RNA加工與編輯課件

第七章

RNA加工與編輯在細(xì)胞內(nèi)，原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過一系列變化轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腞NA分子的過程，稱為轉(zhuǎn)錄后加工（post-transcriptionalprocessing）

原核生物mRNA一經(jīng)轉(zhuǎn)錄通常立即進行翻譯，除少數(shù)例外，一般不進行轉(zhuǎn)錄后加工。但tRNA和rRNA要經(jīng)過系列加工才能成為活性分子。一、真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工5`-末端加帽：m7G－pppNmNm3`-末端加尾：polyA（組蛋白基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物例外）剪接：外顯子和內(nèi)含子、斷裂基因(interruptedgene)編輯成熟mRNA前體:核內(nèi)不均一RNA(heterogenousnuclearRNA,hnRNA)經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工而來。ABCDEFGL12345677.7kb47185511291181431561043卵清蛋白基因初級產(chǎn)物hnRNA5`GpppGAAAhnRNA首尾修飾AAA3`5`GpppG套索RNAAAA3`5`GpppG成熟mRNA真核生物斷裂基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工核內(nèi)不均一RNA編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因是在核漿中被轉(zhuǎn)錄的。核漿RNA要大得多，很不穩(wěn)定，并且其順序的復(fù)雜性也要大得多。由于它的大小很不一致，故稱核內(nèi)不均一RNA(hnRNA)。細(xì)胞漿內(nèi)的mRNA平均只有1800-2000個堿基。而哺乳動物的hnRNA平均有8000-10000個堿基，其范圍很廣泛，從2000-14000堿基均有，所以一般要比mRNA大4-5倍。mRNA在5‘端有一個”帽子”(5’-Cap)，3‘端含多聚腺苷酸(polyA)序列。hnRNA被切除內(nèi)含子后即成為mRNA，并進入細(xì)胞漿內(nèi)。原核細(xì)胞的mRNA沒有加帽或加尾修飾。5`pppG5`pGppipppGpi5`GpppG5`m7GpppG（S-腺苷甲硫氨酸）CH3磷酸酶甲基化酶mRNAmRNAmRNAmRNA三磷酸雙鳥苷15`-末端帽子的生成（免受核酸酶破壞）

轉(zhuǎn)錄開始后-結(jié)束前，先于剪接加工注：帽子結(jié)構(gòu)中G未甲基化，翻譯效果差，但穩(wěn)定性不變mRNA鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶0號帽子、1號帽子、2號帽子23`-末端多聚腺苷酸的合成（加尾）

先于剪接加工

polyApolymerase催化，轉(zhuǎn)錄后修飾點序列（AATAAA）提供信號

一般長度為100~200個腺苷酸poly(A)聚合酶可以用ATP為底物，以加上poly(A)尾鏈。多聚（A)尾巴不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上去的。受polyA聚合酶催化，該酶能識別，mRNA的游離3’-OH端，并加上約200個A殘基。hnRNA的尾端要被切去一段，然后才加上poly(A)。因為RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄時即已通過了相當(dāng)于加上poly(A)的位點，故hnRNA尾端的多余部分要由內(nèi)切核酸酶切去，才能加上poly(A)。AAUAAA—GUGUGUGAATAAAGTGTGTGRNA-polIIPause3`processingAAUAAA-

polyAmRNA3`AGUGUGUGAATAAAGTGTGTGRNA-polIIPause5`HelicasenucleaseBReleaseC真核生物的轉(zhuǎn)錄終止及加尾修飾利用多個加poly（A）位點和不同的剪接方式產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。這類基因5'末端雖只有一個轉(zhuǎn)錄起始位點，但有兩個或多個加poly（A）位點，因此可通過不同的剪接方式得到不同的蛋白質(zhì)。3mRNA的剪接1）hnRNA和snRNA

hnRNA——成熟mRAN

前身（含非編碼內(nèi)含子）

snRNP(smallnuclearribonucleoprotein，小分子核糖核蛋白體)——由snRNA和核內(nèi)蛋白質(zhì)組成，作為RNA剪接場所。

2）外顯子(exon)、內(nèi)含子(intron)和斷裂基因(splitegene)

外顯子——

在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中出現(xiàn)，并表達為成熟RNA的核苷酸序列。

內(nèi)含子——

隔斷基因線性表達而在剪接過程中被除去的核苷酸序列。

斷裂基因——

由若干內(nèi)含子和外顯子互相隔開，但又連續(xù)鑲嵌的基因。（1）剪接接口（邊界序列）——內(nèi)含子5`-末端的GU和3`-末端AG，也即5`GUAG-OH3`。（2）剪接體（splicesome）——由snRNP與hnRNA結(jié)合的復(fù)合體。其功能：致內(nèi)含子形成套索，并使上、下游外顯子靠近的。4）mRNA的剪接機理（3）基本過程：

