第十章DNA的生物合成

Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規(guī)律（即中心法則）.第一節(jié)中心法則現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四中心法則

Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規(guī)律1954年首次提出的“中心法則”1970-1980年的“中心法則”21世紀(jì)后修正的“中心法則”現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四第二節(jié)DNA的生物合成核酸是生命遺傳信息的攜帶者和傳遞者生物體內(nèi)的DNA合成主要包括三個(gè)方面：1.在細(xì)胞周期的S期進(jìn)行的DNA復(fù)制，親代細(xì)胞通過(guò)DNA自身復(fù)制將遺傳信息傳給子代；2.當(dāng)體內(nèi)DNA受到某些損傷時(shí)，可以進(jìn)行修復(fù)；3.在某些病毒中存在的以RNA為模板的DNA合成?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四一、參與DNA復(fù)制的酶及蛋白因子（一）DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol）以dNTP為底物，以DNA為模板，需要一段引物，從引物的3-OH末端合成DNA新鏈。三種大腸桿菌DNA聚合酶1.DNA聚合酶I(1956,ArthurKornberg)外切酶活性：3′5′外切活性具有校正作用；5′3′切除引物和DNA損傷的修復(fù)；聚合作用：合成速度較慢，每秒10個(gè)核苷酸，而且新鏈長(zhǎng)20個(gè)核苷酸后，酶即脫離模板?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四2.DNA聚合酶Ⅱ

外切酶活性：3′5′外切活性

聚合作用：

5′3′補(bǔ)小缺口（<100核苷酸）3.DNA聚合酶III大分子寡聚酶，10種22個(gè)亞基組成。每種亞基都有2個(gè)，整個(gè)分子形成一個(gè)不對(duì)稱(chēng)的二聚體現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四DNA聚合酶Ⅰ多功能酶

5’3’外切酶

3’5’外切酶5’3’聚合酶單鏈多肽（Zn2+）大小二個(gè)片段切除RNA引物，填補(bǔ)空缺損傷后修復(fù)DNA聚合酶Ⅲ多功能酶

5’3’聚合酶3’5’外切酶

不對(duì)稱(chēng)二聚體單體1-前導(dǎo)鏈/單體2-隨從鏈DNA復(fù)制的主要酶高續(xù)進(jìn)性

高聚合酶活性高產(chǎn)物真實(shí)性現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四真核細(xì)胞DNA聚合酶

哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)5種DNApolα、β、γ、δ、εpolα和δ——新鏈的延長(zhǎng)Polβ——DNA的重組修復(fù)polγ——線粒體的復(fù)制，還具3’5’外切活性Polε——聚合作用和3’5’外切活性現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四（二）DNA連接酶（DNAligase)DNA雙螺旋中一條鏈有缺口，并且3’-OH與5’-P相鄰特異性不高，在DNA不連續(xù)復(fù)制、重組及損傷修復(fù)中起作用哺乳動(dòng)物：ATP輔酶，大腸桿菌：NAD輔酶，都需要Mg2+連接方式：酶先與ATP或NAD形成酶—AMP，酶—AMP與5’-P形成焦磷酸而活化

現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四（三）與解除DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)的酶與蛋白因子1.拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)湫再|(zhì)—物體或圖像做彈性移動(dòng)時(shí)保持物體圖像不變的性質(zhì)。DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)具有拓?fù)湫再|(zhì)。Ⅰ型酶：使一定部位的一條鏈切口-封口反應(yīng)Ⅱ型酶：DNA兩條鏈同時(shí)發(fā)生切口-封口反應(yīng)

Ⅱ型酶還可使DNA形成超螺旋解除超螺旋現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四（三）與解除DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)的酶與蛋白因子2.解螺旋酶依賴DNA單鏈存在，對(duì)單鏈親和力強(qiáng)大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)多種與解除螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)的蛋白質(zhì)DnaA,DnaB,DnaC協(xié)同作用，解開(kāi)DNA。

現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四（三）與解除DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)的酶與蛋白因子3.單鏈結(jié)合蛋白（SSB）—與解開(kāi)的DNA單鏈結(jié)合后，兩條DNA鏈就不能形成雙螺旋；—還可以防止核酸酶的降解；—原核生物中SSB與DNA單鏈結(jié)合表現(xiàn)正協(xié)同效應(yīng)?，F(xiàn)在是11頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四（三）與解除DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)的酶與蛋白因子4.引發(fā)酶（primase）多數(shù)以RNA片段為引物，也存在DNA片段引物、tRNA引物——促進(jìn)引物合成的酶稱(chēng)為引發(fā)酶現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四（三）RNA引物

