基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)課件

第三章基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3’-5’磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3’末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5’磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3’末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié)DNA連接酶第三節(jié)

DNA聚合酶第四節(jié)DNA及RNA的修飾酶第五節(jié)核酸外切酶第六節(jié)單鏈核酸內(nèi)切酶一、寄主控制的限制與修飾人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來(lái)的DNA，并能使后者降解掉。限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。各種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來(lái)限制外源DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但合成這種酶的細(xì)胞自身的DNA不受影響，因?yàn)檫@種細(xì)胞還合成了一種修飾酶，對(duì)自身的DNA進(jìn)行了修飾，限制性酶對(duì)修飾過(guò)的DNA不能起作用。修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。數(shù)字表示在不同寄主中生長(zhǎng)的噬菌體的成斑率，表示限制程度。二．限制和修飾作用的分子機(jī)制1．大腸桿菌宿主細(xì)胞K株，B株，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。1）

它們均有三個(gè)連續(xù)的基因位點(diǎn)控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）

hsdR編碼限制性核酸內(nèi)切酶---識(shí)別DNA分子特定位點(diǎn)，將雙鏈DNA切斷。（DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞：受體細(xì)胞去掉hsdR基因位點(diǎn)）3）

hsdM編碼產(chǎn)物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位點(diǎn)的堿基甲基化反應(yīng)。4）

hsdS表達(dá)產(chǎn)物的功能是---協(xié)助限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶，識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)。（1）Ⅰ型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分離出的核酸內(nèi)切酶。分子量較大，反應(yīng)需Mg2+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但沒(méi)有特異的切割位點(diǎn)，而且切割是隨機(jī)的，所以在基因工程中應(yīng)用不大。（2）Ⅱ型酶1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血菌Rd株中分離出來(lái)的限制酶。分子量較小（105Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需Mg2+的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上。許多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重組。二、限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)

1、定義、命名（1）定義廣義指上述三個(gè)系統(tǒng)中的限制酶；狹義指II型限制酶。（2）命名限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號(hào)、分離順序。例如：HindⅢ

前三個(gè)字母來(lái)自于菌種名稱H.influenzae，“d”表示菌系為d型血清型（菌株號(hào)）；“Ⅲ”表示分離到的第三個(gè)限制酶。EcoRI—Escherichiacoli

RI

2、限制酶的特點(diǎn)（1）基本特點(diǎn)在DNA雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。兩個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片斷，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。

（2）識(shí)別順序和酶切位點(diǎn)①識(shí)別４-8個(gè)相連的核苷酸

MboINGATCN

AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCCPpuMIPuGG(A/T)CCPy

估算RE識(shí)別序列在DNA上出現(xiàn)的頻率:識(shí)別序列的頻率=1/4n

Sau3A(4bp)=1/44256bp

EcoRI、Pst

I(6bp)=1/464096

NotI(8bp)=1/4865536(rarecutters)

僅是理論推測(cè)②對(duì)稱性③限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是5’-P和3’-OH

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

（3）末端種類①3’-端突起，個(gè)數(shù)為2或4個(gè)核苷酸Pst

I5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’②5’-端突起，個(gè)數(shù)為2或4個(gè)核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAG-5’

5’粘性末端3’粘性末端平頭末端（4）異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）①定義：能識(shí)別相同序列但來(lái)源不同的兩種或多種限制酶②特點(diǎn)：識(shí)別相同順序切割形成相同的末端

