重組DNA技術(shù)及其進(jìn)展20091012課件

生物技術(shù)產(chǎn)品（傳統(tǒng)和現(xiàn)代）

泡菜

醬油

豆瓣醬

飴糖

啤酒面包味精

葡萄酒

豆腐乳

醬菜醪糟青霉素等抗生素

醋

人胰島素及胰島素類似物

DNA疫苗

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

轉(zhuǎn)基因植物

克隆動(dòng)物

轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物生物技術(shù)國(guó)際合作及發(fā)展組織的定義

應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)的原理，依靠微生物、動(dòng)物和植物體作為反應(yīng)器，將物料進(jìn)行加工，以提供產(chǎn)品來為社會(huì)服務(wù)的技術(shù)。

它包括傳統(tǒng)和現(xiàn)代生物技術(shù)。

傳統(tǒng)生物技術(shù)包括造醬、醋、酒、面包、奶酪、酸奶及其他食品的傳統(tǒng)工藝。我國(guó)：石器時(shí)代后期,祖先利用谷物造酒；公元10世紀(jì)，我國(guó)就有了預(yù)防天花的活疫苗；西方：巴比倫人在公元前6000年開始啤酒發(fā)酵，埃及人在公元前4000年開始制作面包；50年代，在青霉素大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的帶動(dòng)下，發(fā)酵工業(yè)和酶制劑工業(yè)大量涌現(xiàn)；發(fā)酵技術(shù)和酶技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、制革和農(nóng)產(chǎn)品加工等領(lǐng)域。

重組DNA技術(shù)及其進(jìn)展

重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系周蘭

碩士生學(xué)位課程：基因組學(xué)之個(gè)人簡(jiǎn)介1984年醫(yī)學(xué)學(xué)士1989年醫(yī)學(xué)碩士1997年醫(yī)學(xué)博士00-03芝加哥大學(xué)訪問學(xué)者2003年教授2004年博士生導(dǎo)師研究方向分子腫瘤學(xué)和腫瘤分子診斷聯(lián)系方式

本講綱要

1重組DNA技術(shù)概述

2重組DNA技術(shù)的基本步驟3重組DNA技術(shù)的進(jìn)展

4重組DNA技術(shù)的應(yīng)用

重組DNA分子（重組子）不同來源的DNA分子以共價(jià)鍵連接，形成的雜合DNA分子即重組DNA分子（recombinantDNAmolecule

)。通常是指外源DNA分子（目的基因）與載體分子結(jié)合所形成的雜合分子。@ItisaformofDNAthatdoesnotexistnaturally;@Ithasbeencreatedartificiallyonpurpose.

該技術(shù)的意義通過重組DNA技術(shù)，可有目的地：@改變生物的遺傳特性

@創(chuàng)造生物的新性狀

瑞士金大米富含胡蘿卜素1-2重組DNA技術(shù)的開拓者1)TheRecombinantDNAtechniquewasfirstproposedbyPeterLobban,agraduatestudentattheStanfordUniversity(DepartmentofBiochemistry).2)1972～1973年，科學(xué)助產(chǎn)士Berg和Cohen等將該技術(shù)接到了人間。斯坦福大學(xué)

Cohen加州大學(xué)舊金山分校Boyer1973年宣布：體外構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中表達(dá)。完善了Berg開創(chuàng)的重組DNA技術(shù)。1973年-基因工程元年。*將pSC101（具有四環(huán)素抗性）與pSC102（具有卡那霉素抗性）連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，后者獲得了這2種遺傳性狀；*將編碼蟾蜍rRNA的基因與pSC101連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，后者能夠產(chǎn)生蟾蜍的RNA，表明真核基因能夠在原核細(xì)胞中表達(dá)。構(gòu)建第一個(gè)有功能重組子的科學(xué)家StanfordUniversity位于舊金山市，創(chuàng)建于1885年的私立大學(xué)；占地8180英畝，校園具有一種粗獷、開闊之美，大片的樹林和山地，紅瓦黃墻、古樸的砂巖建筑、優(yōu)雅的胡佛塔，典雅莊嚴(yán)、飾滿壁畫的紀(jì)念教堂，羅丹深沉的雕塑群，處處顯示出名牌學(xué)府的厚重、深邃的學(xué)術(shù)氛圍。1920年斯坦福大學(xué)還只是一所“鄉(xiāng)村大學(xué)”，到了1960年便名列前茅，到1985年更被評(píng)為全美大學(xué)的第一名。它是硅谷的孵化器；同時(shí)，硅谷的發(fā)展也促成了它今天的成就。創(chuàng)辦人美國(guó)實(shí)業(yè)家利蘭·斯坦福(LelandStanford)在開學(xué)典禮上強(qiáng)調(diào)：“生活歸根到底是指向?qū)嵱玫?，你們到此?yīng)該是為了給自己謀求一個(gè)有用的職業(yè)。但也應(yīng)明白，這必須包含著創(chuàng)新、進(jìn)取的愿望，良好的設(shè)計(jì)和最終使之實(shí)現(xiàn)的努力?！?重組DNA技術(shù)的基本步驟2-1目的基因（I）的獲得2-2目的基因和載體的酶切1）限制性內(nèi)切酶

2）載體

3）酶切時(shí)酶的選擇2-3目的基因與載體的連接2-4重組子的轉(zhuǎn)化2-5重組子的篩選和鑒定Insert,外源基因2.1目的基因/目的DNA/Insert的獲得

目的基因：擬導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的外源基因片段獲取方法：根據(jù)對(duì)目的基因序列的認(rèn)識(shí)程度，采用不同的策略

2.1目的基因的獲得

1）化學(xué)合成法：序列已知的基因可用該法獲得

DNA全自動(dòng)合成儀準(zhǔn)確性高，合成速度快；

造價(jià)也高。所以很少用來合成大片段基因。2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)

部分或全部序列已知的基因，可通過PCR技術(shù)高效擴(kuò)增；是實(shí)際工作中常用的方法。

不足：可能會(huì)因?yàn)殄e(cuò)配導(dǎo)致目的基因序列的改變（第35輪復(fù)制后的錯(cuò)誤幾率達(dá)0.25%）；對(duì)策：高保真酶；低循環(huán)數(shù)等。所以，重組過程完成后，要經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證。

2.1目的基因的獲得

4）從各種基因文庫中篩選目的基因：（1）基因組文庫（genomicDNAlibrary）：從理論上講，其包含一種生物基因組DNA的全部序列。（2）cDNA文庫（cDNAlibrary)：含一種生物的全部表達(dá)基因。（3）篩選方法：核酸雜交或PCR等