DNA聚合酶不能催化兩個(gè)游離dNTP在DNA模板上聚合需要具3’-OH的引物RNA聚合酶能催化兩個(gè)游離NTP在DNA模板上聚合提供3’-OH引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去、補(bǔ)滿，再由連接酶連接減少突變，提高DNA復(fù)制的真實(shí)性現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四二、DNA的復(fù)制1、半保留復(fù)制方式現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四OldstrandNewstrandThehypothesisofsemiconservativereplicationproposedbyWatsonandCrickin1953.現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四親代DNA子代子代半保留復(fù)制新鏈現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四Radioisotopelabelinganddensitygradientcentrifugationclearlydistinguishesreplicationsofsemiconservativefromconservative.（1958）現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四通過(guò)DNA復(fù)制形成的新DNA分子,與原來(lái)的DNA分子完全相同。經(jīng)過(guò)一個(gè)復(fù)制周期后，子代DNA分子的兩條鏈中，一條來(lái)自親代DNA分子，另一條是新合成的，所以又稱(chēng)為半保留復(fù)制?，F(xiàn)在是21頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四2.DNA半不連續(xù)復(fù)制至今發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶只能催化從模板的3′端向5′端前進(jìn)的反應(yīng)。岡崎（1968）等人的實(shí)驗(yàn)：用噬菌體T4感染的大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)材料，以3H標(biāo)記的胸苷合成DNA.短時(shí)間內(nèi)測(cè)定同位素的摻入情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：短時(shí)間（2S）標(biāo)記出現(xiàn)在分子質(zhì)量較小的片段，只有在標(biāo)記時(shí)間長(zhǎng)（30S以上）才出現(xiàn)在分子質(zhì)量較大的片段。岡崎片段——DNA合成是不連續(xù)的，先合成一些DNA小片段，其大小約含1000-2000個(gè)核苷酸殘基，然后再通過(guò)DNA連接酶將它連接起來(lái)。現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四二、DNA的復(fù)制3、DNA的復(fù)制過(guò)程（1）合成起始a.辨認(rèn)起始點(diǎn)DNA復(fù)制有固定的起始點(diǎn)。大腸桿菌：OriC含245bp,有兩個(gè)區(qū)域起關(guān)鍵作用，4個(gè)9核苷酸重復(fù)序列；3個(gè)13核苷酸重復(fù)序列（富含AT）?，F(xiàn)在是24頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四二、DNA的復(fù)制b.模板DNA解除高級(jí)結(jié)構(gòu)dnaA蛋白與起始點(diǎn)形成復(fù)合物，促進(jìn)其他dna蛋白也與起始點(diǎn)形成復(fù)合物。一旦雙螺旋解開(kāi)成單鏈，SSB即結(jié)合單鏈。TopoⅡ在打結(jié)處切一口，使結(jié)松開(kāi)?，F(xiàn)在是25頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四二、DNA的復(fù)制c.RNA引物的形成由引發(fā)酶以單鏈DNA為模板，按5’3’合成一低聚引物，引物的第一個(gè)核苷酸通常是pppA(2)鏈的延伸在RNA引物上，由DNA聚合酶Ⅲ催化，在引物3’-OH每摻入一個(gè)核苷酸，從底物dNTP切下一個(gè)焦磷酸。新鏈的合成按5’到3’的方向進(jìn)行，這條鏈稱(chēng)先導(dǎo)鏈；另一條先形成岡崎片段，進(jìn)行不連續(xù)復(fù)制，稱(chēng)后隨鏈?，F(xiàn)在是26頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四二、DNA的復(fù)制

(3)合成終止

線性DNA——當(dāng)復(fù)制叉到分子末端，復(fù)制即終止。

環(huán)狀DNA——多數(shù)為定點(diǎn)、雙向、對(duì)稱(chēng)、等速的方式進(jìn)行復(fù)制，復(fù)制終點(diǎn)一般距離起點(diǎn)1800，兩個(gè)復(fù)制叉在此相遇，合成終止。現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四AelectronmicrographofthereplicationintermediateofaplasmidDNA:-shapedstructureswereobserved;nosinglestrandedDNAisvisible.Nocompleteunwindingofthetwoparentalstrandsoccurredbeforethedaughterstrandsaresynthesized現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四1.DNA的損傷與突變

