治療自身免疫性疾病新靶標(biāo)與相關(guān)新藥研發(fā)

治療自身免疫性疾病的新靶標(biāo)：Kv1.3通道靶向Kv1.3通道的先導(dǎo)藥物研發(fā)

靶向Kv1.3先導(dǎo)藥物在預(yù)防和治療自身免疫疾病中的應(yīng)用

第一頁，共76頁。自身免疫疾病自身免疫性疾?。╝utoimmunediseases）是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。

系統(tǒng)性自身免疫?。ǚ瞧鞴偬禺愋裕┢鞴偬禺愋宰陨砻庖卟∠到y(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis）口眼干燥綜合征(Sjogren'ssyndrome)結(jié)節(jié)性多發(fā)性動(dòng)脈炎(polyarteritisnodosa)慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis)重癥肌無力(myastheniagravis)胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependentdiabetesmellitus)第二頁，共76頁。臨床上主要的自身免疫病及其相關(guān)證據(jù)第三頁，共76頁。人類自身免疫病的致病性自身抗原第四頁，共76頁。全球有5-8%的人口受到約40種自身免疫疾病的威脅！自身免疫疾病已被我國列為“十大”嚴(yán)重影響人民健康的疾病之一。系統(tǒng)性紅斑狼瘡

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多發(fā)性硬化癥第五頁，共76頁。自身免疫病的共同特征1、多數(shù)自身免疫性疾病病因不明；2、患者女性多見，發(fā)病率隨年齡增高，有遺傳傾向；3、存在自身抗體和（或）自身反應(yīng)性T細(xì)胞；4、疾病的重疊現(xiàn)象；5、病程遷延，發(fā)作與緩解交替；6、免疫抑制劑治療有一定療效第六頁，共76頁。自身抗原的出現(xiàn)

隱蔽抗原的釋放、自身抗原發(fā)生改變

免疫調(diào)節(jié)異常淋巴細(xì)胞的多克隆激活、Th1和Th2細(xì)胞功能失調(diào)交叉抗原鏈球菌感染、EB病毒感染、柯薩奇病毒感染表位擴(kuò)展遺傳因素發(fā)病機(jī)制免疫耐受性的終止和破壞是自身免疫病發(fā)生的根本機(jī)制。確切原因尚未完全闡明，可能與下列因素有關(guān)：第七頁，共76頁。發(fā)病機(jī)制第八頁，共76頁。治療策略免疫抑制劑皮質(zhì)激素：強(qiáng)的松，可的松細(xì)胞毒性藥物：烷化劑，嘌呤拮抗劑等抗感染抗菌素：環(huán)孢子菌素、氯霉素細(xì)胞因子及受體抗體或阻斷劑生物學(xué)制劑：抗淋巴細(xì)胞球蛋白、細(xì)胞因子單抗、細(xì)胞因子受體拮抗劑

缺點(diǎn)：不能根治，且對(duì)肝臟和腎臟有毒性，長期使用有致感染和致癌作用，導(dǎo)致不育和畸形，副作用強(qiáng)理想的治療策略：選擇性的抑制自身免疫而不影響正常免疫功能，毒副作用弱第九頁，共76頁。T細(xì)胞引起自身免疫的信號(hào)通路T細(xì)胞和自身免疫疾病選擇性抑制T細(xì)胞的激活和增殖的免疫抑制劑可以有效的治療自身免疫疾病。第十頁，共76頁。

電壓門控鉀通道亞型Kv1.3中等電導(dǎo)鈣激活鉀通道(IKCa1)