**探針和引物設(shè)計(jì)依據(jù)：該基因的部分序列、蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列、與該基因緊密連鎖的一些分子標(biāo)記等

2重組DNA技術(shù)的基本步驟2-1目的基因的獲得2-2目的基因和載體的酶切

1）限制性內(nèi)切酶（基因刀）

2）載體

3）酶切時(shí)酶的選擇2-3目的基因與載體的連接2-4重組子的轉(zhuǎn)化2-5重組子的篩選和鑒定什么是載體？為什么要酶切？怎樣酶切？1）基因刀--限制性核酸內(nèi)切酶

(restrictionendonuclease，RE)

（1）定義：由細(xì)菌產(chǎn)生、能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在該處水解磷酸二酯鍵、切斷DNA雙鏈的核苷酸內(nèi)切酶

簡(jiǎn)稱限制酶或內(nèi)切酶

是重組DNA技術(shù)中的重要工具酶

（2）分類

（3）Ⅱ型限制酶的識(shí)別及切割

②酶的特性

*識(shí)別的靶序列與DNA的來源無關(guān)*特異識(shí)別/切割的回文序列多為48bp*酶切產(chǎn)物：5ˊ-P，3ˊ-OH*切割方式：平切和錯(cuò)位切（3）Ⅱ型限制酶的識(shí)別及切割③平切產(chǎn)生平(末)端/鈍端（bluntend)

兩條鏈上的斷裂位置是回文序列的對(duì)稱軸，即平切，這種形式的斷裂產(chǎn)生平末端或鈍端

（4）RE的命名原則

第1個(gè)字母：表示其來源微生物的屬名的第1個(gè)字母，斜體，大寫。

第2、3字母：表示其來源微生物種名的前2個(gè)字母，斜體，小寫。

其它字母：表示其來源微生物菌株號(hào)，正體，大或小寫。羅馬數(shù)字：表示從該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)。

--1973年常用RE的信息至今，人們已經(jīng)在上萬種微生物中篩選限制酶，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3000多種，它們大約有230種不同的識(shí)別位點(diǎn)。如果需要查閱特定酶的相關(guān)信息，可訪問

2重組DNA的基本步驟2-1目的基因的獲得2-2目的基因和載體的酶切1）限制性內(nèi)切酶

2）載體（=運(yùn)載工具）3）酶切時(shí)酶的選擇2-3目的基因與載體的連接2-4重組子的轉(zhuǎn)化2-5重組子的篩選和鑒定2)目的基因的轉(zhuǎn)運(yùn)工具-載體載體（vector）：是在相應(yīng)細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的、由DNA分子構(gòu)成的遺傳成分，又叫復(fù)制子。

功能：攜帶外源DNA（目的基因）進(jìn)入指定的受體細(xì)胞，并能夠在其中復(fù)制擴(kuò)增或轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。

（2）載體必須具備的基本特性

能獨(dú)立復(fù)制，拷貝數(shù)高（10-200個(gè)/cell)有MCS,以便外源基因的插入有選擇性遺傳標(biāo)記（抗藥基因等），以便篩選有足夠的容量，以容納外源DNA片段與受體細(xì)胞有親緣性，易于進(jìn)出使用安全（對(duì)使用者和環(huán)境）

**表達(dá)型載體還應(yīng)具備與受體細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件；

**多克隆位點(diǎn)（MSC，multiplecloningsite

）：是一段含有多種限制酶的單一切點(diǎn)的DNA序列，它有利于外源基因插入該區(qū)。（3）載體分類--按功能分

克隆載體：其產(chǎn)物是目的基因的大量拷貝；轉(zhuǎn)錄載體：其產(chǎn)物是目的基因轉(zhuǎn)錄的RNA；表達(dá)載體：其產(chǎn)物是目的基因編碼的蛋白質(zhì)，其除具克隆載體的基本元件（ori,Ampr,MCS等），還要具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA調(diào)控序列。（3）載體的分類-按受體細(xì)胞類型分原核載體:以原核細(xì)胞為受體細(xì)胞的載體真核載體：以真核細(xì)胞為受體細(xì)胞的載體穿梭載體（shuttlevector）：含原核和真核生物的復(fù)制子、能夠在原核和真核細(xì)胞中存在和復(fù)制的載體，因而可以運(yùn)載目的基因穿梭往返于兩種生物之間。

真核基因通常是先在原核細(xì)胞中擴(kuò)增，再在真核細(xì)胞中表達(dá)。

（3）載體的分類-按載體自身特性分

質(zhì)粒（plasmid)

λ噬菌體(bacteriophageλ)

粘性質(zhì)粒/粘粒(cosmid）

M13噬菌體（phageM13）

酵母人工染色體（YAC）病毒載體（virusvector）原核細(xì)胞載體真核細(xì)胞載體

（4）常用的載體舉例

①質(zhì)粒：是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的小分子、雙鏈、環(huán)狀DNA。

最廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒如pBR322、pUC系列等。

pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)①4.36kb；50-100拷貝/cell②一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)（ori)一個(gè)抗氨芐青霉素標(biāo)記(ampR)④一個(gè)抗四環(huán)素標(biāo)記(tetR)ampR和tetR基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點(diǎn)，供外源基因插入；當(dāng)外源基因插入抗藥基因位點(diǎn)時(shí)，AmpR→AmpS

、TetR→TetS.用于目的基因克隆受體細(xì)胞包括JM107,JM109,HB101,LE392等pBR322質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)分子量小、克隆容量大、轉(zhuǎn)化率高、易純化等；（經(jīng)驗(yàn)表明，為避免在DNA純化過程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體最好不要超過10Kb）；抗菌素抗性基因2個(gè)，可作為選擇標(biāo)記；pBR322質(zhì)粒載體還具較高的拷貝數(shù)，且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞中可積累1000-3000個(gè)拷貝，這為重組DNA分子的高效制備提供了極大的方便。**氯霉素可阻止蛋白質(zhì)合成，使質(zhì)粒有效利用原料，復(fù)制出更多的拷貝。

pUC系列質(zhì)粒

由pBR322和M13噬菌體構(gòu)建而成的質(zhì)粒載體；

(1)2.67kp；2千-3千拷貝/cell（2）AmpR（3）MCS（4）引入LacZ操縱子的DNA片段作為選擇標(biāo)志，可應(yīng)用藍(lán)白色菌落篩選（5）用于基因克隆和測(cè)序（6）其受體細(xì)胞包括JM101,JM105,JM107,JM109MCS②其它載體*λphage：可插入5kb到23kb的外源DNA。*粘粒(cosmid）：克隆極限達(dá)45kb，多用于克隆大片段和構(gòu)建基因組文庫。*M13單鏈?zhǔn)删w載體：可插入300～400bp；可從細(xì)菌培養(yǎng)液中大量抽取單鏈DNA，可用來作為DNA測(cè)序的模板；也可用來產(chǎn)生單鏈的DNA探針。*穿梭質(zhì)粒載體：如大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體；*體外轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒載體：pGEM-3Z/4Z，用于制備RNA探針等；*更大片段DNA的克隆載體：細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC，約300kb容量）；酵母人工染色體（yeastAC，YAC，容量為0.2-2Mb）2重組DNA技術(shù)的基本步驟2-1目的基因的獲得2-2目的基因和載體的酶切1）限制性內(nèi)切酶