KpnIGGTACCSstICCGCGGAsp718GGTACC

SacICCGCGG

（6）限制片段末端的連接作用①分子間連接分子間連接：不同的DNA片段通過(guò)互補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連接起來(lái)。分子內(nèi)連接：同一片段的2個(gè)互補(bǔ)末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)行分子。返回三、影響內(nèi)切酶活力的因素（1）DNA的純度污染的蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高濃度的鹽離子等都有可能抑制核酸內(nèi)切酶活力。提高效率的方法：①增加核酸內(nèi)切酶的用量②擴(kuò)大反應(yīng)體積，使?jié)撛谝蛩乇幌♂將垩娱L(zhǎng)酶催化時(shí)間（2）DNA的甲基化程度基因克隆中采用失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。應(yīng)用：利用核酸內(nèi)切酶對(duì)甲基化序列的敏感性檢測(cè)序列中的甲基化位點(diǎn)（3）酶切消化的反應(yīng)溫度大多數(shù)核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)溫度在37℃，有些酶例外。（表3-7）酶活力單位：一個(gè)活性單位（U），是指在50l反應(yīng)體系中，37oC的條件下，經(jīng)過(guò)1小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，將1gDNA完全酶解所需要的酶量。（4）DNA的分子結(jié)構(gòu)DNA分子的不同結(jié)構(gòu)對(duì)核酸內(nèi)切酶的活性有很大影響：例如:①切割超螺旋的或病毒DNA比線性的酶用量高出很多倍；②切割不同位點(diǎn)的序列效率會(huì)有差異；——可能是由于側(cè)翼序列的影響對(duì)于局部消化時(shí)要考慮到不同位點(diǎn)的切割效率（5）核酸內(nèi)切酶的緩沖液（-20℃保存）主要成分：氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀，Tris-HCl，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇（DTT）Mg2＋：酶發(fā)揮活性必需，不正確的Mg2＋和NaCl會(huì)影響對(duì)特異序列的識(shí)別。Tris-HCl：保證酶反應(yīng)的pH，一般在pH

7.4條件下功能最佳巰基乙醇：保持某些酶的穩(wěn)定性非最適條件下酶的識(shí)別序列會(huì)發(fā)生變化：高濃度的酶，高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、高pH，用Mn2＋代替Mg2＋等甘油的影響（星號(hào)活性）例：EcoRⅠ在正常情況下識(shí)別GAATTC，但是如果甘油濃度超過(guò)5％（V/V），識(shí)別序列發(fā)生變化，可在AATT或PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割。返回四、核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化作用完全酶切消化：例如識(shí)別6個(gè)堿基的酶，可以每隔46＝4096切割一次。切割達(dá)到了這樣的片段化水平，為限制酶對(duì)DNA分子切割完全。局部酶切消化使酶切反應(yīng)不進(jìn)行完全，可以通過(guò)縮短反應(yīng)時(shí)間，減少酶的用量，降低反應(yīng)溫度等方法約束酶活性。五、限制酶的用途DNA重組限制酶（物理）圖譜繪制

突變分析（RFLP分析）限制酶的部分酶切與完全酶切酶切圖譜的構(gòu)建例1：限制性消化反應(yīng)體系。總體積是30μL。5μL質(zhì)粒DNA1μLEcoRI1μLXbaI3μL10×RE緩沖液20μL水例2：畫一張與這些結(jié)果一致的示意圖，確切地標(biāo)明所有限制性酶的酶切位點(diǎn)及它們之間的距離，包含下列所有的信息：（1）限制性酶位點(diǎn)之間要有合適的距離（例如：EcoRI-BamHI=3.3kb）（2）在你的圖中央標(biāo)明質(zhì)粒的總大小。（3）限制性酶的位點(diǎn)應(yīng)在與它彼此相對(duì)應(yīng)的正確位置上標(biāo)明。BamHⅠ：得到3.3和3.7kbEcoRⅠ：得到5和2kbBamHⅠ和EcoRⅠ：得到3.3，1.7，1.5，0.5kb3.3kb2kbEcoRⅠBamHⅠ5kb1.7kb1.5kb0.5kb酶切反應(yīng)注意事項(xiàng)價(jià)格昂貴決不能用水稀釋，以免變性失活。預(yù)先加入除酶以外的所有其他試劑。取酶立即放于冰上。分裝小份避免反復(fù)凍融。使用無(wú)菌的新吸頭。少加水，使體積最小，但保證酶液體積不超過(guò)總體積的10％，否則酶液中的甘油會(huì)抑制酶活性。返回一、DNA連接酶的種類及反應(yīng)條件二、反應(yīng)機(jī)理三、粘性末端DAN片斷的連接四、平末端的連接（1）銜接物連接法（2）DNA接頭連接法（3）同聚物加尾連接法五、熱穩(wěn)定的連接

第二節(jié)DNA連接酶和DNA分子的體外連接能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團(tuán)（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。只能連接切口（nick），不能連接缺口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。dsDNA結(jié)構(gòu):切口，缺口，斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'nicknick一、連接酶的來(lái)源1、DNA連接酶大腸桿菌染色體編碼的2、T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的

DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP從T4噬菌體的受感染細(xì)胞中提取，是由T4噬菌體基因組所編碼。特點(diǎn)：

