核酸學(xué)生課件

第二章

核酸CHEMISTRYOFNUCLEICACID核酸與蛋白質(zhì)一樣，是一切生物機(jī)體不可缺少的組成部分。核酸是生命遺傳信息的攜帶者和傳遞者，它不僅對(duì)于生命的延續(xù)，生物物種遺傳特性的保持，生長(zhǎng)發(fā)育，細(xì)胞分化等起著重要的作用，而且與生物變異，如腫瘤、遺傳病、代謝病等也密切相關(guān)。因此，核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ)之一。

核酸概述

（一）核酸的發(fā)展史1.1869年,瑞士年輕的醫(yī)生FriedrichMiescher在廢棄的外科繃帶上的血細(xì)胞核中分離到一種物質(zhì)，含有高比例的磷，他將其命名為“核素”（nuclein）。后來(lái)，發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)烈的酸性，改名為“核酸”（nucleicacid）。雖然Miescher并不知道，但他發(fā)現(xiàn)了DNA！6.1953年,JamesWatsonandFrancisCrick提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。

（二）核酸概念和蛋白質(zhì)一樣，核酸是一種重要的生物高分子化合物，是由其結(jié)構(gòu)單體核苷酸通過(guò)3',5'-磷酸二酯鍵聚合而成的長(zhǎng)鏈，繼而形成具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的大分子化合物。核酸是動(dòng)物、植物、微生物機(jī)體的重要組成成分，約占細(xì)胞干重的５％～１５％。

（三）核酸分類(lèi)和分布1.核酸的分類(lèi)根據(jù)核酸的化學(xué)組成，分為兩類(lèi):

核糖核酸（ribonucleicacid簡(jiǎn)寫(xiě)為：RNA）脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid簡(jiǎn)寫(xiě)為：DNA）

（四）核酸的重要性1.DNA是主要遺傳物質(zhì)，是遺傳信息的載體。證據(jù)有：①細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。1944年Avery第一次證明了DNA是細(xì)菌轉(zhuǎn)化的因子。②噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)。1952年，Hershey和Chase噬菌體感染實(shí)驗(yàn)。2.RNA在蛋白質(zhì)生物合成中起重要作用。肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)IIIS型細(xì)胞（有毒）IIR型細(xì)胞（無(wú)毒）破碎細(xì)胞DNAase降解后的DNAIIR型細(xì)胞接受IIIS型DNA只有IIR型大多數(shù)仍為IIR型少數(shù)IIR型細(xì)胞被轉(zhuǎn)化產(chǎn)生IIIS型莢膜S（光滑）SRRR（粗糙）+DNA

一、核酸的化學(xué)組成

核酸的元素組成:C、H、O、N、P其中P在各種核酸中的含量比較恒定：RNA平均含磷量8.9%DNA平均含磷量9.1%核酸的逐級(jí)水解過(guò)程：

①核酸酶；②核苷酸酶；③核苷酶

磷酸

核酸→核苷酸→戊糖核苷→堿基①②③（一）戊糖（pentose）RNA中的戊糖為β-D-核糖（β-D-ribose）DNA中的戊糖為β-D-2-脫氧核糖(β-D-2-deoxyribose)RiboseDeoxyribose2′1′3′4′

5′

2′嘌呤環(huán)腺嘌呤鳥(niǎo)嘌呤N9是成苷位置2.嘧啶堿（pyrimidine）胞嘧啶（cytosineCytorC）尿嘧啶（uracilUraorU）胸腺嘧啶（thymineThyorT）RNA中的堿基為胞嘧啶和尿嘧啶；DNA中的堿基為胞嘧啶和胸腺嘧啶。

N1是成苷位置123456pyrimidineringsystem嘧啶環(huán)胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶4.堿基的結(jié)構(gòu)特征（1）結(jié)構(gòu)互變酮式烯醇式氨基亞氨基

（2）嘌呤堿和嘧啶堿分子中都含有共軛雙鍵體系，在紫外區(qū)有吸收（260nm左右）

（三）核苷（nucleoside）核苷是戊糖和堿基通過(guò)糖苷鍵形成的糖苷。

由戊糖（核糖或脫氧核糖）的第1位C碳原子與嘌呤堿的第9位N原子或嘧啶堿的第1位N原子通過(guò)N-糖苷鍵相連。核苷為β-型，堿基平面與戊糖平面互相垂直。Therearetwotypesnucleoside

?

