講生物技術(shù)公開課課件

1第12講生物技術(shù)

第一節(jié)生物技術(shù)概述第二節(jié)基因工程第三節(jié)其它生物技術(shù)發(fā)光樹2第一節(jié)生物技術(shù)概述生物技術(shù)將主導(dǎo)人類歷史的第三次技術(shù)革命第一次技術(shù)革命 工業(yè)革命 解放人的雙手第二次技術(shù)革命 信息技術(shù) 擴(kuò)展人的大腦第三次技術(shù)革命 生物技術(shù) 改造生命本身生物技術(shù)的發(fā)展為人類帶來(lái)了巨大的利益和財(cái)富，將是未來(lái)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的新動(dòng)力。3生物工程簡(jiǎn)史傳統(tǒng)發(fā)酵釀酒、制醬、制醋技術(shù)1860年，Pausteur單一霉菌純粹培養(yǎng)技術(shù)1878年，啤酒酵母單一培養(yǎng)技術(shù)1881年，細(xì)菌的純粹培養(yǎng)技術(shù)1929年，發(fā)現(xiàn)抗菌素“盤尼西林”1946年，用細(xì)菌生產(chǎn)出氨基酸1952年，用微生物轉(zhuǎn)化荷爾蒙獲得成功1953年，Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1956年，Kornberg發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶1966年，破譯了氨基酸三聯(lián)密碼子世界上第一個(gè)生物技術(shù)公司1976年4月7日，HerbBoyer和BobSwanson創(chuàng)建了Genentech公司，標(biāo)志著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的誕生。5生物技術(shù)應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)的原理，依靠微生物、動(dòng)物、植物體對(duì)物料進(jìn)行加工，以提供產(chǎn)品為社會(huì)服務(wù)的技術(shù)——1982年，國(guó)際合作與發(fā)展組織以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的——1986年，國(guó)家科委現(xiàn)代生物技術(shù)傳統(tǒng)生物技術(shù)：微生物發(fā)酵，一般可分為上游/中游/下游過(guò)程現(xiàn)代生物技術(shù)：以DNA重組為主要手段的基因工程為核心，也包括酶工程/細(xì)胞工程/發(fā)酵工程等；多學(xué)科交叉；廣泛使用計(jì)算機(jī)及各種高科技儀器設(shè)備；應(yīng)用領(lǐng)域廣泛9生物工程的內(nèi)容和特點(diǎn)生物工程的四大體系：基因工程細(xì)胞工程蛋白質(zhì)工程發(fā)酵工程生物工程的顯著特點(diǎn)：高技術(shù)（精細(xì)和密集的復(fù)雜技術(shù)）高投入（尤其是前期科研投入高）高利潤(rùn)10第二節(jié)基因工程基因工程就是將不同生物的外源DNA(基因）插入到載體分子上，形成“雜種”DNA分子，導(dǎo)入受體細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)，從而得到期望的由這個(gè)外源基因所編碼的蛋白質(zhì)。重組DNA技術(shù)，又稱為基因或分子克隆技術(shù)，是基因工程的核心技術(shù)。該技術(shù)包括了一系列的分子生物學(xué)操作步驟。112.1理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明導(dǎo)致了基因工程的誕生理論上的三大發(fā)現(xiàn)：DNA為遺傳物質(zhì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和DNA半保留復(fù)制機(jī)制遺傳密碼與中心法則技術(shù)上的三大發(fā)明：限制性內(nèi)切酶和連接酶載體逆轉(zhuǎn)錄酶1973年，完成了DNA的體外重組并成功轉(zhuǎn)化13限制性內(nèi)切酶——DNA的“手術(shù)刀”限制性內(nèi)切酶：生物工程中最重要的工具酶，主要從原核生物中提取；它能識(shí)別雙鏈DNA分子中的特異性核苷酸序列，使它在特定的位點(diǎn)水解。Arber、Smith和Nathans因?yàn)樵诎l(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面的開創(chuàng)性工作而共同獲得了1978年的諾貝爾獎(jiǎng)該種酶已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了200多種14EcoRI和T4連接酶EcoRI特異識(shí)別GAATTC粘性末端常見(jiàn)限制性內(nèi)切酶1517細(xì)菌質(zhì)粒pUC18多克隆位點(diǎn)182.2重組DNA的一般操作步驟1、獲得目的基因2、構(gòu)建重組DNA分子3、轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞4、篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子5、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得所需的遺傳性狀或產(chǎn)物19（1）獲得目的基因分離逆轉(zhuǎn)錄從生物基因組中分離基因組DNA酶切產(chǎn)物總RNAmRNAcDNA人工合成化學(xué)合成PCR21紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA溶液的純度和濃度22基因文庫(kù)的構(gòu)建23反轉(zhuǎn)錄人工合成cDNA25（2）構(gòu)建重組DNA分子外源DNA質(zhì)粒酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)酶切酶切混合DNA連接酶26（3）將重組DNA引入宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化：某一基因型細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收另一基因型細(xì)胞的DNA，而使其基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)染：除去蛋白質(zhì)外殼的病毒核酸感染細(xì)胞或原生質(zhì)體的過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：用噬菌體做載體，將一個(gè)細(xì)胞的基因傳遞給另一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程.

