菌種選育3課件

第二章菌種的選育、保藏與復(fù)壯

第一節(jié)、微生物工業(yè)用菌種

第二節(jié)、菌種的來源第三節(jié)、菌種的選育第四節(jié)、菌種保藏第五節(jié)、菌種的提純與復(fù)壯第一節(jié)、微生物工業(yè)用菌種一、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求微生物資源豐富，廣布于土壤、水和空氣等自然界中，其中土壤中最多。

發(fā)展趨勢(shì)：從野生型變異株自然選育代謝控制育種誘變育種基因工程定向育種（1）所需培養(yǎng)基易得，價(jià)格低廉；（2）培養(yǎng)和發(fā)酵條件溫和（糖濃度、溫度、pH、溶解氧、滲透壓等）（3）生長(zhǎng)速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期短（4）單產(chǎn)高（選擇野生型、營(yíng)養(yǎng)缺陷型或調(diào)節(jié)突變株）微生物工業(yè)對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)用菌的要求原則：二、工業(yè)上常用的微生物微生物在工業(yè)上的用途很廣，包括化工、醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)、國(guó)防、紡織、石油勘探及石油化工等方面。微生物的代謝產(chǎn)物多，已超過1300多種，而用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的不足100多種；微生物酶有近千種，而工業(yè)上用的不過40－50種。微生物具有巨大的潛力可挖掘。工業(yè)上常用菌種舉例：1、常用的細(xì)菌大腸桿菌應(yīng)用：生產(chǎn)天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸。

乳酸桿菌應(yīng)用：乳酸、干酪、奶子酒、發(fā)面、泡菜、酸奶等的制作2、酵母菌種類：酒精酵母、啤酒酵母、假絲酵母紅酵母、面包酵母。應(yīng)用：生產(chǎn)酒精、啤酒、石油發(fā)酵脫蠟和制取蛋白質(zhì)、生產(chǎn)脂肪。啤酒酵母紅酵母面包酵母應(yīng)用：醬油、醬類（淀粉酶）應(yīng)用：生產(chǎn)甲義丁二酸米曲霉應(yīng)用：產(chǎn)糖化酶和蛋白酶、主要用于釀酒制曲和醬油制曲

毛霉應(yīng)用：可以產(chǎn)生蛋白酶，我國(guó)多用于豆腐乳、豆豉等的制作青霉菌4、放線菌種類：龜裂鏈霉菌、金霉素鏈霉菌、灰色鏈霉菌、紅霉素鏈霉菌應(yīng)用：各類抗生素。土霉素、四環(huán)素、鏈霉素、紅霉素

其他生物：

A:擔(dān)子菌：所謂的擔(dān)子菌就是人們通常所說的菇類生物。擔(dān)子菌資源的利用正愈來愈引起人們的重視，如多糖、抗癌藥物的開發(fā)。近幾年來，日本、美國(guó)的一些科學(xué)家對(duì)香菇的抗癌作用進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)香菇中的“1，2-β-葡萄糖苷酶”及兩種糖類物質(zhì)具有抗癌作用。

B：病毒(virus)其特點(diǎn)如下：1.形體微小，體積比細(xì)菌小的多。2.沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。3.營(yíng)寄生生活不能脫離寄主而自行生長(zhǎng)繁殖，有專一性。

人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）獲得性免疫缺陷綜合癥（acquiredimmunodeficiencysyndrome