2）載體

3）酶切時(shí)酶的選擇2-3目的基因與載體的連接2-4重組子的轉(zhuǎn)化2-5重組子的篩選和鑒定3）目的基因和載體的酶切

選擇RE時(shí)要考慮的關(guān)鍵因素：*切后的V與I之間的連接效率*重組后，閱讀框不能改變*連接形成的“接點(diǎn)”序列，應(yīng)能被一定的限制酶重新切割，以便隨后的鑒定和擴(kuò)增后外源基因片段的回收。**多酶聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)鹽濃度要求相同的酶，可以同時(shí)酶切；對(duì)鹽濃度要求不同的酶，則可以：

@選用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶切；@低鹽酶先切，然后加大鹽濃度，高鹽酶再切；@一種酶先切，更換緩沖液，另外的酶再切

1U的內(nèi)切酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1個(gè)小時(shí)，完全水解1μg的標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量。2重組DNA技術(shù)的基本步驟2-1目的基因的獲得2-2目的基因和載體的酶切1）限制性內(nèi)切酶

2）載體

3）酶切時(shí)酶的選擇2-3目的基因與載體的連接2-4重組子的轉(zhuǎn)化2-5重組子的篩選和鑒定2.3目的DNA與載體DNA的連接

接DNAligase“基因縫針”“glue”在體外、由DNA連接酶催化是重組技術(shù)的核心步驟；連接酶是重組技術(shù)的重要工具酶。2.3I與V的連接連接的實(shí)質(zhì)：雙鏈DNA的5’-P與相鄰的3’-OH之間形成新的共價(jià)鍵，即3，5-磷酸二酯鍵。

3`5`磷酸二酯鍵#連接的方式(1)

匹配的粘端連接

全同源粘端的連接、定向克隆不匹配粘端的連接平端連接

用T4DNA連接酶直接連接

同聚物加尾法

連接子（linker)

、雙連接子

普適子（adaptor，套頭，適應(yīng)子，銜接體)

（1）匹配粘端的連接

①全同源粘端的連接

特點(diǎn)：多是單酶切的結(jié)果；全同源，連接效率高；重組分子上保留了原限制酶的切點(diǎn)，有利于隨后的酶切鑒定和擴(kuò)增后目的基因的回收。

EcoRI

該類連接的不足之一：自身環(huán)化。兩末端序列是互補(bǔ)的，可自連（尤其載體分子），影響I插入V。

載體自身環(huán)化：已線性化的載體重新自身封閉成完整質(zhì)粒

防自身環(huán)化的對(duì)策A堿性磷酸酶使載體去磷酸化

帶5’-P的外源DNA分子可有效地與去磷酸化的的載體分子連接，產(chǎn)生帶2個(gè)缺口的開環(huán)重組分子；后者在轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后的擴(kuò)增過程中，這2個(gè)缺口自動(dòng)修復(fù)。B定向克?。ㄒ姾螅?/p>

不足之二：多拷貝插入，增加篩選難度；對(duì)策：調(diào)整兩者的分子數(shù)比不足之三：雙向插入，增加篩選難度

對(duì)策：定向克隆使目的基因按既定方向插入載體的重組方案。方法和原理：雙酶切，使V、I酶切后自身的兩粘端不匹配或“一平一粘”；如此，連接時(shí)它們只能按唯一的連接方向重組成新的DNA分子優(yōu)點(diǎn)：

*避免自身環(huán)化，提高重組效率；*實(shí)現(xiàn)定向插入，減少后續(xù)的工作量。②定向克隆（2）不匹配粘端的連接當(dāng)I與V之間無理想的RE酶切位點(diǎn)時(shí)，只能用不同的RE；其酶切產(chǎn)物的末端序列不匹配，不能直接連接。

對(duì)策：變成平端方法：5’-粘端---補(bǔ)齊或削平3’-粘端---削平不匹配粘端變平端,再連接補(bǔ)齊削平(3)平端連接

①平端的來源平切的限制酶機(jī)械斷裂的DNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA不匹配粘端補(bǔ)齊或削平后平端連接具有普適性，即可用于任何DNA片段間的連接，是非常有用的克隆策略。(3)平端連接②平端連接的基本方法：用T4DNA連接酶直接連接特點(diǎn)：粘端DNA分子相遇時(shí)，匹配堿基之間可先形成一種暫時(shí)的結(jié)合；而平端相互間無匹配堿基；因此，即使相遇，也會(huì)很快分開。從分子動(dòng)力學(xué)角度看：2匹配粘端之間的連接屬分子內(nèi)連接；

2個(gè)平端之間的連接屬于分子間的連接，因此，連接速度慢。不足：連接效率低、雙向插入等一般性對(duì)策：**高濃度的DNA和連接酶**在體系中加入低濃度PEG特別對(duì)策？？？有?。。、燮蕉诉B接的改進(jìn)方法

A、同聚物加尾法：其實(shí)質(zhì)是變?yōu)槠ヅ湔扯?，再連接。即用末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP添加到DNA分子的3’-端，人工形成互補(bǔ)/匹配的多聚核苷酸粘性末端。

polyG尾

載體的3’-端-多聚G(polyG)目的基因的3’-端-polyC退火時(shí)即互補(bǔ)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)載體與目的基因之間的連接。polyA與polyT呢？一樣可用?、燮蕉诉B接的改進(jìn)方法

B、連接子法

連接子（linker)

：是人工合成的、10～12bp的雙鏈寡核苷酸片段，平端，且含RE切點(diǎn)。使用時(shí)，將之引入目的基因的兩端，再酶切產(chǎn)生粘端，然后與載體連接。

連接子及其酶切和連接想想：該法有什么不足？如何解決？③平端連接的改進(jìn)方法

雙連接子：

在目的基因兩端引入帶不同酶切點(diǎn)的連接子，雙酶切后再連接，此即定向克隆@防自身環(huán)化

@防雙向插入@利于克隆片段的鑒定

@利于克隆片段的回收③平端連接的改進(jìn)方法

C、adaptor（普適子，套頭，適應(yīng)子)

