不連續(xù)的第51頁(yè)/共61頁(yè)（4）基因組重疊現(xiàn)象病毒基因組重疊現(xiàn)象是Sanger1977年研究E.coli的噬菌體фх174時(shí)發(fā)現(xiàn)的。該噬菌體是單鏈DNA分子，有5375個(gè)核苷酸，可編碼11種蛋白質(zhì)，總分子量為25萬(wàn)左右，相當(dāng)于6078個(gè)核苷酸的編碼產(chǎn)物。病毒基因組重疊現(xiàn)象可以有兩種情況：完全重疊部分重疊（5）病毒的大部分基因編碼蛋白質(zhì)，只有一少部分基因不編碼蛋白質(zhì)，這種不編碼蛋白質(zhì)的基因一般少于5﹪。如фх174噬菌體的不編碼的核苷酸為217，占總基因數(shù)的4.04﹪，（217/5375），這些不編碼的基因多數(shù)為基因表達(dá)的調(diào)控基因。人類的不編碼蛋白的基因?yàn)?8﹪，只有2﹪是編碼蛋白的基因。第52頁(yè)/共61頁(yè)

蓮人在綠楊津采一玉漱聲歌新闕

采蓮人在綠楊津，在綠楊津一闕新；一闕新歌聲漱玉，歌聲漱玉采蓮人。第53頁(yè)/共61頁(yè)第54頁(yè)/共61頁(yè)（6）在病毒的基因中，功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)基因或rRNA基因往往聚集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定的部位，形成一個(gè)功能單元或轉(zhuǎn)錄單元。它們可以一起轉(zhuǎn)錄成含有多個(gè)mRNA的多順?lè)醋?，再剪接成單順?lè)醋樱俜g成蛋白質(zhì)，如腺病毒等。（7）除反轉(zhuǎn)錄病毒外，其他病毒均為單倍體，每個(gè)基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組則有2個(gè)拷貝。（8）噬菌體的基因是連續(xù)的，而真核細(xì)胞的病毒的基因組鮮有內(nèi)含子。除正鏈RNA病毒外，真核細(xì)胞病毒都是轉(zhuǎn)錄成mRNA前體，再剪切加工，去掉內(nèi)含子，形成成熟的mRNA。（9）病毒適應(yīng)性基因的丟失第55頁(yè)/共61頁(yè)2.細(xì)菌基因組結(jié)構(gòu)和功能的一些特點(diǎn)（1）細(xì)菌的染色體數(shù)目以前認(rèn)為細(xì)菌的染色體數(shù)只有一條，經(jīng)基因組研究后，確定了細(xì)菌的染色體數(shù)是1條以上?！?〉細(xì)菌基因組的結(jié)構(gòu)是連續(xù)的，無(wú)內(nèi)含子，因而轉(zhuǎn)錄后不需要剪