損傷可造成突變或致死突變（mutation）：指一種遺傳狀態(tài)，可以通過(guò)復(fù)制而遺傳的DNA結(jié)構(gòu)的任何永久性改變。攜帶突變基因的生物稱(chēng)為突變體，未突變的稱(chēng)為野生型。損傷原因物理（紫外（見(jiàn)下頁(yè)）、高能射線、電離輻射）化學(xué)（烷基化試劑、亞硝酸鹽、堿基類(lèi)似物）生物因素（堿基對(duì)置換、堿基的插入/缺失造成移碼）三、DNA的損傷與修復(fù)現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四當(dāng)DNA受到大劑量紫外線（波長(zhǎng)260nm附近）照射時(shí)，可引起DNA鏈上相鄰的兩個(gè)嘧啶堿基共價(jià)聚合，形成二聚體，例如TT二聚體?，F(xiàn)在是31頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四2.DNA損傷修復(fù)光復(fù)活切除修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四光復(fù)活（photoreactivation）可見(jiàn)光（最有效波長(zhǎng)400nm）激活生物界廣泛分布（高等哺乳動(dòng)物除外）的光復(fù)活酶，該酶分解嘧啶二聚體。是一種高度專(zhuān)一的修復(fù)形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚體?，F(xiàn)在是33頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四切除修復(fù)（excisionrepair）即在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷的部分切除掉，并以完整的那一段為模板，合成出切去的部分，從而使DNA恢復(fù)正常。這是一種比較普遍的修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞的修復(fù)功能對(duì)于保護(hù)遺傳物質(zhì)DNA不受破壞有重要意義。現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四重組修復(fù)（recombinationrepair）又稱(chēng)復(fù)制后修復(fù)（postreplicationrepair）受損傷的DNA在進(jìn)行復(fù)制時(shí)，跳過(guò)損傷部位，在子代DNA鏈與損傷相對(duì)應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。通過(guò)分子間重組，從完整的母鏈上將相應(yīng)的堿基順序片段移至子鏈的缺口處，然后再用合成的多核苷酸來(lái)補(bǔ)上母鏈的空缺，此過(guò)程即重復(fù)修復(fù)。并非完全校正?，F(xiàn)在是35頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四SOS修復(fù)指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時(shí)所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯(cuò)誤較多，又稱(chēng)傾錯(cuò)性修復(fù)（Error-ProneRepair）?，F(xiàn)在是36頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四第二節(jié)RNA的生物合成現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四中心法則生物的遺傳信息從DNA傳遞給mRNA的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄。根據(jù)mRNA鏈上的遺傳信息合成蛋白質(zhì)的過(guò)程，被稱(chēng)為翻譯和表達(dá)。1958年Crick將生物遺傳信息的這種傳遞方式稱(chēng)為中心法則。現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四基因轉(zhuǎn)錄是以DNA為模板合成與其堿基順序互補(bǔ)的mRNA的過(guò)程。DNA雙螺旋解開(kāi)成為轉(zhuǎn)錄模板，在RNA聚合酶催化下，合成mRNA。DNA雙鏈中的一條鏈作為模板合成mRNA，而另一條鏈不用于合成mRNA——不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四轉(zhuǎn)錄(transcription)：以DNA單鏈為模板，NTP為原料，在DNA依賴的RNA聚合酶催化下合成RNA鏈的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄的條件：模板原料酶產(chǎn)物配對(duì)方向引物DNA(不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄）NTPRNA聚合酶mRNA,tRNA,rRNA，小RNAA-U,T-A,G-C5’3’不需要現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的比較相同點(diǎn)模板兩股鏈均復(fù)制模板鏈轉(zhuǎn)錄合成方式半保留復(fù)制不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄原料dNTPNTP聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶堿基配對(duì)A-T，G-CA-U，T-A，G-C產(chǎn)物半保留的雙鏈DNA單鏈RNA不同點(diǎn)以DNA為模板遵循堿基配對(duì)原則都需依賴DNA的聚合酶聚合過(guò)程都是生成磷酸二酯鍵新鏈合成方向?yàn)?’→3’3/50復(fù)制轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四◆幾個(gè)基本概念結(jié)構(gòu)基因(structuregene)模板鏈(templatestrand)Watson(W)鏈、負(fù)(-)鏈(minusstrand)、反意義鏈(antisensestrand)編碼鏈(codingstrand)Crick(C)鏈、正(+)鏈(plusstrand)、有意義鏈(sensestrand)不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四結(jié)構(gòu)基因(structuregene)：DNA分子中能轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段?，F(xiàn)在是44頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四模板鏈：

