多酚氧化酶課件

多酚氧化酶一、多酚氧化酶的名稱和自然界的分布二、多酚氧化酶催化反應(yīng)及其作用底物三、pH和溫度對(duì)多酚氧化酶活力影響四、多酚氧化酶的激活劑、抑制劑和果蔬酶促褐變的防止五、多酚氧化酶的分子形式六、多酚氧化酶活力測(cè)定七、水果和蔬菜中的多酚氧化酶及其底物思考題：簡(jiǎn)述酶促褐變的機(jī)理及其控制措施。一、多酚氧化酶的

名稱和自然界的分布多酚氧化酶(1,2-苯二酚:氧氧化還原酶,EC1.10.3.1)

一類含銅的氧化還原酶，催化鄰-苯二酚氧化成鄰-苯二醌，也能作用于單酚單加氧酶的底物。多酚氧化酶的共同特征是能夠通過分子氧氧化酚或多酚形成對(duì)應(yīng)的醌。在廣義上，多酚氧化酶可分為三大類：?jiǎn)畏友趸?酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、雙酚氧化酶(兒茶酚氧化酶catecholoxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(對(duì)苯二酚氧化酶laccase,EC.1.10.3.1)。在這三大類多酚氧化酶中，兒茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。1、多酚氧化酶的名稱2、植物中多酚氧化酶分布多酚氧化酶是植物中最受注意的一種酶,在葡萄,洋李,無花果,棗,茶葉和咖啡豆中含量很高,它在這些果實(shí)中起著人們期望的作用.多酚氧化酶在桃,蘋果,香蕉,荔枝,馬鈴薯,蓮藕和萵苣中的含量也是相當(dāng)高,然而它對(duì)這些果實(shí)起著不需宜的作用,易引起褐變,造成變質(zhì)和腐爛,對(duì)于新鮮果實(shí)的保藏帶來極大困難胡椒中不存在多酚氧化酶.存在:植物、果蔬的葉綠體、線粒體,馬鈴薯塊莖分布廣泛二、多酚氧化酶催化反應(yīng)

及其作用底物1.催化反應(yīng)多酚氧化酶是一種加氧酶，它催化酚的選擇性羥基化，羥基化產(chǎn)物繼續(xù)氧化生成鄰-苯醌。多酚氧化酶的作用下氧化形成不穩(wěn)定的鄰-苯醌類化合物,然后再進(jìn)一步通過非酶氧化反應(yīng),聚合成黑色素(melanin[?mel?n?n])。鄰-苯醌多酚氧化酶的作用導(dǎo)致香蕉,蘋果,桃,馬鈴薯,蘑菇,蝦發(fā)生非需宜的褐變和人的黑斑形成然而對(duì)茶葉,咖啡,葡萄干和梅干,以及人的皮膚色素形成產(chǎn)生需宜的褐變當(dāng)鄰苯醌與蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的ε-氨基反應(yīng),可引起蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值和溶解度下降,同樣由于褐變反應(yīng)也將會(huì)造成食品的質(zhì)地和風(fēng)味的變化。熱帶水果50%以上的損失都是由于酶促褐變引起的.同時(shí)酶促褐變也是造成新鮮蔬菜例如萵苣和果汁的顏色變化,營養(yǎng)和口感變劣的主要原因控制果蔬加工和貯藏過程中酶促褐變,例如驅(qū)除O2和底物酚類化合物以防止褐變,或者添加抗壞血酸,亞硫酸氫鈉和硫醇類化合物等,將初始產(chǎn)物,鄰苯醌還原為原來的底物,從而阻止黑色素的生成.還原劑都能直接引起酶失活,從而抑制酶促褐變.這是因?yàn)榭箟难崮軌蚱茐拿富钚晕稽c(diǎn)上的組氨酸殘基,而亞硫酸氫鈉和硫醇可以除去酶活性位點(diǎn)中的Cu2+4-己基間苯二酚,苯甲酸和其他一些非底物酚類化合物,也可作為多酚氧化酶的有效競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑重要的天然底物三、pH和溫度對(duì)多酚氧化酶

活力影響1.pH對(duì)酶活力的影響(1)適宜pH：4～7(2)不同種類，甚至同一種果蔬中的不同品種得到的多酚氧化酶，也有不同的最適pH(3)果蔬的不同部位得到的多酚氧化酶,最適pH也有差異(4)酶的提取或分離的方法對(duì)它的最適pH也有影響(5)測(cè)定酶活力時(shí)所采用的底物和緩沖液對(duì)酶的最適pH也有影響(6)大多數(shù)多酚氧化酶只有一個(gè)最適pH,在一些情況下,有第二個(gè)最適pH2.溫度對(duì)多酚氧化酶活力影響不同種類、品種、部位的多酚氧化酶有不同的熱穩(wěn)定性，通常最適溫度在常溫加熱易使酶失活同一來源的多酚氧化酶的不同分子形式具有不同的熱穩(wěn)定性低溫下多酚氧化酶的活力也有明顯的下降，但活性下降比較緩慢2.抑制劑和果蔬酶促褐變的防止酶促褐變:較淺色的水果、蔬菜在受到機(jī)械性損傷（削皮、切片、壓傷、蟲咬、磨漿、搗碎）及處于異常環(huán)境變化（受凍、受熱等），在酶促（催化）下氧化而呈褐色，稱為酶促褐變西瓜、香瓜、桔子、檸檬

無酚酶，不褐變。亞硫酸類是酚酶抑制劑。褐變防止方法酶促褐變的三個(gè)條件，缺一不可。即：多酚類物質(zhì)、酚酶、氧氣除去多酚類物質(zhì)困難，不現(xiàn)實(shí)?！嘁话銥榻档头用富钚?、驅(qū)氧