5）mRNA編輯（mRNAediting）

——指在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生改變RNA編碼序列，致一種基因產(chǎn)生不止一種蛋白質(zhì)的加工方式。A-OHCCRNaseP及內(nèi)切酶tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶及連接酶（ATP、CTP）注：tRNA的剪接是酶促反應(yīng)，切除內(nèi)含子的核酸內(nèi)切酶由tRNA基因內(nèi)含子編碼tRNA的拼接和修飾過程RNaseP由RNA和蛋白質(zhì)兩部分組成，但起催化作用的是RNA，而不是蛋白質(zhì)。（約4.5S)（約4S)前體成熟tRNA

3`NN5`堿基修飾甲基化tRNA的修飾過程包括：

1、甲基化——

在tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，某些嘌呤和核糖2`-OH被甲基化，如：AmA，GmG。（約占1%）2、還原反應(yīng)：UDHU3、核苷分子內(nèi)轉(zhuǎn)位反應(yīng)：U

4、脫氨反應(yīng)：5、3`-末端加CCA-OHAI腺苷酸脫氨酶RNA酶DRNA酶D，它能從RNA的3‘端一個一個地切去堿基，以產(chǎn)生tRNA的真正的3’端(5‘端由RNA酶P產(chǎn)生)。另一個也帶有外切核酸酶活性的酶是RNA酶Ⅱ，它能夠?qū)RNA完全分解完。以前認(rèn)為它亦tRNA加工有關(guān)，但目前認(rèn)為它可能僅和RNA的分解代謝有關(guān)。

在細(xì)菌中有兩種tRNA前體，其區(qū)別在于其3‘端的序列。Ⅰ型分子有CCA三聯(lián)體在其3‘端。Ⅱ型分子原沒有CCA序列。當(dāng)其他堿基被一個一個從前體分子上除去后，另由稱為tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶的將CCA加到3’端上去。目前認(rèn)為，真核生物中可能所有的tRNA前體都屬于Ⅱ型，在成熟時都需要通過酶的作用，在其3'端加上CCA序列。三、rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工

rRNA基因（rDNA）為豐富基因族，即染色體一些相似或完全一樣的縱列串聯(lián)基因單位重復(fù)，又稱高度重復(fù)序列DNA，還包括：5SrRNA基因、組蛋白基因和免疫球蛋白基因等。

rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工主要包括：

甲基化——先于切割拼接，主要位置在核糖-2`-OH上，約占2%左右。拼接初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，45S18S5.8S28S 成熟產(chǎn)物，rRNA32S20SrRNA轉(zhuǎn)錄后加工——拼接真核生物rRNA前體的加工大腸桿菌rRNA前體的加工細(xì)菌的rRNAs通過切割其共同前體形成的。E.coli的七個編碼rRNA的操縱子稱為rrnA-G.它們在染色體上并不相連鎖.每個操縱子均轉(zhuǎn)錄為一個RNA前體，然后被切割為成熟的rRNA分子。rrn操縱子的組成基本相同，均含有順序為16S-23S-5S的三個rRNA分子。兩個主要的rRNA(16S和23S)之外，還有一個5SRNA存在于同一轉(zhuǎn)錄本中。

1、原核生物

16SrRNA30SrRNA初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物23SrRNA5SrRNA

2、真核生物

18SrRNA45SrRNA初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5.8SrRNA28SrRNA

5SrRNA

大亞基rRNA小亞基rRNA大亞基rRNA小亞基rRNArRNA加工及其產(chǎn)物四、核酶（ribozyme）——具有催化功能的RNA

核酶（Ribozyme）是80年代初期，在研究四膜蟲rRNA剪接中發(fā)現(xiàn)的具有催化功能的RNA分子。它具有高度專一內(nèi)切核酸酶的活性。經(jīng)過科學(xué)家十多年的研究，核酶已被發(fā)展成為一項新型技術(shù)并廣泛應(yīng)用動植物抗病，人類疾病防治等領(lǐng)域的研究，顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。切赫（T.R.Cech）1988年與altman同時獲得諾貝爾化學(xué)獎（一）核酶特性