人工合成的、至少一端為粘端的短雙鏈DNA，其中包含RE酶切后產(chǎn)生的粘端；其與載體連接的是粘端；與目的基因連接端則“可平可粘”

美國(guó)康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系吳瑞博士于1978年發(fā)明。連接子與普適子比較3）連接方式—小結(jié)(1)匹配的粘端連接

全同源粘端的連接-多是單酶切后的連接定向克隆-雙酶切(2)不匹配的粘端---變成平端，再連接（3）平端連接

直接連接

同聚物加尾法

連接子（linker)

、雙連接子（定向克?。?/p>

普適子（adaptor，套頭，適應(yīng)子)

**同聚物加尾法連接的產(chǎn)物及部分T4連接酶直接連接平端的產(chǎn)物無法用原來的RE來實(shí)現(xiàn)特異性的切割和回收（插入片段）Why?

4）連接的條件

（1）溫度和時(shí)間：12-16℃，連接12-l6h

（overnight）

（2）連接酶的濃度：平端連接用1-2U，粘端連接用0.1U，即可達(dá)到最佳效率。實(shí)際應(yīng)用時(shí)參照說明書（廠家不同，活性相差大）。（3）插入片段與載體分子的摩爾比值為2-3：1

*1U的連接酶：在最佳反應(yīng)條件下，15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1μgλ-DNA（HinDIII片段）所需要的酶量。2重組DNA的基本步驟2-1目的基因的獲得2-2目的基因和載體的酶切1）限制性內(nèi)切酶

2）載體

3）酶切時(shí)酶的選擇2-3目的基因與載體的連接2-4重組子的轉(zhuǎn)化2-5重組子的篩選和鑒定2.4rDNA導(dǎo)入受體細(xì)胞

1）導(dǎo)入的目的

擴(kuò)增外源基因

獲得其表達(dá)產(chǎn)物

rDNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，利用其生理?xiàng)l件，重組載體（如質(zhì)粒）得以擴(kuò)增，獲得足夠量的rDNA拷貝----

1分子rDNA,1分子外源基因

2）受體細(xì)胞種類及基本特性

（1）原核細(xì)胞：既可復(fù)制擴(kuò)增、又可表達(dá)外源基因；最經(jīng)典和最常用的受體細(xì)胞是大腸桿菌。（2）真核細(xì)胞：用于基因表達(dá)，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞。（3）基本特性

①易接納rDNA

②對(duì)載體復(fù)制擴(kuò)增無嚴(yán)格限制

③不降解/不修飾外源DNA分子

④符合安全標(biāo)準(zhǔn)3）外源基因?qū)氲南嚓P(guān)概念轉(zhuǎn)化(transformation)：rDNA導(dǎo)入原核細(xì)胞（細(xì)菌等）的過程。感受態(tài)細(xì)胞(CompetentCell)：經(jīng)特殊處理后易接受外源DNA的受體細(xì)胞--細(xì)菌表面正電荷增加，細(xì)胞壁和膜的通透性增加，以利于DNA分子的吸附和吸收。轉(zhuǎn)染(transfection):將rDNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。感染(infection)：通過攜帶rDNA的病毒感染受體細(xì)胞，從而把外源DNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過程。4）導(dǎo)入原核細(xì)胞的常用方法（1）氯化鈣轉(zhuǎn)化法：最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛。

原理：在0℃、2價(jià)陽離子的低滲溶液中，細(xì)菌膨脹成球形（感受態(tài)）；在42℃的熱沖擊下重組子可進(jìn)入細(xì)胞；在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)，球形細(xì)胞恢復(fù)原狀并繁殖。

轉(zhuǎn)化率：105-6轉(zhuǎn)化子/μgDNA（轉(zhuǎn)化子：經(jīng)過轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細(xì)胞）

42℃氯化鈣法（2）電穿孔法(electroperation)-電穿孔儀

原理：隨著外加電場(chǎng)電壓升高，細(xì)胞膜被壓縮變薄；當(dāng)膜電壓升到一定數(shù)值時(shí)，膜被擊穿，形成微孔，外源基因由此進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；切斷電場(chǎng)后，被擊穿的膜孔可自行復(fù)原優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高，108-9轉(zhuǎn)化子/μgDNA；原核和真核細(xì)胞均可。

不足：如電壓過大，致不可逆的膜損傷，細(xì)胞成活率低

大致參數(shù)：電壓：300～600V；冰上操作維持時(shí)間：20～100ms電穿孔法原理及流程示意圖2重組DNA技術(shù)的基本步驟2-1目的基因的獲得2-2I和V的酶切1）限制酶

2）載體

3）酶的選擇2-3I與V的連接2-4重組子的轉(zhuǎn)化2-5重組子的篩選和鑒定（Why?How?)轉(zhuǎn)入1-3的受體細(xì)胞是否都可在含抗生素的培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)？為什么？如何分辨“內(nèi)涵不同”的菌落？2.5重組DNA分子的篩選與鑒定

1）為什么要篩選和鑒定（1）重組率不可能達(dá)到100%（2）凡是轉(zhuǎn)入了載體的細(xì)胞都獲得了相應(yīng)的抗生素抗性，都可以在平板上生長(zhǎng)菌落，其中包括了轉(zhuǎn)入空載體或反向插入或多拷貝插入等的細(xì)胞。（3）PCR擴(kuò)增的插入片段，還需要鑒定序列的正確性。因此，重組體的篩選和鑒定乃重組DNA技術(shù)的重要步驟。篩/鑒

（1）插入失活篩選（2）藍(lán)/白色篩選（3）限制酶切圖譜篩選（4）原位雜交技術(shù)（5）免疫學(xué)方法（6）PCR篩選重組體（7）核苷酸序列測(cè)定2）篩選和鑒定方法

3）抗生素抗性基因插入失活法

最早、最廣泛使用的方法。例如：pBR322質(zhì)粒具有Ampr和Tetr

原理：插入失活（或插入缺失）

在體外重組中，I插入V的Tetr基因序列中,致其失活；該重組子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞便不能在含Tet的平板上生存。

操作程序：先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Amp的平板；再將Amp平板上的轉(zhuǎn)化子（菌落）影印至同時(shí)含有Amp和Tet的平板上；結(jié)果判斷：在Amp平板上生長(zhǎng)、但在Amp和Tet平板上不長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子即為含重組子的菌落。4）α-互補(bǔ)篩選（藍(lán)白色菌落篩選）