只連接dsDNA分子，要求3’-羥基和5’-磷酸基

用途：

1)相同或相容粘性末端的連接

2)平整末端的相連

DNA平端來(lái)源：限制酶作用結(jié)果;限制酶與其它酶共同作用結(jié)果。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多。

返回DNA的腺苷酸復(fù)合物3’-OH對(duì)P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵此反應(yīng)是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費(fèi)兩個(gè)高能磷酸鍵（賴氨酸殘基）二、反應(yīng)機(jī)理返回三、粘性末端DAN片斷的連接由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。對(duì)載體的5’末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團(tuán)，使載體不能自連。而外源片斷的5’-P能與載體的3’-OH進(jìn)行共價(jià)鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5’-P的鏈不能進(jìn)行連接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。返回四、平末端DNA片斷的連接T4DNA連接酶用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端修飾之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法

1、同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B分別中加入dATP和dTTP，末端轉(zhuǎn)移酶加上同聚物尾巴10~40個(gè)堿基Klenow酶補(bǔ)平末端2、銜接物連接法平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。

HpaIIBamHICCGGATCCGGGGCCTAGGCC

HpaII將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。銜接物連接法銜接物（linker）是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。雙銜接物：可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除也比較方便。雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過(guò)DNA聚合酶合成第二鏈加入SalI銜接物SI核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補(bǔ)齊，加入第二銜接物EcoRI在用DNA銜接物連接法時(shí)，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點(diǎn)，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的基因切斷。3、DNA接頭（adapter）連接法1978年，美國(guó)康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞博士發(fā)明的。是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG粘性末端容易通過(guò)堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對(duì)DNA接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。DNA接頭連接法返回五、熱穩(wěn)定的連接

從嗜熱高溫放線菌的菌株中分離出來(lái)的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。使用這種連接酶進(jìn)行體外連接，可以明顯降低形成非特異性連接產(chǎn)物的機(jī)率（1）寡核苷酸連接測(cè)定

（oligonucletideligationassay,OLA）用兩個(gè)寡核苷酸探針（20~25bp），同已知序列靶DNA雜交，探針在靶DNA分子的位置是相鄰的。

待擴(kuò)增的DNA片斷PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP陽(yáng)性信號(hào)無(wú)信號(hào)鏈霉抗生物素蛋白由于堿基錯(cuò)配不能形成磷酸二酯鍵檢測(cè)單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性AGTGACCTTCACTGGABAGTGACCTAGTTACCTACCTACCTAGTGACCTAGTGACCT偶聯(lián)堿性磷酸酶的抗地高辛抗體5’3’洗滌后加入堿性磷酸酶底物（2）連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ligasechainreaction,LCR）也叫連接擴(kuò)增反應(yīng)（ligase

amplicationreaction），用寡核苷酸探針通過(guò)DNA連接酶的作用擴(kuò)增已知序列的靶DNA的方法。需要4種引物。樣品DNA、4種極大超量的探針、NAD，pH7.8混合94℃變性55℃退火，使探針與模板雜交DNA連接酶連接熱穩(wěn)定的DNA連接酶連接熱穩(wěn)定的DNA連接酶連接①裂口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（G-LCR）連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中存在獨(dú)立于靶DNA的連接作用G-LCR可以避免獨(dú)立于靶DNA的連接作用，從而使敏感性大大提高寡核苷酸探針已經(jīng)被修飾過(guò)，具有交錯(cuò)末端退火后兩個(gè)探針間用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶補(bǔ)齊后連接。②不對(duì)稱裂口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（AG-LCR）可用于檢測(cè)RNA分子RNA4探針4、熱敏感的反轉(zhuǎn)錄酶、三種dNTPRNA4432132聚合酶連接酶1探針4發(fā)生延伸反應(yīng)，到混合物中沒(méi)有補(bǔ)充所需的dNTP反應(yīng)終止，延伸了9-15個(gè)核苷酸探針1與探針2雜交，發(fā)生延伸反應(yīng)返回五、影響連接酶作用的因素1、反應(yīng)溫度連接缺口的溫度：37℃，但是粘性末端的氫鍵不穩(wěn)定連接粘性末端的最佳溫度：4～16℃2、T4DNA連接酶的用量平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適1～2個(gè)單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個(gè)單位。