反意義鏈（antisensestrand，(-)鏈）

——以該鏈中的DNA堿基順序指導(dǎo)RNA的合成即被轉(zhuǎn)錄的那條DNA鏈。

編碼鏈：有意義鏈（sensestrand，（+）鏈）

——不被轉(zhuǎn)錄的那條DNA鏈，但其堿基順序除T代替U外，其余與mRNA相同。

現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四5’-----GCAGTACATGTC-----3’編碼鏈DNA3’-----CGTCATGTACAG-----5’模板鏈5’-----GCAGUACAUGUC-----3’mRNAN------Ala--Val--His--Val------C蛋白質(zhì)現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄

.DNA雙鏈上，僅一股鏈轉(zhuǎn)錄，另一股不轉(zhuǎn)錄。

.有意義鏈與反意義鏈并非固定不變。

.轉(zhuǎn)錄方向都是5’3’轉(zhuǎn)錄方向5’3’模板鏈圖13-1現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四一、催化RNA合成的酶1.大腸桿菌RNA聚合酶全酶=α2ββ’

σ核心酶=α2ββ’σ—識(shí)別DNA鏈上合成RNA的起始信號(hào)，開(kāi)始合成RNA鏈時(shí)，必須有σ因子，一旦合成開(kāi)始以后，σ因子釋放出來(lái)。β’—參與酶與底物的結(jié)合，以及與σ因子和核心酶的結(jié)合。β—參與σ因子和核心酶的結(jié)合，并參與RNA合成的引發(fā)、延伸。α—與模板的結(jié)合、酶的滑動(dòng)以及堿基識(shí)別有關(guān)?，F(xiàn)在是48頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四2.真核細(xì)胞RNA聚合酶在DEAE-Sephadex柱上的洗脫次序稱(chēng)為酶Ⅰ、II、Ⅲ，基于對(duì)鵝膏覃堿的敏感程度稱(chēng)為酶A、B、C

現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四二、轉(zhuǎn)錄的過(guò)程現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四識(shí)別解鏈起始延伸終止現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四原核生物的轉(zhuǎn)錄起始1.起始位點(diǎn)的識(shí)別

σ識(shí)別正確的啟動(dòng)位點(diǎn)，啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)至少由三部分組成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶識(shí)別的信號(hào)；-10序列是酶的緊密結(jié)合位點(diǎn)（富含AT堿基，利于雙鏈打開(kāi)）；第三部分是RNA合成的起始點(diǎn)。3’5’+1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)AACTGTATATTATTGACATATAAT5’3’－35序列

Sextama框－10序列Pribnow框2.轉(zhuǎn)錄起始加入的第一個(gè)核苷三磷酸常是GTP或ATP。所形成的啟動(dòng)子、全酶和核苷三磷酸復(fù)合物稱(chēng)為三元起始復(fù)合物，第一個(gè)核苷三磷酸一旦摻入到轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，σ亞基就會(huì)被釋放脫離核心酶。現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板鏈E3.鏈的延伸

以NTP為原料和能量,DNA模板鏈為模板，靠核心酶的催化，核苷酸間通過(guò)3′,5′-磷酸二酯鍵成核糖核酸鏈(RNA)現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四4.轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)有兩種情況弱終止子：依賴ρ因子（終止因子，terminators）的終止NusA蛋白識(shí)別DNA鏈上的終止信號(hào)，在ρ因子幫助終止。

強(qiáng)終止子：（1）在終止點(diǎn)之前具有一段富含G-C的回文區(qū)域。（2）富含G-C的區(qū)域之后是一連串的dA堿基序列，它們轉(zhuǎn)錄的RNA鏈的末端為一連串U（連續(xù)6個(gè)）?，F(xiàn)在是54頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四真核生物的起始——較原核生物復(fù)雜

◆順式作用元件

(啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)

◆轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)

RNA聚合酶Ⅱ所需的轉(zhuǎn)錄因子

---轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ（TFⅡ）

現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四啟動(dòng)子

上游啟動(dòng)子元件(upstreampromotorelements,UPE)增強(qiáng)子：遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（1~30kb）增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性DNA序列作用與方向、距離無(wú)關(guān)沉默子：負(fù)性調(diào)節(jié)元件，起阻遏作用

與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的DNA非編碼序列——順式作用元件(cis-actingelement)現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四順式作用元件現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四增強(qiáng)子現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四反式作用因子(trans-actingfactor)概念：為DNA結(jié)合蛋白，可使鄰近基因開(kāi)放（正調(diào)控）或關(guān)閉（負(fù)調(diào)控）特點(diǎn)：三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：DNA識(shí)別結(jié)合域轉(zhuǎn)錄活性域