原理：載體中的LacZ(N)是E.coliDNA的短區(qū)段，編碼β－半糖苷酶N端的146個(gè)AA（也稱α－多肽），其中的Plac可以啟動(dòng)LacZ的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，但受抑制；IPTG（異丙基硫代β－半乳糖苷）能夠去抑制；受體菌JM103含LacZ(C)，可編碼β－半乳糖苷酶的C端部分α－互補(bǔ)：當(dāng)該類載體轉(zhuǎn)入相應(yīng)受體中，LacZ(N)與LacZ(C)編碼的產(chǎn)物可以組合成具有活性的酶蛋白，使底物X-gal分解生色（5溴4氯3吲哚β－半乳糖苷），因此出現(xiàn)藍(lán)色菌落。當(dāng)在MCS內(nèi)的LacZ（N)序列中插入外源基因后，該基因便不能正常表達(dá)，因此也就不能與受體菌實(shí)現(xiàn)α－互補(bǔ)作用，所以菌落呈白色。4）藍(lán)白色篩選--原理示意圖3）限制性酶切圖譜法:基本流程--

（1）挑選平板上的菌落→小量培養(yǎng)→快速提取質(zhì)粒；

（2）酶切（rDNA和載體）；

（3）分析并比較凝膠電泳結(jié)果:依據(jù)插入片段的有無或/和重組子的大小即可判斷所選菌落是否含重組子。

（4）核酸雜交法

原理：利用標(biāo)記（如32P）的DNA或RNA探針，與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA進(jìn)行核酸雜交，利用同源DNA配對(duì)的原理篩選含有目的基因的重組子。關(guān)鍵：探針制備，其長(zhǎng)度100～1000bp。標(biāo)記物：放射性同位素、生物素等方法：菌落原位雜交和S-blot步驟（以同位素標(biāo)記為例）：將生長(zhǎng)在平板上的菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜用堿（NaOH）處理膜上菌落，DNA變性并釋放到纖維素膜上80℃烘干膜（4～5h），使DNA牢固吸附在膜上將該膜與32P標(biāo)記的探針反應(yīng)（過夜），探針序列與目的基因互補(bǔ)雜交用一定離子強(qiáng)度的溶液沖洗該膜，以除去非特異吸附于膜上的放射性探針再烘干，放射自顯影按底片上陽性點(diǎn)的位置找出其在培養(yǎng)基上相應(yīng)的菌落，此即含重組子的菌落。（4）核酸雜交法

菌落原位雜交技術(shù)

5）PCR篩選以重組DNA為模板，PCR法直接擴(kuò)增外源基因，電泳鑒定/序列分析：是否有目的基因存在。6）免疫反應(yīng)篩選：此法不是直接檢測(cè)（目的）基因，而是檢測(cè)該基因編碼的產(chǎn)物（利用抗原抗體反應(yīng)），以此來篩選含有目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。7）核苷酸序列測(cè)定經(jīng)上述方法篩選的重組子，還需要通過測(cè)DNA序列測(cè)定，此乃最后鑒定：*如是已知基因：確認(rèn)本次重組是否準(zhǔn)確無誤，尤其插入片段來自PCR時(shí)；

*如是未知基因：明確其結(jié)構(gòu)，以推測(cè)其功能。

3重組DNA技術(shù)的進(jìn)展3-1提高連接效率3-2TA克隆3-3TOPO系列連接方法其它（略）3-1提高連接效率NEB公司生產(chǎn)的快速連接試劑盒—T4DNA連接酶高達(dá)2000U/ul，是其它產(chǎn)品的400倍，因此連接效率大為提高：

overnightvs5min（stickyorbluntends）3-2T-A克隆

直接重組PCR產(chǎn)物的簡(jiǎn)便方法。原理：TaqDNA聚合酶在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)，可以不依賴模板而在產(chǎn)物的兩端加上游離的A；因此，只要在載體切口處加上游離的T，PCR產(chǎn)物就可在T4DNA連接酶催化下直接與載體連接！

該法已廣泛應(yīng)用；商品化的載體如pGEM-TTaq酶同時(shí)具有末端連接酶活性，會(huì)在每條產(chǎn)物的3’-端自動(dòng)加上非模板依賴堿基,而且對(duì)A優(yōu)先,所以，PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A3-3TOPO系列連接方法-無需連接酶

*TOPOCloningisamolecularbiologytechniqueinwhichDNAfragmentsamplifiedbyeitherTaqorPfupolymerasesareclonedintospecificvectors

withouttherequirementforDNAligases.*ThekeytoTOPO?cloningisDNAtopoisomeraseI,whichfunctionsbothasaREandasaligase.*Vacciniavirus（牛痘病毒）topoisomeraseIspecificallyrecognisesDNAsequence---5′-(C/T)CCTT-3’.

1）TOPOTA克隆方法

原理：與TA重組一樣，唯一不同是兩者將PCR片段連接到T載體上的酶，該法用的是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I。

TOPOTA克隆試劑盒中包括（整個(gè)反應(yīng)只需五分鐘?。?）TopoisomeraseI載體：線性化，牛痘病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶I連接在3’-T的P上。（2）感受態(tài)細(xì)胞（3）SOC培養(yǎng)基等。

該酶識(shí)別序列：5′-(C/T)CCTT-3’Taq酶擴(kuò)增產(chǎn)物的TOPOTA克隆示意圖該酶識(shí)別序列：5′-(C/T)CCTT-3’2）TOPO平端克隆方法

PfuDNA聚合酶等擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物呈平端。

TOPO平端克隆法：改良載體--把ccdB

（Controlofcelldeath）基因并入到MCS中。結(jié)果---

（1）當(dāng)無I插入（自身環(huán)化）時(shí)，則ccdB基因表達(dá)，其蛋白破壞細(xì)菌的DNA促旋酶，致染色體降解、細(xì)菌死亡；（2）如有I插入，則ccdB基因不表達(dá)，受體細(xì)胞可生長(zhǎng)?？纱蟠鬁p少非特異性菌落，提高篩選效率。該法其余步驟同TOPOTA法，簡(jiǎn)單快速。

TOPO平端克隆方法原理示意圖但是，依然存在平端連接的共同不足：雙向插入。重組子中，正、反方向的連接約各占一半。3）定向克隆法（D-TOPO）

讓載體的一端為GTGG，同時(shí)讓正向引物的5’端添加CACC與載體互補(bǔ)（一粘一平），這樣就可定向插入PCR產(chǎn)物，重組效率在90%以上。4重組DNA技術(shù)的應(yīng)用20世紀(jì)以來，發(fā)展最快的學(xué)科之一對(duì)生命科學(xué)的許多領(lǐng)域產(chǎn)生了革命性的影響受重組DNA技術(shù)影響最大的是生物技術(shù)

