基因工程研究策略和實(shí)踐課件

基因工程研究策略基因決定性狀青霉素能產(chǎn)生青霉菌家蠶能吐出蠶絲為人類利用定向改造基因的設(shè)想1.能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？2.能否讓微生物產(chǎn)生人胰島素、干擾素等昂貴藥物？經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物DNA的技術(shù)-基因工程基因工程過程示意圖①從細(xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③提取大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因/使其表達(dá)③③基因工程的研究策略一、目的基因的分離(donorDNA)二、載體DNA及其改造(VectorDNA)三、體外DNA重組(DNArecombination)四、重組DNA的轉(zhuǎn)化(Transformation)五、重組體的篩選鑒定與克隆擴(kuò)增

(identification&cloneamplification)六、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達(dá)(geneexpression)一、目的基因的分離從cDNA文庫中分離目的基因從基因組DNA文庫中分離目的基因PCR擴(kuò)增目的基因片段化學(xué)方法人工合成基因cDNA文庫僅包含正在表達(dá)的基因不同物種、不同組織的cDNA文庫不相同基因總量少，易篩選組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合2.從基因組DNA文庫獲取目的基因包含所有遺傳信息構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長片段基因）篩選難度大用于研究基因在基因組中的情況4.化學(xué)合成法獲取較短的目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列二、載體DNA載體

(Vector)載體是目的基因的運(yùn)載工具，其作用是將目的基因帶入受體細(xì)胞中，并使目的基因擴(kuò)增和表達(dá)。常用載體

質(zhì)粒病毒載體噬菌體

粘性質(zhì)粒/粘粒

載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)有復(fù)制起點(diǎn)，能自主復(fù)制；具有篩選標(biāo)記，便于重組體的篩選和鑒定；具有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)，并在位點(diǎn)中插入外源基因后，不影響其復(fù)制功能；分子量小，以容納較大的外源DNA。表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等基因表達(dá)元件。穿梭載體(shuttIevector)

又稱雙功能載體(bifunctionalvector)。能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來穿梭的載體。其可同時(shí)具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)和真核生物可識(shí)別的病毒復(fù)制原點(diǎn)或酵母菌的自主復(fù)制序列（ARS），它即能在原核細(xì)胞中擴(kuò)增又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)。主要用于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，通常是將載體和待克隆的真核生物DNA片段先在細(xì)菌中克隆，再轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中表達(dá)，并可提高外源基因的表達(dá)效率。如pKSV一10、pJDB219載體等。載體的分類-按來源分

質(zhì)粒(plasmidvector)病毒(virusvector)噬菌體(phagevector)粘性質(zhì)粒/粘粒(cosmidvector)

1.質(zhì)粒載體:

(1)分子量較小，在細(xì)菌中有較多的拷貝數(shù)。(2)松馳型。

(3)具有一個(gè)以上的標(biāo)志，便于篩選。(4)具有數(shù)個(gè)或一個(gè)單一的酶切點(diǎn)。

天然的質(zhì)粒不能具備以上所有條件，所以實(shí)際應(yīng)用的都是人工構(gòu)建的質(zhì)粒，其中最常用的是pBR322,pUC19.，2．病毒載體（1）整合型載體：外源基因通過這種病毒載體與宿主細(xì)胞的染色體整合，外源基因隨宿主細(xì)胞基因組的復(fù)制而擴(kuò)增。（2）游離型載體：能夠以病毒顆粒的形式在宿主內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進(jìn)行復(fù)制。如：腺病毒。3.λ噬菌體載體

現(xiàn)用的λ噬菌體載體都是在野生型基礎(chǔ)上改造而成的。改建之后的常用載體有兩類：①插入型載體，具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)，只能插入較小的外源DNA片段(＜10kb)。如λgt10、λgt11；②替換型載體，具有成對的克隆位點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA區(qū)段可被外源插入的DNA片段取代，能插入較大的外源DNA片段(20-24kb左右)。如charon4、charon10。4.

Cosmid質(zhì)粒

由λDNAcos區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成。在宿主細(xì)胞中可以作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)噬菌體的任何功能。

分子量小（約4—6kb），可容納大至40-50kb的外源DNA片段。適用于構(gòu)建真核細(xì)胞的基因文庫。

如cosmidpHC79限制性內(nèi)切酶―“分子剪刀”Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，能專一地識(shí)別DNA分子上特定的堿基序列并將DNA切斷的內(nèi)切酶。識(shí)別序列的特點(diǎn)；(I)專一；(2)常由4–6個(gè)堿基組成；(3)具有回文序列經(jīng)切割可以生成平頭末端或粘性末端?？梢援a(chǎn)生相同粘性末端的不同的限制酶稱作同尾酶。BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體2.平齊末端連接優(yōu)點(diǎn)：可連接任何一對DNA可恢復(fù)一個(gè)酶切位點(diǎn)或產(chǎn)生一個(gè)新酶切位點(diǎn)缺點(diǎn)：連接率低要求連接酶及底物濃度高GAAＴＴＣＣＴＴＡＡＧGAAＴＴＣ

3.同聚物核苷酸末端法

在DNA或RNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶在DNA片段3′末端制備粘末端。避免自身環(huán)化互補(bǔ)序列較長時(shí)（>4bp)，不需連接酶