ProteinsnucleosideDeoxynucleoside核酸中的稀有核苷：次黃苷（inosine,I）假尿苷(pseudouridine,)

7-甲基鳥(niǎo)苷（7-methylguanosine,

m7G）二氫尿嘧啶核苷（dihydrouridine,DHU）

RNA中的核苷酸有4種：

腺嘌呤核糖核苷一磷酸（腺苷一磷酸、腺苷酸）

（adenosinemonophosphateAMP）

鳥(niǎo)嘌呤核糖核苷一磷酸（鳥(niǎo)苷一磷酸、鳥(niǎo)苷酸）

（guanosinemonophosphateGMP）

胞嘧啶核糖核苷一磷酸（胞苷一磷酸、胞苷酸）

（cytidinemonophosphateCMP）

尿嘧啶核糖核苷一磷酸（尿苷一磷酸、尿苷酸）

（uridinemonophosphateUMP）AMPGMPUMPCMP

DNA中的脫氧核苷酸有4種：

腺嘌呤脫氧核糖核苷一磷酸（脫氧腺苷酸）

（deoxyadenosinemonophosphatedAMP）

鳥(niǎo)嘌呤脫氧核糖核苷一磷酸（脫氧鳥(niǎo)苷酸）

（deoxyguanosinemonophosphatedGMP）

胞嘧啶脫氧核糖核苷一磷酸（脫氧胞苷酸）

（deoxycytidinemonophosphatedCMP）

胸腺嘧啶脫氧核糖核苷一磷酸（脫氧胸苷酸）

（deoxythymidinemonophosphatedTMP）dAMPdGMPdTMPdCMP（五）重要的其他核苷酸衍生物1.多磷酸核苷酸各種核苷一磷酸（NMP）繼續(xù)磷酸化可生成為核苷二磷酸（NDP）和核苷三磷酸（NTP）例如：

AMP（adenosinemonophosphate）

ADP（adenosinediphosphate）

ATP（adenosinetriphosphate）AMPADPATP2.環(huán)化核苷酸

環(huán)腺苷酸

（cyclicAMPcAMP）

環(huán)鳥(niǎo)苷酸（cyclicGMPcGMP）它們作為細(xì)胞之間傳遞信息的信使。NcAMPcGMP二、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)

指核苷酸殘基沿多核苷酸鏈的排列次序。實(shí)驗(yàn)證明，DNA和RNA是沒(méi)有分支的多核苷酸鏈。1.連接方式：3',5'-磷酸二酯鍵2.確定：3'-末端和5'-末端3.核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)：各種不同的核苷酸在多核苷酸鏈上的排列順序。5`-末端磷酸3`-末端羥基3`，5`-磷酸二酯鍵

4.核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的表達(dá)方式：（1）化學(xué)結(jié)構(gòu)式：繁瑣、復(fù)雜。（2）簡(jiǎn)寫(xiě)式pApCpGpUpCp表示為磷酸基團(tuán)，p在堿基的左側(cè)表示與戊糖的5′-OH結(jié)合，右側(cè)表示與戊糖的3′-OH結(jié)合。讀向：左→右堿基序列：5'

→

3'

TCATGA5′PPPPPPOH3`5′pTpCpApTpGpA-OH3′5′TCATGA3′（3）豎線(xiàn)式

三、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)—雙螺旋結(jié)構(gòu)

（一）雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要依據(jù)