&現(xiàn)代生物技術(shù)是隨著重組DNA技術(shù)的問世而“誕生”，即實(shí)現(xiàn)了生物技術(shù)從“傳統(tǒng)”向“現(xiàn)代”的飛躍。

&它是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心技術(shù)

比爾.蓋茨預(yù)言，超過他的下一個(gè)首富必定出自基因領(lǐng)域；李遠(yuǎn)哲先生（諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主）在北大百年校慶時(shí)說：亞洲國(guó)家如果在下次經(jīng)濟(jì)騰飛中有所作為的話，生命科學(xué)技術(shù)將是可能取得比較大的突破的一個(gè)領(lǐng)域。

4重組DNA技術(shù)的應(yīng)用4-1在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用（1）獲得靶基因的大量拷貝或/和表達(dá)產(chǎn)物供研究用（2）疾病相關(guān)基因的尋找和研究（3）構(gòu)建各種DNA文庫（4）制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，構(gòu)建人類疾病動(dòng)物模型，為研究人類疾病、探索新治療方法提供了有力手段

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenicanimals）就是指在其基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合外源基因、并能遺傳給后代的動(dòng)物。4重組DNA技術(shù)的應(yīng)用4-2在疾病治療中的應(yīng)用1）生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)/多肽類藥物（基因工程藥物）

*它們?cè)诮M織細(xì)胞內(nèi)含量甚微，常規(guī)方法提取很難滿足臨床應(yīng)用；*利用重組技術(shù)和生物反應(yīng)器（大腸桿菌、酵母菌、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物）可以大量生產(chǎn)，成本低，藥效好，并且毒副作用小，已經(jīng)在臨床廣泛應(yīng)用。

生物反應(yīng)器（bioreactor)：容許外源目的基因在其中表達(dá)的原核/真核細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)/植物。它經(jīng)歷了三個(gè)發(fā)展階段：細(xì)菌基因工程、細(xì)胞基因工程、轉(zhuǎn)基因動(dòng)/植物生物反應(yīng)器?；蚬こ躺a(chǎn)胰島素的原理示意圖

（1）10克胰島素

=1000磅牛胰=200升發(fā)酵液

（2）生長(zhǎng)激素釋放抑制因子

5mg=50萬只綿羊腦=9L發(fā)酵液（3）干擾素

1200升人血=1升發(fā)酵液

治療費(fèi)用：血來源需2-3萬美元/病人重組來源需200-300美元/病人質(zhì)粒類型？胰島素制劑

目前我國(guó)臨床應(yīng)用的胰島素制劑種類：1）從動(dòng)物（牛豬）胰腺組織提取純化的胰島素制劑：10克胰島素=1000磅胰腺組織（量少，制備費(fèi)力）

2）人胰島素及胰島素類似物：有優(yōu)勢(shì)，逐占主流。人胰島素如何制備：從人胰腺組織中提取或人工合成人胰島素？（1966年12月24日，“人民日?qǐng)?bào)”頭版頭條報(bào)道《我國(guó)在世界上第一次人工合成結(jié)晶胰島素》。許多人認(rèn)為，這一次中國(guó)人與諾貝爾獎(jiǎng)距離最近，簡(jiǎn)直可以用“擦肩而過”來形容）

糖尿病發(fā)病情況：1)全球：2025年全世界糖尿病患者將達(dá)到3億人（WHO)；2)中國(guó)：目前糖尿病發(fā)病率為5%，但是病人數(shù)僅次于印度，居世界第二；3)重慶：糖尿病發(fā)病率6.62%（男8.89%,女3.72%,2009-09)1982年，首個(gè)投放市場(chǎng)的重組人胰島素來自美國(guó)禮來公司；我國(guó)臨床上一直使用動(dòng)物胰島素，而純度更高、治療效果更好的人胰島素則完全依賴于從美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家進(jìn)口（美國(guó)和丹麥等）；1998年，由甘忠如博士研制的中國(guó)第一個(gè)重組人胰島素--甘舒霖終于問世；兩年后，“甘舒霖”以其符合美國(guó)、歐盟藥典標(biāo)準(zhǔn)和無可置疑的質(zhì)量，贏得了國(guó)內(nèi)外用戶的認(rèn)可。2001年，甘忠如博士研發(fā)小組成功研制出中國(guó)第一只超速效胰島素類似物——賴脯胰島素“速秀霖”；2002年，又成功研制出中國(guó)第一只長(zhǎng)效胰島素類似物——甘精胰島素“長(zhǎng)秀霖”。

胰島素類似物：是迄今為止最新、最先進(jìn)的第三代胰島素，與第一代動(dòng)物胰島素、第二代人胰島素最大的區(qū)別就是：它能完全模擬人體生理胰島素分泌模式，可以使血糖安全達(dá)標(biāo)而不會(huì)出現(xiàn)低血糖，大大降低了糖尿病所引起的各種并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。如果說動(dòng)物胰島素的出現(xiàn)旨在挽救糖尿病患者的生命，人胰島素使糖尿病患者在一定程度上緩解糖尿病癥狀，那么，胰島素類似物則可以控制糖尿病，即完全使糖尿病患者安全達(dá)標(biāo)，能夠和正常人一樣控制血糖。

產(chǎn)品名稱治療功能與醫(yī)藥范圍

1.人胰島素治療糖尿病

2.人生長(zhǎng)激素治療侏儒癥，加速創(chuàng)口愈合

3.α干擾素治療癌癥、病毒感染

4.β干擾素治療帶狀皰疹，眼結(jié)、角膜炎

5.γ干擾素治療癌癥、病毒感染

6.人組織纖溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治療急性心肌梗塞

7.紅細(xì)胞生成素(EPO)治療腎病性貧血，增加RBC及Hb8.超氧化物歧化酶清除超氧化物，治療關(guān)節(jié)炎，緩解心肌壞死

9.凝血因子Ⅷ治療A型血友病

10.乙型肝炎疫苗防治肝炎

11.神經(jīng)生長(zhǎng)因子維持神經(jīng)元細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和分化

12.腦啡肽鎮(zhèn)痛

13.降鈣素治療骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì)目前重組藥物研發(fā)重點(diǎn)

**從蛋白類藥物轉(zhuǎn)移到尋找更小分子的多肽藥物

因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的分子一般都比較大，不容易穿過細(xì)胞膜、血管壁等，因而影響其藥理作用的發(fā)揮，而小分子藥物在這方面具有明顯的優(yōu)越性。