29農(nóng)桿菌介導(dǎo)30（4）對(duì)轉(zhuǎn)化子的篩選篩選：從大量攜帶重組體DNA的宿主細(xì)胞中分離出攜帶目的基因的細(xì)胞。篩選方法：遺傳學(xué)方法——對(duì)于帶有抗藥性基因的質(zhì)粒，可通過(guò)檢測(cè)受體菌是否由敏感狀態(tài)變成抗藥狀態(tài)進(jìn)行篩選.免疫學(xué)方法——用特異性抗體檢測(cè)基因產(chǎn)物從而篩選陽(yáng)性克隆的方法31Southern雜交——轉(zhuǎn)化子的分析32將老鼠的基因轉(zhuǎn)到大腸桿菌中抽取DNA切下鼠DNA切開質(zhì)粒DNA將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞混合、連接33將老鼠的基因轉(zhuǎn)到大腸桿菌中培養(yǎng)基中加抗生素培養(yǎng)裂解細(xì)胞釋放DNA分子雜交分離擴(kuò)增目的克隆342.3基因工程應(yīng)用基因工程在醫(yī)學(xué)上被用于大量生產(chǎn)過(guò)去難以得到或幾乎不可能得到的蛋白質(zhì)－肽類藥物。10g胰島素1000磅牛胰200升發(fā)酵液干擾素1200升人血1升發(fā)酵液2－3萬(wàn)美元/病人200－300美元/病人35基因工程技術(shù)提高奶酪產(chǎn)量哺乳小牛胃凝乳酶凝乳酶基因啤酒酵母轉(zhuǎn)入制造奶酪36轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因植物獲得新的性狀372002年全球轉(zhuǎn)基因作物種植情況38轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物首先在小鼠獲得成功。現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)已用于牛、羊，使得從牛/羊奶中可以生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物。稱為“乳腺反應(yīng)器”工程。例如：從轉(zhuǎn)基因羊的羊奶中提取出治療心臟病的藥物tPA蜘蛛山羊轉(zhuǎn)基因山羊能通過(guò)乳腺分泌產(chǎn)生有著超強(qiáng)抗張強(qiáng)度的蜘蛛絲，很多科學(xué)家把蜘蛛絲叫做“生物鋼”。3940環(huán)境工程菌美國(guó)GE公司構(gòu)造成功具有巨大烴類分解能力的工程菌，并獲專利，用于清除石油污染。研究人類遠(yuǎn)古的遺傳信息4142第三節(jié)其它生物技術(shù)3.1細(xì)胞工程：是指通過(guò)細(xì)胞水平上的篩選或改造，獲得有商業(yè)價(jià)值的細(xì)胞株或細(xì)胞系，再通過(guò)規(guī)模培養(yǎng)，獲得特殊商品的技術(shù)與過(guò)程?；驹恚簩⒁环N生物細(xì)胞中攜帶全套遺傳信息的基因組或染色體全部轉(zhuǎn)入另一種生物細(xì)胞，從而改變細(xì)胞的遺傳性，改造生物的性狀和功能。包括細(xì)胞融合、細(xì)胞器移植、染色體工程、細(xì)胞和組培技術(shù)等。43動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)44體細(xì)胞雜交/細(xì)胞融合技術(shù)體細(xì)胞雜交/細(xì)胞融合技術(shù)：通過(guò)生物學(xué)、化學(xué)或物理學(xué)的方法，使兩個(gè)不同種類的體細(xì)胞融合在一起，從而產(chǎn)生具有兩個(gè)親本遺傳性狀的新細(xì)胞。例如：童魚——世界上第一條沒(méi)有父母的魚，“鯽鯉核質(zhì)雜交魚”利用雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體克隆“多莉羊”——細(xì)胞融合技術(shù)的高峰473.2蛋白質(zhì)工程“后基因組時(shí)代”將是“蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代”，即從對(duì)基因信息的研究轉(zhuǎn)向?qū)Φ鞍踪|(zhì)信息的研究，包括研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用及蛋白質(zhì)相互關(guān)系和作用。蛋白質(zhì)工程就是在對(duì)蛋白質(zhì)的化學(xué)、晶體學(xué)、動(dòng)力學(xué)等結(jié)構(gòu)與功能認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，對(duì)蛋白質(zhì)人工改造與合成，最終獲得商業(yè)化的產(chǎn)品。48蛋白質(zhì)工程的一般過(guò)程從生物體中分離純化目的蛋白測(cè)定其氨基酸序列借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質(zhì)的二維重組和三維晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)各種處理?xiàng)l件，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，包括折疊與去折疊等對(duì)其活性與功能的影響設(shè)計(jì)編碼該蛋白的基因改造方案，如點(diǎn)突變分離、純化新蛋白，功能檢測(cè)后投入實(shí)際使用。酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)50通過(guò)點(diǎn)突變改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)復(fù)性將蛋白質(zhì)從結(jié)構(gòu)不規(guī)則、無(wú)活性的狀態(tài)，恢復(fù)到有唯一立體結(jié)構(gòu)、有生物活性的狀態(tài)的過(guò)程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)效率高、產(chǎn)量大周期短、成本低工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控缺點(diǎn)是易形成包含體。因無(wú)法有效的解決復(fù)性問(wèn)題，在美國(guó)每年造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)十億美元