1.DNA堿基組成的Chargaff規(guī)則①組成的四種堿基：A、G、C、T②腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩爾數(shù)相等，A=T鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的摩爾數(shù)相等，C=G③嘌呤堿基總數(shù)=嘧啶堿基總數(shù)即：A+G=C+T④DNA的堿基組成有物種的特異性，不同物種的DNA有其獨(dú)特的堿基組成。⑤同一物種不同組織、器官有相同DNA堿基組成，不受生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)狀況及環(huán)境影響。DNA來(lái)源腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）鳥(niǎo)嘌呤（G）胞嘧啶（C）（A+T）/（G+C）大腸桿菌25.424.824.125.71.01小麥27.327.122.822.71.21鼠28.628.421.421.51.33豬：肝29.429.720.520.51.43胸腺30.028.920.420.7脾29.629.220.420.8酵母31.332.918.717.51.079不同生物來(lái)源的DNA四種堿基比例關(guān)系

2.X-光衍射數(shù)據(jù)

①1938年，Astbury等用小牛胸腺DNA纖維做X-射線(xiàn)衍射分析，發(fā)現(xiàn)有0.34nm的周期變化。②以后Franklin和Wilkins對(duì)DNA的X-衍射進(jìn)行了更多的研究，獲得清晰的衍射圖譜。說(shuō)明DNA是由2條或2條以上的多核苷酸鏈組成，沿長(zhǎng)軸有0.34nm和3.4nm兩個(gè)重要的周期性變化。DNA的Na鹽纖維和DNA晶體的X光衍射圖譜Franklin（3）DNA的滴定曲線(xiàn)DNA分子中的磷酸基可被滴定，堿基的可解離基團(tuán)不能被滴定。1953年，J.Watson和F.Crick在前人研究工作基礎(chǔ)上，根據(jù)DNA結(jié)晶X-衍射圖譜，提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（ThedoublehelicalmodelofDNAstructure），并對(duì)模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測(cè)，這是20世紀(jì)生物科學(xué)最偉大的成就。因此而獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。

（二）雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（B-DNA）要點(diǎn)1.DNA分子由兩條反向平行的多核苷酸鏈（一條鏈5′→3′,另一條鏈3′→5′）沿同一中心軸右手盤(pán)繞而成。磷酸與脫氧核糖通過(guò)3′,5′-磷酸二酯鍵相連接，構(gòu)成DNA分子的主鏈骨架。兩條主鏈?zhǔn)怯闪姿?脫氧核糖交替而成，位于雙螺旋外側(cè)，側(cè)鏈（堿基）位于雙螺旋內(nèi)側(cè)。堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行.2.兩條鏈之間存在堿基互補(bǔ)的關(guān)系。即：A和T配對(duì)，中間形成兩個(gè)氫鍵；C和G配對(duì)，中間形成三個(gè)氫鍵。5′3′

3.螺旋直徑2nm，相鄰堿基平面垂直距離0.34nm,螺旋結(jié)構(gòu)每隔10個(gè)堿基對(duì)（basepair,bp）重復(fù)一次，間隔為3.4nm。4.雙螺旋的表面含有明顯的大溝和小溝，其寬度分別為2.2nm和1.2nm，其堿基對(duì)暴露在外，與其他調(diào)節(jié)分子相互作用。5.雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素

（1）互補(bǔ)堿基之間氫鍵

主要決定堿基配對(duì)的特異性，而對(duì)雙螺旋穩(wěn)定的貢獻(xiàn)不是最重要的。

（2）堿基堆積力

包括疏水作用和范德華力。為螺旋穩(wěn)定的主要作用力。（3）溶液中的陽(yáng)離子或帶正電荷的化合物對(duì)DNA表面磷酸基團(tuán)的中和，消除了靜電斥力。

（三）DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象類(lèi)型DNA在不同鹽溶液及不同相對(duì)濕度下可以各種不同狀態(tài)存在：（1）B-DNA相對(duì)濕度92%的鈉鹽，典型的Watson-Crick雙螺旋DNA，右手雙螺旋，每圈螺旋10.4個(gè)bp，螺距：3.32nm。（2）A-DNA相對(duì)濕度75%鈉鹽，右手雙螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。（3）Z-DNA1979年Rich等發(fā)現(xiàn)。