核酶作用的基礎(chǔ)——

錘頭狀結(jié)構(gòu)（也可發(fā)夾狀或斧頭狀）

錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)特點：

長度一般為60個核苷酸分子包含催化部分和底物部分，并組成錘頭結(jié)構(gòu)堿基至少有13個是一致性序列（二）意義

用人工合成的小片段RNA，配合在欲破壞其結(jié)構(gòu)的RNA或DNA分子上，使成為錘頭結(jié)構(gòu)，這就是人工設(shè)計的核酶。應(yīng)用于破壞病原體、基因修復(fù)、基因調(diào)控和基因治療等xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx人工設(shè)計的核酶注：粗、細(xì)線代表天然和人工合成的分子，x表示一致性序列x3`5`5`3`3`5`5`3`五．RNA的剪接機制1酶母tRNA的剪接酵母細(xì)胞核中400個tRNA基因中約有40個是斷裂基因。這些基因均只有一個內(nèi)含子，位于與反密碼子的3'側(cè)相隔一個核苷酸之處，長度為14至46bp。不同氨基酸的tRNA基因中的內(nèi)含子不相同，因此，剪接酶類看來并不能識別任何共同順序。剪切過程可分為兩個階段。第一步是磷酸二酯鍵的斷裂，這不需要ATP。這一步由一種內(nèi)切核酸酶所催化。第二步是連接反應(yīng)，需要ATP的存在，由RNA連接酶所催化。在無ATP時，產(chǎn)生的兩個tRNA半分子不能連接起來。這兩個半分子具有獨特的末端:其5‘端有OH基，而3’有一個2‘，3’-環(huán)磷酸基。當(dāng)加入ATP時，即發(fā)生第二步反應(yīng):兩個tRNA半分子先發(fā)生堿基配對，形成成熟tRNA分子的構(gòu)象，然后由RNA連接酶形成磷酸二酯鍵而將兩個半分子共價連接起來。2自身剪接反應(yīng)近期發(fā)現(xiàn)RNA也可有酶活性。這種有酶活性的RNA有人稱之為ribozyme。T.Cech和S.Altman各自獨立地發(fā)現(xiàn)RNA具有催化作用。從而改變了生物催化劑的傳統(tǒng)概念。為此他們共同獲得了1989年Nobel化學(xué)獎。

1978年Altman從純化的RNA酶P中分離出一種多肽和一種RNA(M1RNA)。最初的實驗結(jié)果表明，蛋白質(zhì)和M1RNA單獨都沒有酶活性，但二者混合在一起又可恢復(fù)活性。其它生物材料的實驗結(jié)果表明M1RNA是RNA酶P活性所必須的。1983年Altman證明，在較高濃度的Mg2+存在下，單獨的M1RNA就可以催化tRNA前體的成熟，而單獨的蛋白質(zhì)則沒有這種能力。這樣，RNA即可看作是個酶。事實上，M1RNA的酶活性并不比RNA酶P的粗制品的活性低。原來認(rèn)為蛋白質(zhì)賦予酶的活性，RNA只起某種輔助作用(例如幫助蛋白質(zhì)與其底物結(jié)合)，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)這兩種功能已經(jīng)倒轉(zhuǎn)。Cech給具有催化活性的RNA定名為ribozyme。很長時間以來，人們就試圖自己設(shè)計和生產(chǎn)酶分子，但因蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的復(fù)雜性，迄今為止，尚無成功的例子。近年來隨著ribozyme的發(fā)現(xiàn)，人工酶(新概念下的酶，它的構(gòu)件分子是核苷酸)的設(shè)計又產(chǎn)生了新的希望。澳大利亞的科學(xué)家就設(shè)計了九個ribozyme分子，它們都具備內(nèi)切酶的活性，且切割位點有高度特異性。同時，ribozyme的活性隨pH、溫度、及陽離子濃度的變化而變化，顯示出典型的酶特性。由于ribozyme的作用位點高度特異，故可以用來切割特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA)。有人將這種切割作用叫做抗基因活性。因為切割的結(jié)果破壞了RNA，也就是抑制了基因的表達。這種特性為我們進行基因和病毒的治療提供了一個可行的途徑。