T細(xì)胞中的鉀離子通道與鉀通道Kv1.3和IKCa1相關(guān)的T細(xì)胞激活過程第十一頁，共76頁。T細(xì)胞的分類

根據(jù)T細(xì)胞表面CD45分子，將T細(xì)胞分為二個(gè)新亞群。凡未經(jīng)抗原刺激的T細(xì)胞可稱之為原始T細(xì)胞（naiveTcell,Tn）為CD45RA+T細(xì)胞群，而經(jīng)抗原刺激分化為記憶T細(xì)胞（memoryTcell,Tm）為CD45RO+細(xì)胞群。特性TnTmCD45CD45RACD45RO歸巢受休表達(dá)高水平低水平粘附分子表達(dá)低水平高水平再循環(huán)血流→淋巴組織直接移行至抗原部位壽命短（數(shù)日）長（數(shù)月）再次抗原刺激-+++第十二頁，共76頁。T細(xì)胞的分類

記憶T細(xì)胞（memoryTcell,Tm）根據(jù)其表面受體CCR7分子的表達(dá)和功能不同，可分為TEM（CCR7-）和TCM

（CCR7+）細(xì)胞。第十三頁，共76頁。鉀通道Kv1.3和IKCa1在不同T細(xì)胞中的表達(dá)第十四頁，共76頁。第十五頁，共76頁。鉀離子通道2003年諾貝爾獎(jiǎng)鉀離子通道是一類細(xì)胞膜上選擇性允許K+跨膜通過的離子通道，是繼G-蛋白偶聯(lián)受體和蛋白激酶之后的第三大信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子家族。第十六頁，共76頁。第十七頁，共76頁。治療自身免疫疾病的新靶標(biāo)：鉀通道Kv1.3鉀通道Kv1.3結(jié)構(gòu)示意圖

TEM細(xì)胞的異常增殖在自身免疫疾病中起重要的作用，鉀通道Kv1.3成為了治療自身免疫疾病的一個(gè)新的藥物靶標(biāo)。

第十八頁，共76頁。治療自身免疫性疾病的新靶標(biāo)：Kv1.3通道靶向Kv1.3通道的先導(dǎo)藥物研發(fā)

靶向Kv1.3先導(dǎo)藥物在預(yù)防和治療自身免疫疾病中的應(yīng)用

第十九頁，共76頁。有機(jī)小分子調(diào)節(jié)劑的篩選與設(shè)計(jì)靶向鉀通道Kv1.3的藥物研發(fā)多肽調(diào)節(jié)劑的篩選與設(shè)計(jì)第二十頁，共76頁。有機(jī)小分子調(diào)節(jié)劑的篩選與設(shè)計(jì)

1998年，Merck公司就分離到correolide，它能在100nM水平上抑制T細(xì)胞的增殖。隨后Merck、Pfzer等研發(fā)機(jī)構(gòu)分離、合成、和功能鑒定了10多種有機(jī)小分子藥物候選物。第二十一頁，共76頁。

有機(jī)小分子先導(dǎo)藥物的不足：作用于Kv1.3鉀通道的選擇性和特異性不強(qiáng)有機(jī)小分子的藥理學(xué)活性有機(jī)小分子調(diào)節(jié)劑的篩選與設(shè)計(jì)第二十二頁，共76頁。多肽調(diào)節(jié)劑的篩選與設(shè)計(jì)

自然界中的有毒動(dòng)物

多肽藥物的篩選與設(shè)計(jì)

以蝎毒肽為基礎(chǔ)的多肽藥物篩選與設(shè)計(jì)以?？舅貫榛A(chǔ)的多肽藥物篩選與設(shè)計(jì)第二十三頁，共76頁。?？舅囟嚯乃幬锏难邪l(fā)選擇性較好的SL5多肽藥理學(xué)活性海葵毒素Shk?？诙捻摚?6頁。第二十五頁，共76頁。第二十六頁，共76頁。第二十七頁，共76頁。第二十八頁，共76頁。多肽調(diào)節(jié)劑的篩選與設(shè)計(jì)

自然界中的有毒動(dòng)物

多肽藥物的篩選與設(shè)計(jì)

以蝎毒肽為基礎(chǔ)的多肽藥物篩選與設(shè)計(jì)