4.T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個(gè)游離的TPCR過程中增加延伸時(shí)間，Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個(gè)A受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)四、重組DNA的轉(zhuǎn)化1.基本概念轉(zhuǎn)化（transformation）：把以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA，在一定條件下引入受體細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)染（transfection）：以噬菌體或病毒構(gòu)建的重組DNA引入受體細(xì)胞的過程。感染（infection）：病毒或重組病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化子：又稱工程菌，即接受了重組DNA的受體菌。2.受體細(xì)胞感受態(tài)感受態(tài)(competent)

：細(xì)胞最易攝取和“容忍”外來DNA的生理狀態(tài)。致敏：誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作。３．轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞常用的方法

1.磷酸鈣共沉淀法；2.DEAE-葡聚糖或聚陽離子促進(jìn)吸收法；3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法；4.電穿孔法；5.病毒轉(zhuǎn)染法；6.顯微注射法。

五、重組體篩選、鑒定與克隆擴(kuò)增平板篩選插入失活插入表達(dá)電泳篩選PCR篩選核酸雜交DNA測序免疫學(xué)檢測法1.常用篩選/鑒定陽性重組體的方法初步篩選精確鑒定表型鑒定1.平板篩選法（1）插入失活（insertionalinactivation)：

在載體某個(gè)基因序列的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上插入外源DNA后，使該基因失去活性，從而不能表達(dá)其相應(yīng)的功能。常以此現(xiàn)象作為標(biāo)記，篩選被這種重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇1.

Amps

Tets

（轉(zhuǎn)化失?。?.

Ampr

Tetr（轉(zhuǎn)化成功，但僅轉(zhuǎn)入載體，無重組）3.Ampr

Tets

（轉(zhuǎn)化、重組均成功）（2）插入表達(dá)（insertionalexpression)載體設(shè)計(jì)時(shí)，在篩選標(biāo)志基因前連接一段負(fù)調(diào)控序列（抑制作用），當(dāng)目的基因在此插入時(shí)，使其對下游的抑制作用喪失，從而下游的篩選標(biāo)志得到表達(dá)。CI為負(fù)控制序列（抑制Ter表達(dá)）當(dāng)DNA插入使CI失活Ter表達(dá)，由此作為陽性克隆的篩選。

2.酶切-電泳法篩選

經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后再抽提出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA,用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，電泳后根據(jù)DNA分子大小不同，鑒別真正重組體DNA，排除假陽性和載體自我連接載體雙重體。

該法不能鑒別插入片段大小相似的非目的基因片段的假陽性。

聯(lián)合酶切鑒定同源末端連接重組子中DNA插入片段的方向ＢＢ3.PCR法篩選

提取重組質(zhì)粒DNA，用已知的特異引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測有無相應(yīng)電泳帶。4.核酸分子雜交（hybridization）兩條不同來源的含有互補(bǔ)核苷酸序列的單鏈核酸分子，通過堿基配對規(guī)律形成一個(gè)新的穩(wěn)定的雙鏈核酸分子的過程菌落原位雜交（HybridizationinSitu）（以細(xì)菌為受體細(xì)胞）使用與目的DNA互補(bǔ)的探針鑒別陽性轉(zhuǎn)化菌菌落原位雜交法篩選復(fù)印至硝酸纖維素膜上用NaOH菌體裂解DNA變性雜交放射自顯影32P-cDNA與放射性cDNA雜交的菌落的斑點(diǎn)細(xì)菌菌落單鏈DNA結(jié)合到膜上5.DNA測序測序：確定DNA鏈上確切的堿基順序方法：對初步篩選的陽性重組子，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，酶切回收片斷，進(jìn)行DNA測序確認(rèn)。

6.免疫學(xué)檢測法鑒定表達(dá)產(chǎn)物

依據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的原理，以單克隆抗體對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行特異性檢測。六、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達(dá)基因工程表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng)酵母細(xì)胞系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)基因工程操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體基因工程的實(shí)踐1.利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗

乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能生長，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來的。雖然這種質(zhì)膜來源的疫苗具有較高的免疫原性，但其大規(guī)模生產(chǎn)受到病毒表面抗原來源的限制，而且提取物需要高度純化，純化過程中往往會(huì)發(fā)生失活現(xiàn)象。此外，最終產(chǎn)品還必須嚴(yán)格檢驗(yàn)其中是否混有病人的致病病毒。所有這些工序?qū)е轮圃斐杀靖呔硬幌?，因此這種傳統(tǒng)的乙肝疫苗生產(chǎn)方法不能滿足幾億接種人群的需求。乙醇氧化酶基因(aox1)啟動(dòng)子可幫助該質(zhì)粒整合到特定染色體位點(diǎn)的序列(3’-aox1)His合成過程中所需的組氨醇脫氫酶基因(his)圖10-12宿主采用組氨醇脫氫酶缺陷型(HIS4－)的P.pastoris，經(jīng)雙交換整合重組后，染色體上的aoxl丟失，而整合入aoxl啟動(dòng)子—HBsAg-aoxl終止子及加poly(A)信號(hào)序列、his4和3'aox1。整合后的細(xì)胞可在不含His的培養(yǎng)基上生長在酵母細(xì)胞中，這種蛋白能像在受乙肝病毒侵染的人體細(xì)胞中那樣，組裝成多亞基的復(fù)合物，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