GC交替的寡聚體，左手螺旋，外形細(xì)長(zhǎng)。天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z-DNA。A-DNAB-DNAZ-DNA

（四）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的意義該模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價(jià)值的是確認(rèn)了堿基配對(duì)原則，這是是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)。該模型的提出是本世紀(jì)生命科學(xué)的重大突破之一，它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石。四、DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA在雙螺旋結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上通過(guò)扭曲和折疊所形成構(gòu)象。超螺旋是三級(jí)結(jié)構(gòu)主要形式。

（一）雙鏈環(huán)狀DNA分子（dcDNA）

存在于某些細(xì)菌的染色體、質(zhì)粒、病毒、真核生物的線(xiàn)粒體和葉綠體中。在共價(jià)閉環(huán)雙螺旋基礎(chǔ)上進(jìn)一步扭轉(zhuǎn)盤(pán)曲,形成超螺旋(supercoil)體積進(jìn)一步壓縮。

①拓?fù)溥B環(huán)數(shù)（linkingnumber）L：一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)。②扭轉(zhuǎn)數(shù)（twistingnumber）T：B-DNA模型雙螺旋數(shù)。③超螺旋數(shù)（writhingnumber）WL=T+WW=0松弛環(huán)W<0負(fù)超螺旋（右手扭曲）W>0正超螺旋（左手扭曲）

（二）雙鏈線(xiàn)性DNA（dsDNA）分子存在于真核生物的染色質(zhì)和一些病毒中。五、DNA和基因組

本部分為自學(xué)內(nèi)容。六、RNA的結(jié)構(gòu)和功能①組成RNA的戊糖是核糖，主要堿基：A、U、G、C，U替代DNA中的T，還常有一些稀有堿基。②RNA的結(jié)構(gòu)單位主要是四種核苷酸：AMP、GMP、CMP、UMP。③核苷酸連接方式：3′,5′-磷酸二酯鍵。④天然RNA分子都是單鏈線(xiàn)形分子（有些病毒是雙鏈），可自身回折，形成局部雙螺旋（A-型，A＝U、G≡C），RNA中約40%-70%的核苷酸參與螺旋的形成。⑤穩(wěn)定性較差，易水解。

（一）tRNA（transferRNA）1.tRNA概況：（1）含量：占細(xì)胞內(nèi)RNA總量的15%。（2）種類(lèi)：50-60種，真核可達(dá)100多種（同工tRNA：運(yùn)載同一氨基酸的幾種tRNA）。（3）分子量：23-28kD，4S。（4）功能：專(zhuān)一攜帶氨基酸，是氨基酸運(yùn)載工具。有些tRNA可作為反轉(zhuǎn)錄酶的引物，參與DNA的合成。2.tRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)（1）組成：70-90個(gè)核苷酸（標(biāo)準(zhǔn)：76nt）。（2）不變和半不變的核苷酸：約有20多種。半不變的核苷酸主要是嘌呤或嘧啶間的互換的核苷酸。（3）TψCG序列：54-57位，與5SrRNA結(jié)合并與tRNA空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。（4）修飾堿基（修飾核苷酸）：轉(zhuǎn)錄后加工而形成，2-19個(gè)，70多種，占10%。3.tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)都呈“三葉草”形狀，一般可將其分為四臂四環(huán)：四環(huán)二氫尿嘧啶環(huán)：8-12nt反密碼環(huán)：7ntTψC環(huán):7nt額外環(huán)4-5nt可變四臂氨基酸臂：7bp3′-CCA二氫尿嘧啶臂：D臂3bp反密碼臂：5bpTψC臂：5bp酵母tRNAAla的二級(jí)結(jié)構(gòu)DHU環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)CCAAla3′5′TψC環(huán)4.tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