ATP的用量10μmol~1mmol/L之間3、提高外源片斷與載體的濃度的比值，（3～10倍）返回常用的DNA聚合酶

大腸桿菌DNA聚合酶

大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片段

T4DNA聚合酶

反轉(zhuǎn)錄酶

T7DNA聚合酶第三節(jié)DNA聚合酶一、E.coli

的DNA聚合酶系統(tǒng)polI

參與DNA修復(fù)，具3’→5’和5’→3’外切酶活性polII參與DNA修復(fù)，具3’→5’外切酶活性polIII參與DNA復(fù)制，具3’→5’和5’→3’外切酶活性1957年，美國(guó)的生物學(xué)家A.Kornberg首次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說(shuō)的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為109103dal。（一）DNA聚合酶I（PolI）1、E.coliPolI的特點(diǎn)（1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個(gè)大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性和聚合酶活性（大片段亦稱為Klenow片段）。（2）聚合酶活性5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響（3）DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：底物：四種脫氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；Mg2＋離子；帶有3’-OH游離基團(tuán)的引物鏈；DNA模板：?jiǎn)捂?，雙鏈（糖-磷酸主鍵上有一個(gè)或多個(gè)斷裂）。

5’→3’外切酶活性

DNA聚合酶Ｉ的3’→5’核酸外切酶活性能催化DNA鏈發(fā)生水解作用，從DNA鏈3’-OH末端開(kāi)始向5’方向水解DNA，并釋放出單核苷酸分子。對(duì)酶活的影響：反應(yīng)物中缺乏dNTPs時(shí)，大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的3’→5’核酸外切酶活性，將會(huì)發(fā)揮作用。但對(duì)于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時(shí)，這種降解活性將會(huì)被5’→3’的聚合酶活性所抑制。

2、DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途除去3’-端突起的單鏈DNA（在無(wú)dNTP時(shí)）補(bǔ)齊5’-突起端（常用Klenow大片段）合成第二條cDNA（常用Klenow大片段）切口移位制備探針（1）通過(guò)DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。DNA切口平移（nicktranslation）缺口雙鏈鏈的取代缺口轉(zhuǎn)移在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’→3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)外切酶活性從缺口的5’一側(cè)移去一個(gè)5’核苷酸之后，聚合酶作用就會(huì)在缺口的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但PolＩ不能在3’-OH和5’-P之間形成磷酸二酯鍵，隨著5’一側(cè)的核苷酸不斷移去，3’一側(cè)的核苷酸又按序列增補(bǔ)，缺口沿著DNA分子合成的方向移動(dòng)。DNA雜交探針的制備

典型的反應(yīng)體系：純化的特定DNA片斷，適量DNaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標(biāo)記的dNTPs。

DNaseＩ：造成DNA分子的斷裂或缺口；

PolＩ：進(jìn)行切口轉(zhuǎn)移，使反應(yīng)混合物中的32p標(biāo)記的核苷酸取代原有的未標(biāo)記的核苷酸，最終從頭到尾都被標(biāo)記。DnaseⅠ作用形成單鏈切口PolⅠ的5’→3’外切活力從5’切去核苷酸5’3’5’5’5’3’5’PolⅠ的5’→3’聚合酶活力在3’加上放射性標(biāo)記的核苷酸DnaseⅠ作用形成單鏈切口PolⅠ的5’→3’外切活力從5’切去核苷酸5’3’5’5’5’3’5’PolⅠ的5’→3’聚合酶活力在3’加上放射性標(biāo)記的核苷酸

dNTP對(duì)PolＩ酶活性的影響在低濃度dNTPs的條件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs濃度時(shí)，PolＩ則能夠更有效的合成DNA。低濃度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高濃度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs參入DNA鏈（DnaseＩ數(shù)量）。

（二）Klenow片段與DNA末端標(biāo)記Klenow片段由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來(lái)的分子量為76×103dal的大片斷分子。仍具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’的外切酶活性，失去了全酶的5’→3’外切酶活性。

Klenow片段的主要用途

1、修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’隱蔽末端；

2、標(biāo)記DNA片斷的末端；

3、cDNA克隆的第二鏈cDNA的合成；

4、DNA序列的測(cè)定。DNA片段末端標(biāo)記

具有3’隱蔽末端的帶標(biāo)記得的DNA片斷

5’GATCT…3’3’A…5’在反應(yīng)物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP，一道溫育后生成：