以海葵毒素為基礎(chǔ)的多肽藥物篩選與設(shè)計(jì)

第二十九頁，共76頁。以蝎毒肽為基礎(chǔ)的藥物研發(fā)

作為天然的毒素資源庫，蝎毒肽比?？舅馗S富。蝎作用于鉀離子通道的蝎毒肽第三十頁，共76頁。第三十一頁，共76頁。如何獲得對(duì)鉀通道Kv1.3高選擇性和特異性的多肽調(diào)節(jié)劑？

從蝎毒肽中天然分離以蝎毒肽為模板進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造第三十二頁，共76頁。天然的蝎毒肽包含多種作用于Kv1.3通道的成員，但選擇性和特異性普遍不高。第三十三頁，共76頁。ImKTx88的篩選和序列分析從海南斑等蝎（Isometrusmaculates）毒腺組織cDNA文庫中篩選出鉀通道蝎毒肽ImKTx88基因。天然蝎毒肽調(diào)節(jié)劑的篩選第三十四頁，共76頁。第三十五頁，共76頁。多肽ImKTx88的表達(dá)純化和質(zhì)譜鑒定第三十六頁，共76頁。第三十七頁，共76頁。

2005年，法國科學(xué)家Jean-Marc等改造蝎鉀毒素多肽OSK1獲得了特異作用于Kv1.3通道的多肽AOSK1。以蝎毒肽為模板的多肽調(diào)節(jié)劑設(shè)計(jì)和改造第三十八頁，共76頁。第三十九頁，共76頁。AOSK1及其突變體對(duì)Kv1.3的特異性和選擇性比較第四十頁，共76頁。2008年，武漢大學(xué)依據(jù)已建立的多種蝎毒腺cDNA文庫，結(jié)合蝎毒肽的結(jié)構(gòu)與功能研究，設(shè)計(jì)篩選獲得了選擇性和特異性作用于Kv1.3通道的多肽ADWX-1。靶向鉀通道Kv1.3先導(dǎo)藥物多肽ADWX-1的篩選第四十一頁，共76頁。

α-KTx3亞家族蝎毒肽序列比對(duì)BmKTX結(jié)構(gòu)蝎毒肽和Kv1.x鉀通道作用模式先導(dǎo)藥物多肽ADWX-1的設(shè)計(jì)第四十二頁，共76頁。先導(dǎo)藥物多肽ADWX-1的設(shè)計(jì)ADWX-1和BmKTX的序列比對(duì)及其和Kv1.3通道作用第四十三頁，共76頁。ADWX-1和rBmKTX的圓二色譜比較

ADWX-1和BmKTX的NMR結(jié)構(gòu)比較ADWX-1多肽的表達(dá)純化第四十四頁，共76頁。PeptideChannelsandcellstestedKd-IC50xm(nM)SpecificityIndexxm/cnn=Kv1.3CharybdotoxinhKv1.3TlymphrKv1.1oocyterKv1.2B823.5>999101>1002.9KaliotoxinrKv1.3oocytemKv1.1oocytemKv1.2oocyte0.411.12512.761OSK1[P12,K16,D20]mKv1.3mKv1.1COShKv1.2COS0.0593.18>100154>1000AnuroctoxinhKv1.3TlymphhKv1.1L929hKv1.2COS0.73>1006.11>1008.34ShK(L5)hKv1.3TlymphmKv1.1rKv1.2B820.0767.048192>100ADWX-1mKv1.3HEKmKv1.1HEKhKv1.2HEK0.0020.65>1001>300>100000第四十五頁，共76頁。ADWX-1與Kv1.3通道作用的機(jī)制？設(shè)計(jì)ADWX-1的丙氨酸掃描突變體測定突變體的藥理學(xué)活性生物信息學(xué)模建復(fù)合物結(jié)構(gòu)第四十六頁，共76頁。ADWX-1的突變體設(shè)計(jì)ADWX-1突變體二級(jí)結(jié)構(gòu)分析第四十七頁，共76頁。突變體對(duì)Kv1.3通道的藥理學(xué)活性ADWX-1mutantIC50(pM)nIC50(mut)/IC50(wt)Wildtype1.89±0.53131.0R11A336.3±49.18177.9R23A7344.2±395043885.8F24A4013.4±85742123.4K26A967.4±7264511.8T28A58.2±6.5430.8N29A454.4±40.76240.4H33A77.2±37.4340.8T35A28.0±19.2414.8第四十八頁，共76頁。ADWX-1-Kv1.3復(fù)合物結(jié)構(gòu)ADWX-1突變體計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較ADWX-1與Kv1.3通道作用的分子機(jī)制