原核與真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)比較原核細(xì)胞:發(fā)酵→包含體→復(fù)性→純化→目的蛋白真核細(xì)胞:發(fā)酵→上清液→純化→目的蛋白543.3發(fā)酵工程發(fā)酵工程是利用微生物的特性，通過(guò)現(xiàn)代工程技術(shù)，生產(chǎn)有用物質(zhì)或直接將其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的一門技術(shù)。發(fā)酵工程的基本步驟：包括菌種選育、菌種生產(chǎn)、代謝產(chǎn)物發(fā)酵和分離以及微生物機(jī)能的利用等。優(yōu)點(diǎn)：投資??；見(jiàn)效快；污染小發(fā)酵工程應(yīng)用廣泛：醫(yī)藥工業(yè)；食品工業(yè)；能源工業(yè)；飼料工業(yè)；冶金工業(yè)；農(nóng)業(yè)發(fā)酵工業(yè)回顧幾千年前，人類開始釀酒、制醬、制奶酪等1675年，列文虎克發(fā)明了顯微鏡，觀察到了微生物巴斯德證明酒精發(fā)酵是由于酵母菌引起的，發(fā)酵現(xiàn)象是由微生物所進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)柯赫建立了單種微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)，新的發(fā)酵產(chǎn)品不斷出現(xiàn)，以固態(tài)發(fā)酵和淺層液態(tài)發(fā)酵為主上世紀(jì)40年代，抗生素大規(guī)模深層發(fā)酵工藝建立隨著新型發(fā)酵設(shè)備、發(fā)酵工藝和育種技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代發(fā)酵工程達(dá)到了一個(gè)新的高度發(fā)酵工程的內(nèi)容發(fā)酵工程由三部分組成：上游工程、發(fā)酵工程和下游工程上游工程包括優(yōu)良菌種的選育、最適發(fā)酵條件（pH、溫度、溶氧和營(yíng)養(yǎng)組成）的確定、營(yíng)養(yǎng)物的準(zhǔn)備等發(fā)酵工程主要指在最適發(fā)酵條件下，在發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù)。要求嚴(yán)格的無(wú)菌生長(zhǎng)環(huán)境?？煞譃榉峙l(fā)酵，補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵下游工程指從發(fā)酵液中分離和純化產(chǎn)品的技術(shù)。包括固液分離技術(shù)，細(xì)胞破壁技術(shù)，蛋白質(zhì)純化技術(shù)，和產(chǎn)品的包裝處理技術(shù)。還要考慮發(fā)酵后的菌體與廢物處理問(wèn)題發(fā)酵工藝組成部分培養(yǎng)基制備↓種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐→產(chǎn)物的提取精制↑無(wú)菌空氣菌種選育發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)水平取決于三個(gè)要素：生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝和設(shè)備菌種選育的目的是為了改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的需要提高其生產(chǎn)能力能適應(yīng)特定的工藝條件，如能利用廉價(jià)的原料、耐受性好目前主要采用自然選育和誘變育種的方法，工作量大，有一定盲目性基因工程、細(xì)胞工程等育種方法具有定向性發(fā)酵的基本過(guò)程初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物的比較發(fā)酵生物反應(yīng)器發(fā)酵罐是最重要的微生物細(xì)胞反應(yīng)器染菌率低大型化，有利于提高經(jīng)濟(jì)效益過(guò)程優(yōu)化可提高產(chǎn)量和降低成本利于提高產(chǎn)品回收率和質(zhì)量生物反應(yīng)器的基本類型攪拌式生物反應(yīng)器（stirredtankreactor）鼓泡塔式反應(yīng)器（bubblecolumn）氣升式反應(yīng)器（airliftreactor）幾種常見(jiàn)的生物反應(yīng)器發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)物理參數(shù)溫度、壓力、流量、轉(zhuǎn)速、粘度、泡沫位等化學(xué)參數(shù)pH、溶氧、尾氣、發(fā)酵液成分、離子濃度等生物參數(shù)生物量、ATP、蛋白質(zhì)等在線與非在線測(cè)量間接測(cè)量65本講摘要以重組DNA操作為核心技術(shù)的