5’GATCT…3’3’*GA…5’或是同時(shí)加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’*AGA…5’DNA片斷末端標(biāo)記可以作為用凝膠電泳法測(cè)定分子大小的標(biāo)記樣品。因?yàn)楸粯?biāo)記的DNA片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無(wú)關(guān)。所以在限制酶消化過(guò)程產(chǎn)生的大小DNA片斷都得到了同等程度的標(biāo)記。不能有效的標(biāo)記帶有5’突出末端DNA分子。返回二、T4DNA聚合酶1、從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA聚合酶，具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,為PolI的兩倍3’→5’外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA，其切除速度分別為40和4000nt/min2、在沒(méi)有脫氧核苷三磷酸存在的情況下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的獨(dú)特功能。作用于雙鏈DNA片斷，并按3’→5’的方向從3’-OH末端開(kāi)始降解DNA。如果反應(yīng)物中存在一種dNTP時(shí)，它的水解作用進(jìn)行到暴露出同反應(yīng)物中唯一的dNTP互補(bǔ)的核苷酸時(shí)就會(huì)停止。

外切酶活性

聚合酶活性

無(wú)dNTPdNTP3、取代合成法標(biāo)記DNA片斷在反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)T4DNA聚合作用，反應(yīng)物中的α-32p-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片斷上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。3’外切酶活力可以切割dsDNA和ssDNA，dsDNA>ssDNA，要控制降解時(shí)間。對(duì)DNA分子3’端有控制的降解返回三、反轉(zhuǎn)錄酶1、來(lái)源許多RNA腫瘤病毒中分離到這種酶，最常用的是來(lái)源于鳥(niǎo)類骨髓母細(xì)胞瘤病毒的反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）2、特點(diǎn)AMV具有α鏈和β鏈α鏈具有聚合酶活性和RNaseH活性β鏈具有以RNA-DNA雜交分子為底物的5’→3’脫氧核酸外切酶活性聚合酶活性

RNaseH活性：從5’→3’或者3’→5’方向特異的降解RNA-DNA中的RNA鏈3、主要作用以mRNA為模板合成cDNA；用來(lái)對(duì)5’突出末端的DNA片斷作末端標(biāo)記。返回四、T7DNA聚合酶1978年，S.Tabor從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細(xì)胞中純化出來(lái)的一種核酸酶。加工形式的T7DNA聚合酶系：T7噬菌體編碼的基因5蛋白質(zhì)，另一種是大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白?；?蛋白質(zhì)：具有聚合酶活性和3’→5’外切酶活性；硫氧還蛋白：增強(qiáng)基因5蛋白質(zhì)與模板引物的結(jié)合力具有5’→3’的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3’→5’核酸外切酶活性。

T7DNA聚合酶的用途1、用于對(duì)大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，聚合能力較強(qiáng)可延伸合成數(shù)千個(gè)核苷酸）

2、通過(guò)延伸或取代合成法標(biāo)記DNA3’末端；

3、將雙鏈DNA的5’或3’突出末端轉(zhuǎn)變成平末端的結(jié)構(gòu)。修飾的T7DNA聚合酶對(duì)天然的T7DNA聚合酶進(jìn)行修飾，使之完全失去3’→5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。用途：