**生物反應(yīng)器研究重點(diǎn)從原/真核細(xì)胞轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)基因動(dòng)/植物，如乳腺反應(yīng)器。

因?yàn)榍罢呱a(chǎn)的產(chǎn)品需要復(fù)雜的純化工藝，成本高；而轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品和乳制品則可直接作為商品使用，簡(jiǎn)便，成本低。

目前國(guó)內(nèi)外已有上百種藥用蛋白或多肽在植物中表達(dá)（干擾素、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素、抗原蛋白等）。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)重組藥物轉(zhuǎn)基因綿羊生產(chǎn)抗胰蛋白酶，35g/1L羊奶=6000$1頭羊=1個(gè)制藥廠轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)長(zhǎng)效tPA轉(zhuǎn)基因鼠生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)基因綿羊奶-抗凝血酶Ⅲ7g/L

轉(zhuǎn)基因奶牛--人促紅素(EPO)；轉(zhuǎn)基因羊生產(chǎn)血清白蛋白藥物存于奶中，省略提取純化成本，并且飲用更方便！4-2在疾病治療中的應(yīng)用2）生產(chǎn)基因工程抗體藥物Geneticengineeringantibody根據(jù)研究者的意圖，采用基因重組方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)-新型抗體（符合人的意愿）主要包括嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。

人一鼠嵌合抗體：將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應(yīng)用。構(gòu)建嵌合抗體的大致過程：將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。人源化抗體（改型抗體）：進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分?？贵w的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變。人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。

FDA批準(zhǔn)的26中抗體藥物中，利妥昔Rituxan、英夫利昔Remicade、赫賽汀Herceptin和阿瓦斯汀Avastin都超過40億美元，在治療淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤及自身免疫病中顯示了良好的臨床療效。例如：其中的針對(duì)血管表皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的抗體阿瓦斯汀（Avastin），可延長(zhǎng)晚期結(jié)腸癌患者的生存期平均5個(gè)月，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認(rèn)為它幾乎對(duì)所有的晚期結(jié)腸癌患者都有幫助，因此被批準(zhǔn)為治療晚期結(jié)腸癌的一線用藥。抗體是對(duì)其抗原有極強(qiáng)專一性的魔彈或巡弋飛彈醫(yī)療 以毒素連接抗體攻擊病變細(xì)胞研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測(cè)

特定抗原檢驗(yàn) 以ELISA偵測(cè)特定

病原體在美國(guó)藥品市場(chǎng)上其占全部生物技術(shù)藥物的

2000年1/5(15/76）；2007年1/3；全球年銷售額：

1997年3.1億美元；2003年超過52億美元；2007年258億美元；美國(guó)在全球抗體藥物市場(chǎng)一支獨(dú)秀，占90%：

在FDA批準(zhǔn)的26種抗體藥物中，利妥昔Rituxan、英夫利昔Remicade、赫賽汀Herceptin和阿瓦斯汀Avastin都超過40億美元，在治療淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤及自身免疫病中顯示了良好的臨床療效?；蚬こ炭贵w藥物的市場(chǎng)份額

目前,FDA批準(zhǔn)的治療性抗體藥物的主要靶點(diǎn)有：CD3、CD11a、CD20、CD25、CD33、CD52、GpIIb/IIIa、呼吸道合胞體病毒F蛋白、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（Her2）、TNF-α、VEGF和及表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）等。

SFDA批準(zhǔn)的抗體上市藥物主要靶點(diǎn)有：HAb18G/CD147（利卡?。?、IL-8（恩伯克）和EGFR（h-R3）。

例：針對(duì)血管表皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的抗體阿瓦斯汀（Avastin），可延長(zhǎng)晚期結(jié)腸癌患者的生存期平均5個(gè)月，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認(rèn)為它幾乎對(duì)所有的晚期結(jié)腸癌患者都有幫助，因此被批準(zhǔn)為治療晚期結(jié)腸癌的一線用藥。

3）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物

有望成為人體器官工廠

器官短缺的對(duì)策之一：異種移植

豬作來源的優(yōu)勢(shì)：孕期短、產(chǎn)仔多、生長(zhǎng)快，更重要的是其器官大小與人較接近

**未經(jīng)過人源化的豬器官會(huì)引起排斥反應(yīng)，導(dǎo)致器官移植失敗

**對(duì)策：通過轉(zhuǎn)基因方法去除豬引起人排斥反應(yīng)的關(guān)鍵基因，培育---

轉(zhuǎn)基因豬（單個(gè)生產(chǎn)）轉(zhuǎn)基因克隆豬（批量生產(chǎn)）我國(guó)的體細(xì)胞克隆豬問世體細(xì)胞克隆醫(yī)用豬：2007年5月24日在天津?qū)毜献娲N豬場(chǎng)出生，并有兩頭成功存活。意義：（1）在此基礎(chǔ)上，將會(huì)獲得轉(zhuǎn)基因克隆豬。

（2）有利于開展異種器官移植的研究和應(yīng)用。（3）有利于建立新藥篩選模型。天津，2007

“克隆”和“轉(zhuǎn)基因”之間的不同：前者紋絲不動(dòng)地保留了原來的遺傳性狀，而后者則改變了原來的遺傳性狀。“克隆”是無性繁殖，克隆動(dòng)物是不經(jīng)過生殖細(xì)胞而直接由體細(xì)胞獲得的新個(gè)體；而轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和普通動(dòng)物的區(qū)別只在于在受精卵或胚胎干細(xì)胞中轉(zhuǎn)入了另外的基因。如果能將克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合起來的話，也許可以在短時(shí)間內(nèi)就得到許多一模一樣的擁有優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，即轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將不再是單個(gè)生產(chǎn)，而是批量生產(chǎn)（轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物）。這對(duì)于制藥或器官移植等領(lǐng)域來說是一個(gè)很有潛力的發(fā)展方向。

4-2在疾病治療中的應(yīng)用4）基因治療重組DNA技術(shù)用于疾病治療的2種方式：（1）基因重組藥物：即其表達(dá)產(chǎn)物，如重組蛋白、重組抗體等；（2）基因本身即通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建具有特定功能的基因重組體，以之為藥物，以矯正（補(bǔ)償或抑制）功能異?；虻淖饔谩?/p>

遺傳病是基因治療的主要對(duì)象，尤其單基因遺傳病。目前，已發(fā)現(xiàn)的遺傳病有6500多種，其中單基因病約3000多種第一例基因治療：美國(guó)，1990年

分別4歲和9歲的兩個(gè)小女孩由于體內(nèi)腺苷脫氨酶缺乏而患有嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷癥?？茖W(xué)家對(duì)她們進(jìn)行基因治療并取得成功。這一開創(chuàng)性的工作標(biāo)志著基因治療已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)研究過渡到臨床實(shí)驗(yàn)。