第四十九頁，共76頁。ADWX-1與Kv1.3通道作用的分子機(jī)制

在ADWX-1和Kv1.3通道的相互作用中，ADWX-1中的Arg23，Phe24和Lys26是最重要的功能氨基酸殘基。Arg23，Lys26和Kv1.3的相互作用Phe24和Kv1.3的相互作用Arg23，Phe24，Lys26和Kv1.3的相互作用第五十頁，共76頁。有機(jī)小分子和多肽調(diào)節(jié)劑的比較有機(jī)小分子correolide與Kv1.3通道的相互作用第五十一頁，共76頁。多肽KTX與Kv1.3通道的相互作用第五十二頁，共76頁。Kv1.x通道序列比對(duì)、通道模型及藥物分子作用區(qū)域示意圖

小分子和多肽作用Kv1.3通道的示意圖

與有機(jī)小分子藥物相比，多肽調(diào)節(jié)劑具有更好的選擇性和特異性。細(xì)胞內(nèi)小分子多肽鉀通道第五十三頁，共76頁。治療自身免疫性疾病的新靶標(biāo)：Kv1.3通道靶向Kv1.3通道的先導(dǎo)藥物研發(fā)

靶向Kv1.3先導(dǎo)藥物在預(yù)防和治療自身免疫疾病中的應(yīng)用第五十四頁，共76頁。靶向鉀通道Kv1.3的藥物研發(fā)疾病動(dòng)物模型治療藥物藥物類型藥物有效劑量類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠PIA模型SL5多肽100ug/kgI-型糖尿病MHCII限制型DP-BB/W大鼠模型PAP-1小分子50mg/kg過敏性皮炎大鼠ACD模型PAP-1/ShK小分子/多肽10mg/kg/16ug/kg多發(fā)性硬化癥實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎大鼠模型ShK，ShK-Dap32多肽16ug-80ug/kg第五十五頁，共76頁。先導(dǎo)藥物在預(yù)防和治療自身免疫疾病中的應(yīng)用

靶向Kv1.3通道治療多發(fā)性硬化癥靶向Kv1.3通道治療I-型糖尿病靶向Kv1.3通道治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎第五十六頁，共76頁。靶向Kv1.3通道治療多發(fā)性硬化癥

臨床病例證實(shí)多發(fā)性硬化癥（MS）病人中經(jīng)髓鞘質(zhì)抗原激活的T細(xì)胞為特異性表達(dá)高數(shù)量Kv1.3通道的表型。第五十七頁，共76頁。MS病人中激活的TEM細(xì)胞顯著增加，其中TEM細(xì)胞高表達(dá)Kv1.3通道。第五十八頁，共76頁。CD8+的效應(yīng)記憶T細(xì)胞激活后也高表達(dá)Kv1.3鉀通道第五十九頁，共76頁。Kv1.3通道的阻斷劑多肽ShK可選擇性抑制MBP特異性的TEM細(xì)胞增殖第六十頁，共76頁。Kv1.3通道阻斷劑多肽KTX抑制MBP誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖和激活第六十一頁，共76頁。MS病人的腦組織炎癥細(xì)胞中特異性高表達(dá)Kv1.3通道第六十二頁，共76頁。MS病人腦脊液細(xì)胞（CSF）在體外激活后，迅速轉(zhuǎn)變?yōu)門EM細(xì)胞；而正常人腦脊液細(xì)胞和外周血細(xì)胞（PB）激活后維持表型不變。