1、作為一種DNA序列分析的工具酶：加工性能高；無(wú)3’→5’外切酶活性；具有催化脫氧核糖類似物聚合的能力。

2、制備探針；可催化較低水平的dNTP（<0.1μmol/L）參入。

3、有效的填補(bǔ)和標(biāo)記具有5’突出末端的DNA片斷的3’-末端。聚合作用高；失去了3’→5’的外切酶活性。返回一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶二、T4多核苷酸激酶三、堿性磷酸酶第四節(jié)DNA及RNA的修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶與同聚物加尾1、特點(diǎn)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），從小牛胸腺中純化出來(lái)的一種小分子量的堿性蛋白質(zhì)，在二甲胂酸緩沖液中，能催化脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5’→3’方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3’-OH末端。不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段為引物，在3’-OH端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的單鏈DNA，也可以是具有3’-OH突出末端的雙鏈DNA，平末端不是有效底物，如果用Co代替Mg做為輔助因子，可以成為有效底物。利用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT)給載體和外源基因加上互補(bǔ)的同聚物尾巴2、用途催化[α-32P]-3’-脫氧核苷酸標(biāo)記DNA片斷的3’末端?？捎糜跍y(cè)序的終止，因?yàn)椴缓坞x的3’-OH末端。催化非放射性的標(biāo)記物摻入到DNA片斷的3’-末端：生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生物素蛋白結(jié)合物的接受位點(diǎn)。用于在平頭DNA上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。返回二、T4多核苷酸激酶與DNA分子5’末端標(biāo)記1、T4多核苷酸激酶：由T4噬菌體的pseT基因編碼的一種蛋白質(zhì)，最初從T4噬菌體感染的E.coli中分離出來(lái)。作用：催化γ-磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA或者RNA的末端，不受底物分子鏈的長(zhǎng)短限制。2、正向反應(yīng)（forwardreaction）堿性磷酸酶處理DNA的5’端使其脫磷酸暴露出5’-OH，多核苷酸激酶將γ-32P-ATP的γ-32P轉(zhuǎn)移到5’-OH，實(shí)現(xiàn)末端標(biāo)記。5’3’POH3’5’OHP堿性磷酸酶5’3’OHOH3’5’OHOH多核苷酸激酶5’3’32POH3’5’OH32Pγ-32P-ATP返回三、堿性磷酸酶與DNA脫磷酸作用來(lái)自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸基團(tuán)，使5’-P成為5’-OH，該過(guò)程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5’端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接（或環(huán)化）時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。BAP和CIP的區(qū)別：CIP優(yōu)點(diǎn)：在SDS中加熱到68℃可以完全失活，比活性比BAP高10～20倍BAP：熱抗性酶，終止作用需要酚/氯仿反復(fù)抽提返回核酸外切酶：一類可以從多核苷酸的一端開(kāi)始按序催化降解核苷酸的酶，可分為單鏈的核酸外切酶和雙鏈的核酸外切酶。第五節(jié)核酸外切酶ssDNAdsDNA大腸桿菌外切酶Ⅰ（exoⅠ）大腸桿菌外切酶Ⅲ（exoⅢ）大腸桿菌外切酶Ⅶ（exoⅦ）λ噬菌體核酸外切酶（λexo）T7噬菌體基因6核酸外切酶

1、一般特點(diǎn)：

來(lái)自于E.coli，分子量28,000kD

2、催化反應(yīng)類型（1）外切酶活性：3’→5’，產(chǎn)生5’-單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的ds-DNA，pH7.6-8.5（一）外切酶III（ExoIII）——dsDNA5'P5'P3'HO3'HOOH3'OH3'P5'P5'5'P3'HO3'HOP5'外切酶活性特點(diǎn)①反應(yīng)底物：互補(bǔ)ds-DNA②堿基釋放速度：C>>A～T>>G③反應(yīng)產(chǎn)物：5’-單磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，過(guò)渡反應(yīng)將導(dǎo)致DNA降解（2）核酸酶H活性：除去DNA-RNA雜交分子中的RNA分子，pH7.6-8.5（3）3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反應(yīng)，pH6.8-7.4（4）內(nèi)切酶活性：在無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶處將DNA鍵切開(kāi)，pH7.6-8.53'HOP5'P5'3'HORNaseH3、用途

（1）核酸（DNA）標(biāo)記配合使用klenow酶

ExoIII

ExoIII

[α-32P]

[α-32P]

dCTP

dCTP

5'PP5'5'PP5'3'HOOH3'3'HOOH3'ExoIII用于DNA標(biāo)記（2）基因突變----缺失（3）DNA序列測(cè)定時(shí)作順序缺失1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc

234abc

34abc

4abc

abcExoIII用于順序缺失ExoIII優(yōu)先降解3’端隱蔽的末端exoⅦ降解5’突出端SⅠ4、使用注意事項(xiàng)正式使用前，測(cè)定在一定條件下酶的反應(yīng)速度在一定條件下，ExoIII不能作用GC富集區(qū)（來(lái)自于cDNA加尾）（二）λ噬菌體核酸外切酶（λexo）

T7噬菌體基因6核酸外切酶——dsDNA1、λexo（1）來(lái)源：從感染了λ噬菌體的大腸桿菌中純化而來(lái)（2）特點(diǎn)：催化雙鏈DNA自5’-P末端進(jìn)行逐步的加工水解，釋放出5’單核苷酸，但不降解5’-OH5'P5'P3'HO3'HOOH3'OH3'P5'P5'