1991年：我國(guó)復(fù)旦大學(xué)薛京倫教授與上海醫(yī)院合作，開展了首例B型血友病的基因治療臨床實(shí)驗(yàn)，也獲得成功。exvivo基因治療的臨床試驗(yàn)：在美國(guó)已進(jìn)行了多年，以p53基因治療藥物的研究最多，并于1995年批準(zhǔn)重組腺病毒p53制品進(jìn)入臨床試驗(yàn)；美國(guó)、日本、加拿大和歐洲的科學(xué)家開展了用重組腺病毒p53制品對(duì)頭頸部鱗癌、乳腺癌、食道癌等數(shù)十種腫瘤的基因治療；給藥方式：腫瘤局部注射、靜脈注射、介入給藥、胸腹腔灌注等方式；國(guó)外至今沒有獲得批準(zhǔn)的基因治療藥物：由于基因治療藥物在臨床試驗(yàn)中尚存在一些問題，F(xiàn)DA和歐盟一直沒有開綠燈。今又生深圳賽百諾基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的世界第一個(gè)基因治療藥物“重組P53腺病毒注射液”

于2003年10月獲得了國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的新藥證書。商品名“今又生”。

4-3在疾病預(yù)防中的應(yīng)用

疫苗（vaccine）：作為一種生物制劑，其發(fā)展是伴隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步而發(fā)展的。

1）傳統(tǒng)疫苗（第一、二代疫苗）

減毒活疫苗和死疫苗；第1個(gè)是炭疽病疫苗（1881年）2）重組亞單位疫苗(subunitvaccine，第三代)

20世紀(jì)70年代以來,用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的疫苗*只含病原體的一種或幾種抗原，而不含有病原體的其他遺傳信息。它保留了病原體的有效成分，但不含其感染性組分，因此安全有效。

優(yōu)點(diǎn)：安全，成本低廉，廣泛應(yīng)用

例如：最初的乙肝疫苗是血源性乙肝疫苗，從乙肝病人血液中分離提取乙肝表面抗原制成的，造價(jià)高（純化），乙肝血液來源受限，潛在感染危險(xiǎn)等；在20世紀(jì)80年代初將乙型肝炎病毒(HBV)S基因的一個(gè)835bp片段重組到表達(dá)載體，并在酵母中表達(dá)了HbsAg蛋白。系第1種真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的基因工程疫苗2009-4國(guó)家科技部宣布：第三軍醫(yī)大學(xué)鄒全明教授領(lǐng)銜的科研團(tuán)隊(duì)與重慶某生物科技公司共同研制的“口服重組幽門螺桿菌疫苗”最近獲國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)頒發(fā)的國(guó)家一類新藥證書。整個(gè)科研項(xiàng)目歷時(shí)十五年。**2009年9月2日，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA)批準(zhǔn)北京科興甲型H1N1流感疫苗的注冊(cè)申請(qǐng)。但，它非重組疫苗，而是流感裂解疫苗！！

3）疫苗研發(fā)

**新方向之一：轉(zhuǎn)基因動(dòng)/植物可食疫苗，其優(yōu)勢(shì)在于可食用性，因此，成本低（勿需純化等）、方便等。將病原微生物的抗原基因?qū)雱?dòng)/植物，其可在其中表達(dá)出活性蛋白；通過直接食用轉(zhuǎn)基因動(dòng)/植物產(chǎn)品，誘導(dǎo)人或動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。目前已有一些編碼細(xì)菌和病毒抗原的基因在動(dòng)/植物中成功表達(dá)，并且通過口服試驗(yàn)證明了其有效性。2002年，構(gòu)建表達(dá)乙肝表面抗原（HbsAg）的轉(zhuǎn)基因西紅柿植株，產(chǎn)量達(dá)9μg/100g成熟果實(shí)。2003年，將大腸桿菌的腸毒素LT-B基因在黃色玉米的玉米粒中定位表達(dá)、堆積，玉米粒便成為L(zhǎng)T-B抗原蛋白“膠囊”，使免疫效果成倍提升。2008年，改造西紅柿基因制成老年性癡呆（AD）疫苗國(guó)家植物基因研究中心的方榮祥院士等在“863計(jì)劃”的支持下，致力于用胡蘿卜生產(chǎn)口服疫苗的研究。**新方向之二：基因工程活載體疫苗利用基因重組方法改造細(xì)菌和病毒，使之成為活體重組疫苗（liverecombinantvaccine）。改造方式：1）非致病微生物通過基因重組使之?dāng)y帶特定抗原基因；2）致病微生物通過基因重組修飾或去掉毒性基因，仍舊保持免疫原性。其抗原的構(gòu)象與天然抗原非常相似或相同，因此免疫效力很高。**新方向之三：DNA疫苗（核酸疫苗）

傳統(tǒng)疫苗是抗原本身，而DNA疫苗則是編碼抗原的基因（DNA)，在其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)前，尚需要在體內(nèi)先表達(dá)成抗原。**抗原基因+表達(dá)載體---重組子---導(dǎo)入人體--活體細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)天然抗原--誘導(dǎo)特異性應(yīng)答，賦予人體特異免疫力。

尚在臨床試用階段。

DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)①安全，無感染危險(xiǎn)；

②制備簡(jiǎn)單（無需表達(dá)和純化）；

③免疫應(yīng)答持久（外源基因持續(xù)表達(dá)）；

④抗原在體內(nèi)自然表達(dá)，因此可以誘導(dǎo)類似自然抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答；

⑤核酸分子室溫下保存，無需冷藏，方便運(yùn)輸和保障接種效率。

4）中國(guó)疫苗研究和應(yīng)用現(xiàn)狀

中國(guó)是世界疫苗產(chǎn)品的最大生產(chǎn)國(guó)和使用國(guó)目前，新發(fā)及死灰復(fù)燃的傳染性疾病讓人們期待著有更多安全、有效的疫苗。人用疫苗是我國(guó)中長(zhǎng)期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006～2020年）確定的四個(gè)科技發(fā)展戰(zhàn)略重點(diǎn)之一，是現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，也是應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件的重要手段之一。4重組DNA技術(shù)的應(yīng)用

4-4在臨床診斷上的應(yīng)用

1）制備核酸探針等用于疾病的基因診斷；2）制備重組抗原，以生產(chǎn)相應(yīng)抗體，用于診斷；3）制備重組抗原，檢測(cè)受試者是否存在其抗體；

4）基因工程抗體：如小分子的單鏈抗體帶上