某些線粒體中的內(nèi)含子也是自身剪接的內(nèi)含子。一些常見的真菌，如粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)，酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的線粒體內(nèi)含子都能進行自身剪接，像四膜蟲中進行的磷酸酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)一樣。四膜蟲rRNA前體的自我剪接3能夠編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)含子某些真菌線粒體中的內(nèi)含子有很不尋常的結(jié)構(gòu)，這些內(nèi)含子有編碼順序，這些順序的翻譯對于該順序所在的內(nèi)含子的剪接是必須的。編碼細(xì)胞色素b的box基因在僅剪去內(nèi)含子1時，會產(chǎn)生RNA成熟酶的mRNA。當(dāng)內(nèi)含子2亦被剪去時，才是細(xì)胞色素b的編碼順序的開端。線粒體中的box基因是編碼細(xì)胞色素b(cytb)的。box基因中的外顯子1有417bp，編碼cytb的N端139個密碼子。內(nèi)含子1有765bp，不編碼。外顯子2非常短，僅有5個密碼子。其后是一個很長的內(nèi)含子2。內(nèi)含子2的特點是其開頭840bp是一個開放讀框(ORF)，有280個密碼子，其最后一個密碼子為終止密碼子。當(dāng)將內(nèi)含子1剪去后，翻譯即從外顯子1起始，通讀過外顯子2而進入內(nèi)含子2的ORF，產(chǎn)生一個有423個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(其中144個是cytb的N端氨基酸，279個則由內(nèi)含子2編碼，稱為RNA成熟酶(maturase)。RNA成熟酶是特異地用來剪去內(nèi)含子2的。這個酶促反應(yīng)便成為一個非常敏感的負(fù)反饋徑路。去除內(nèi)含子2后，外顯子1和2即與外顯子3相連接，因而破壞了編碼成熟酶的順序。4剪接連接點剪接連接點(splicingjunctions)是指在切斷和重接位點處的兩旁的順序。在內(nèi)含子左側(cè)的連接點稱為供體(donor)，在內(nèi)含子右側(cè)的稱為受體(acceptor)。在細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)基因(即編碼多肽的基因)中的所有內(nèi)含子在外顯子-內(nèi)含子連接處均有GT．..AG的共同順序。較詳細(xì)的共同順序如下，供體位點受體位點：

外顯子...AG↓GTAAGT...內(nèi)含子...Py10CAG↓...外顯子箭頭表示切斷的鍵。這些還是較短的共同順序，存在于幾乎所有的真核生物中?；騾^(qū)域ExonIntronExon卵清蛋白內(nèi)元2UAAGGUGA～～～～～～～ACAGGUUG卵清蛋白內(nèi)元3UCAGGUAC～～～～～～～UCAGUCUGβ-珠蛋白內(nèi)元1GCAGGUUG～～～～～～～UCAGGCUGβ-珠蛋白內(nèi)元2CAGGGUGA～～～～～～～ACAGUCUCIgλ內(nèi)含子1UCAGGUCA～～～～～～～GCAGGGGCSV40病毒早期T抗原UAAGGUAA～～～～～～～UUAGAUUC含有內(nèi)元的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物其拼接處的堿基順序作為親核基團向Intron5'的磷酸二酯鍵發(fā)起進攻-1作為親核基團向Intron5'的磷酸二酯鍵發(fā)起進攻-1mRNA拼接反應(yīng)需要有核內(nèi)小分子RNA參與從上述共同順序可見供體和受體位點之間并無互補現(xiàn)象，所以不可能想像這兩個位點會通過堿基配對而結(jié)合一起，以便于內(nèi)含子的切除。正確的剪接并依賴于天然前體RNA分子的完整性。一個外源基因如果存在于病毒順序中，仍能很好地被剪接。另外，前體RNA亦能在不同的組織，或甚至不同物種的細(xì)胞中被正確地剪接。這都表示剪接作用是很保守的。一個真正基因中一個外顯子可以和另一個基因的外顯子連接起來。例如，將SV40(猴病毒40)的早期轉(zhuǎn)錄單位的第一外顯子和小鼠β珠蛋白的第三外顯子相連，這樣形成的雜交內(nèi)含子仍能正確地被剪接。即SV40的內(nèi)含子的供體位點(1I)可以剪接到小鼠β珠蛋白的內(nèi)含子的受體位點(r2)上。套索的產(chǎn)生在第一階段中，內(nèi)含子左端(供體位點)處被切斷，形成兩個分離的RNA分子，即左外顯子和右內(nèi)含子-外顯子。左外顯子此時為-線性分子，但右內(nèi)含子-外顯子則不然:內(nèi)含子左端(5‘端)以5’-2‘鍵與在內(nèi)含子右端上游約30堿基處的CTGAC序列(共同序列)中的A相連接，于是形成一個“套索”(lariat)。在第二階段，在受體位點處被切斷而將此套索狀的內(nèi)含子剪去;同時分離的右外顯子即與左外顯子相連接。套索然后被“脫支”(debranch)而形成一線性內(nèi)含子。在這種剪接機構(gòu)中，有三個很短的共同順序，即供體和受體位點處于一個和套索分支處的一個序列。用酵母做的實驗證明:分支處的共同順序如果發(fā)生突變或缺失將使剪接不能進行。這個共同順序常稱為T