倒“L”形，是所有tRNA折疊后形成大小相似及三維構(gòu)象相似三級(jí)結(jié)構(gòu)，這有利于攜帶的氨基酸的tRNA進(jìn)入核糖體的特定部位。（二）mRNA（messengerRNA）概念：1961年Jacob和Monod提出用信使RNA命名。是帶有從DNA上的到信息并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類(lèi)RNA分子，稱(chēng)信使RNA。

含量：3-5%平均分子量50萬(wàn)，8S。功能：蛋白質(zhì)合成模板（遺傳密碼）。hnRNA：真核生物RNA前體，需剪接、加工后為成熟的mRNA。（三）rRNA（ribosomalRNA）占RNA總量的80％，與蛋白質(zhì)結(jié)合組成核糖體，是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所。種類(lèi)：細(xì)菌有16S、5S、23S三種，組成30S的轉(zhuǎn)錄單位。真核生物有18S、5.8S、28S和5S四種，前3種組成45S的轉(zhuǎn)錄單位，5SrRNA單獨(dú)轉(zhuǎn)錄。rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)：莖環(huán)結(jié)構(gòu)大腸桿菌5SrRNA結(jié)構(gòu)七、核酸的理化性質(zhì)核酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：分子大，有一些可解離的基團(tuán)，具有共軛雙鍵等。（一）一般理化性質(zhì)1.兩性電解質(zhì)。含有磷酸基和堿基，但表現(xiàn)為酸性。2.RNA純品是白色的粉末，DNA為疏松的石棉一樣的纖維狀固體。3.線(xiàn)性大分子，極不對(duì)稱(chēng)，具有粘度高，抗剪切力差等特點(diǎn)。3.溶解性：RNA和DNA都是極性的化合物，一般都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑，但其鈉鹽易溶于水。4.RNA的磷酸二酯鍵對(duì)堿敏感，室溫下，被稀堿水解為2′-或3′-核苷酸。DNA在堿中雖變性，但不被水解，所以DNA更穩(wěn)定。

5.鑒別DNA和RNA的反應(yīng)：RNA：D-核糖+濃鹽酸+苔黑酚→綠色DNA：D-2-脫氧核糖+酸+二苯胺→藍(lán)紫色

（二）核酸的紫外吸收1.核酸中的堿基有共軛雙鍵體系，有獨(dú)特的紫外線(xiàn)吸收光譜，其吸收峰240-290nm，最大吸收峰260nm。2.天然核酸比其各核苷酸成分的光吸收值之和少30-40%（如圖）。1.天然DNA2.變性DNA3.核苷酸總吸收值（三）核酸的變性、復(fù)性與分子雜交1.核酸的變性（1）變性（denaturation）的概念某些理化因素使核酸分子互補(bǔ)雙鏈之間的氫鍵斷裂，使雙螺旋變成松散單鏈的過(guò)程。（2）變性因素?zé)嶙冃裕?0℃幾分鐘，螺旋→線(xiàn)團(tuán)酸堿變性（pH小于4或大于11）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）

（3）變性表征①黏度下降、比旋光度下降、沉降系數(shù)增加、浮力密度增大、酸堿滴定曲線(xiàn)改變、生物活性喪失。②增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）：變性后的核酸紫外吸收值增加的現(xiàn)象。（4）熱變性和Tm①DNA的熱變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。②Tm：即解鏈溫度或熔解溫度（meltingtemperature），指核酸加熱變性過(guò)程中，A260紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時(shí)的溫度。在Tm時(shí)，DNA內(nèi)50%的雙鏈結(jié)構(gòu)被解開(kāi)。DNA的Tm一般在82-95℃之間。DNA的熱變性曲線(xiàn)③影響Tm值大小因素核酸均一性：均一性高，變性溫度范圍越窄。

G-C含量與Tm值成正比。經(jīng)驗(yàn)公式：

Tm=69.3+0.41(G+C)%介質(zhì)離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度低，Tm低；離子強(qiáng)度高，Tm高。

pH：影響堿基的解離。高pH下，堿基失去質(zhì)子，影響堿基對(duì)之間氫鍵的形成