第六十三頁，共76頁。Kv1.3通道阻斷劑對(duì)MS的預(yù)防和治療Kv1.3通道阻斷劑多肽KTX、ShK和ShK-L5可有效預(yù)防和治療MS的動(dòng)物模型:Lewis大鼠的實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎（EAE）。ShK-L5s.cShK-L5s.c第六十四頁，共76頁。靶向Kv1.3通道治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

Kv1.3通道在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）病人的關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞中高表達(dá)，主要為CCR7-細(xì)胞。在關(guān)節(jié)炎（OA）病人的關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞中低表達(dá)。第六十五頁，共76頁。Kv1.3通道阻斷劑多肽SL5選擇性抑制RA病人關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞的增殖和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。第六十六頁，共76頁。Kv1.3通道阻斷劑多肽SL5可顯著降低RA動(dòng)物模型DA鼠PIA模型的臨床評(píng)分，有效改善病理學(xué)癥狀，但不能顯著降低類風(fēng)濕因子（RF）的含量。第六十七頁，共76頁。第六十八頁，共76頁。靶向Kv1.3通道治療I-型糖尿病

第六十九頁，共76頁。第七十頁，共76頁。Kv1.3通道阻斷劑多肽SL5和小分子4-AP抑制T1DM病人GAD65-specificTEM細(xì)胞的增殖和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。第七十一頁，共76頁。Kv1.3通道阻斷劑小分子PAP-1(Psora-4)的藥理學(xué)活性第七十二頁，共76頁。Kv1.3通道阻斷劑小分子PAP-1可顯著降低T1DM動(dòng)物模型大鼠EAD模型的發(fā)病率，減輕細(xì)胞損傷和T細(xì)胞引起的炎癥。第七十三頁，共76頁。第七十四頁，共76頁?？偨Y(jié)治療自身免疫性疾病的新靶標(biāo)：Kv1.3通道靶向Kv1.3通道的先導(dǎo)藥物研發(fā)

有機(jī)小分子

多肽靶向Kv1.3先導(dǎo)藥物在預(yù)防和治療自身免疫疾病中的應(yīng)用

第七十五頁，共76頁。參考文獻(xiàn)BeetonC,WulffH,BarbariaJ,Clot-FaybesseO,PenningtonM,BernardD,etal.SelectiveblockadeofTlymphocyteK+channelsamelioratesexperimentalautoimmuneencephalomyelitis,amodelformultiplesclerosis.ProcNatlAcadSciUSA2001;98:13942-7.BeetonC,PenningtonMW,WulffH,SinghS,NugentD,CrossleyG,etal.TargetingeffectormemoryTcellswithaselectivepeptideinhibitorofKv1.3channelsfortherapyofautoimmunediseases.MolPharmacol2005;67:1369-81.BeetonC,WulffH,StandiferNE,AzamP,MullenKM,PenningtonMW,etal.Kv1.3channelsareatherapeutictargetforTcell-mediatedautoimmunediseases.ProcNatlAcadSciUSA2006;103:17414-9.HanS,YiH,YinSJ,ChenZY,LiuH,CaoZJ,etal.StructuralbasisofapotentpeptideinhibitordesignedforKv1.3channel,atherapeutictargetofautoimmunedisease.JBiolChem2008.Han,S.,Hu,Y.,Zhang,R.,Yi,H.,Wei,J.,Wu,Y.,Cao,Z.,Li,W.andHe,X.,ImKTx88,anovelselectiveKv1.3channelblockerderivedfromthescorpionIsometrusmaculates.Toxicon57:348.Matko,J.,K+channe