(1)加熱鈍化酶活性75～95℃、5～7S的加熱處理，可使大部分酶活性喪失。常用的方法有：漂燙、巴氏殺菌加工中，必須嚴(yán)格控制時(shí)間和溫度。加熱溫度過高，加熱時(shí)間過長(zhǎng)，可抑制酶褐變，但會(huì)影響食品品質(zhì)；加熱不足，不能抑制酶褐變。微波加熱，熱穿透力強(qiáng)，迅速均勻，不影響風(fēng)味。(3)酸處理法多數(shù)酚酶最適pH＝6～7，pH<3失活(高酸性環(huán)境會(huì)使酶蛋白上的銅離子解離下來，導(dǎo)致PPO逐漸失活，酶活性趨于最低。)常用的酸有：檸檬酸、蘋果酸、磷酸、抗壞血酸、混合酸。檸檬酸可降低pH，還可絡(luò)合酚酶輔基Cu2+，但單獨(dú)用效果不大。常與抗壞血酸、亞硫酸合用。實(shí)踐證明：0.5%檸檬酸+0.3%抗壞血酸效果好?？箟难岵坏芙档腕w系pH，而且具有還原劑的作用，可將體系中的醌類及其衍生物還原成酚，并通過自身氧化來減少體系的含氧量。（4）酶活抑制劑亞硫酸類是酚酶抑制劑。常用的有：二氧化硫、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、低亞硫酸鈉(Na2S2O4)

如：在蘑菇、馬鈴薯、桃、蘋果等加工中，常用二氧化硫及亞硫酸鹽類作護(hù)色劑。實(shí)驗(yàn)表明：10ppm可抑制酚酶活性，但有揮發(fā)損失，還與醛類加成等。實(shí)際應(yīng)用300ppm，殘留<20ppm。在微酸性（pH＝6）時(shí)，抑制酚酶的效果最好。

防止原因有三：a.抑制酶活性b.將醌還原為酚c.與醌加成，防止聚合(5)驅(qū)氧通過沸水燙漂、抽真空（93kPa，5～15min）、高濃度抗壞血酸溶液浸泡、氣調(diào)包裝設(shè)計(jì)等均可達(dá)到驅(qū)除食品內(nèi)氧氣的目的，從而抑制酶褐變的發(fā)生?？刂蒲鯕夂坑贸榭仗幚砑夹g(shù)或添加去氧劑等方法：用2%食鹽+0.2%檸檬酸+0.06%偏重亞硫酸鈉溶液作抽空液，在500mmHg的真空度抽空5～10min,可取得良好的護(hù)色效果。五、多酚氧化酶的分子形式多酚氧化酶有多種分子形式原因：①類似的亞基不同程度的聚合；②不同亞基不同方式的結(jié)合;③酶蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變;④前三種情況的結(jié)合。多酚氧化酶多種分子形式之間的差別表現(xiàn)在底物特異性、最適pH、溫度穩(wěn)定性、對(duì)抑制劑敏感性、氧化和羥基化活力的差別。六、多酚氧化酶活力測(cè)定多酚氧化酶活力的測(cè)定方法可以分為兩類①測(cè)定底物消失的速度②測(cè)定產(chǎn)物生成的速度

——限于測(cè)定反應(yīng)的初速度。PPO活性測(cè)定終點(diǎn)法多酚氧化酶催化分子態(tài)氧將酚類化合物氧化為醌類反應(yīng)，以兒茶酚為多酚氧化酶的底物，其氧化產(chǎn)物在416nm處有最大光吸收。測(cè)定系統(tǒng)：1.5ml20mmol/L鄰苯二酚（溶于0.05mol/L,pH6.8KH2PO4-NaOH緩沖液中，然后再加入0.1ml酶提取液，保溫37oC，三氯乙酸終止反應(yīng)，并4000r/min離心5min，取上清液，適當(dāng)稀釋。以空白為對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定其在416nm波長(zhǎng)下的O.D值。酶活性單位為在測(cè)定條件下，每分鐘引起吸光度改變0.01所需的酶量七、水果和蔬菜中的

多酚氧化酶及其底物正常條件下，在未受損水果中，酚類物質(zhì)是與PPO酶存在于不同部位。這種分布是通過一系列膜系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，受膜屏障的作用，這種區(qū)域性的分布阻止了底物和酶的相互接觸，所以正常組織是不發(fā)生褐變的，一旦膜系統(tǒng)受損，使物質(zhì)的區(qū)域化分布破壞，PPO與酚類物質(zhì)接近并與其發(fā)生化學(xué)作用，這將導(dǎo)致褐變。水果有更大的有著較弱薄片成分的細(xì)胞，冷藏時(shí)易發(fā)生細(xì)胞壁破裂，使PPO與酚類物質(zhì)接觸，產(chǎn)生褐變。1.蘋果中多酚氧化酶引起蘋果褐變的重要原因之一未成熟的蘋果比成熟的更易褐變?cè)诖蠖鄶?shù)情況下，酶促褐變傾向在保藏期間是增加的4.馬鈴薯馬鈴薯匍匐莖、塊莖、花及根中的PPO活性明顯強(qiáng)于葉和莖，而塊莖外皮和花中子房及花藥PPO活性也高于同器官的其他部位馬鈴薯中PPO的最適溫度為30℃,在80℃處理5min,90℃處理2min,PPO活性基本喪失.考慮到馬鈴薯淀粉加熱可能變性的特點(diǎn),在