AIDS）

噬菌體（phage）是病毒的一種。噬菌體在寄主細(xì)胞中的生長(zhǎng)繁殖過程可分為吸附、浸入、增殖、成熟和釋放。

藻類工廠第二節(jié)菌種的來源一、微生物選擇性分離方法含微生物材料的選擇材料的預(yù)處理所需菌種的分離菌種的培養(yǎng)菌種的選擇和純化收集在腐爛的稻草和其它植物材料中的嗜熱放線菌孢子可在空氣攪動(dòng)下進(jìn)行，并可用簡(jiǎn)單的沉淀室收集孢子。然后，用取樣器將空氣撞擊在培養(yǎng)基的平板上，這樣可以減少分離平板中的細(xì)菌數(shù)目。在分離前添加一些固體基質(zhì)(如把幾種基質(zhì)加在土壤中)或?yàn)⑿┛扇苄责B(yǎng)分來強(qiáng)化培養(yǎng)基。所謂誘餌技術(shù)是將固體基質(zhì)加到待檢的土壤或水中，待其菌落長(zhǎng)成后再鋪平板。有人曾廣泛使用石臘棒技術(shù)來分離諾卡氏菌，從土壤中分離耐酸放線菌。近來,用花粉誘餌從土壤中分離出13株小瓶菌，其中有些新種或亞種。3、所需菌種的分離分離效率取決于培養(yǎng)基的養(yǎng)分、pH、加入的選擇性抑制劑。廣泛應(yīng)用的三種培養(yǎng)基即幾丁質(zhì)瓊脂、淀粉一酪素培養(yǎng)基和M3培養(yǎng)基。因大多數(shù)放線菌都是嗜中性的，分離培養(yǎng)基的pH常在6.7-7.5之間。如要分離嗜酸放線菌，pH宜降低到4.5-5.0。有人從堿性的加拿大土壤中分離出嗜堿鏈霉菌，它不能生長(zhǎng)在低于pH6.1-6.8的條件下，估計(jì)嗜堿性放線菌也可能存在于其它堿性環(huán)境中。在分離培養(yǎng)基中廣泛采用加入抗生素的方法，來增加選擇性。4、菌種的培養(yǎng)放線菌：25-30℃。多數(shù)放線菌是好氣的，因此必須保證足夠的通氣量；多數(shù)放線菌的最適生長(zhǎng)溫度為23-37℃，高溫放線菌的生長(zhǎng)溫度范圍在50-65℃。嗜熱菌：45-55℃。它能夠產(chǎn)生耐熱性蛋白質(zhì)，在高溫條件下，普通生物的蛋白質(zhì)就會(huì)失活、變性，但是嗜熱菌蛋白質(zhì)不會(huì)變性，生命活動(dòng)也不會(huì)終止。嗜冷菌：4-10℃。嗜冷菌是指那些能在低于7℃時(shí)可以生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌，例如假單胞菌黃桿菌、產(chǎn)堿桿菌和色桿菌屬等。

5、菌落的選擇鋪菌法于分離平板上鋪上一層單一的試驗(yàn)菌的辦法用來測(cè)定各個(gè)菌落的抗生素生產(chǎn)能力。復(fù)印平板法將菌落復(fù)印在平板上的辦法來研究它們對(duì)一系列試驗(yàn)菌的作用。

這兩種方法都有缺點(diǎn)。鋪菌法會(huì)使所需要的菌落污染，并且只能在每個(gè)平板上鋪上一種試驗(yàn)菌。菌落復(fù)印平板法對(duì)不長(zhǎng)孢子的鏈霉菌則不能使用，也不適用于游動(dòng)細(xì)菌的篩選。二、重要工業(yè)微生物的分離方法施加選擇壓力的分離方法：

1、富集液體培養(yǎng)：指能增加混合菌群中所需菌株的數(shù)量的一種技術(shù)。

要領(lǐng)：給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長(zhǎng)或不利于其他菌群生長(zhǎng)的條件。

e.g.

供給特殊的基質(zhì)或加入某些抑制劑。

注意：所需類型的菌株生長(zhǎng)的結(jié)果，有時(shí)會(huì)改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，從而改變選擇壓力，使其他微生物生長(zhǎng)。解決辦法：把富集培養(yǎng)物接種到新鮮的同一種培養(yǎng)基中可以重新建立選擇壓力，重復(fù)移植幾次后，將富集培養(yǎng)物再接到固體培養(yǎng)基上。

２、固體培養(yǎng)基培養(yǎng)：

常用于分離某些酶產(chǎn)生菌，其選擇培養(yǎng)基中常含有所需酶的基質(zhì)，以便促進(jìn)酶產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)。e.g.堿性蛋白酶的分離用不同pH的土壤作為原始種子。土壤必須經(jīng)過巴氏滅菌消毒，以減少不產(chǎn)孢子的微生物，然后鋪在pH為9~10的瓊脂培養(yǎng)基（含有均勻的不溶性蛋白質(zhì)）表面。堿性蛋白酶的產(chǎn)生菌能消化平板的不溶性蛋白，產(chǎn)生一清晰圈。隨機(jī)分離方法：1、制備一系列含有各種類型營(yíng)養(yǎng)成分（生長(zhǎng)限制因素）培養(yǎng)基；2、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代謝物阻遏）；3、加入緩沖液以減少pH的變化；4、確定含有所需的輔助因子Co2+,Mn2+,Mg2+,Fe2+等。

抗生素生產(chǎn)菌的篩選：

把潛在的產(chǎn)生菌生長(zhǎng)在含有試驗(yàn)菌的平板上，可以鑒定產(chǎn)生菌的抗微生物作用。也可以將微生物分離株生長(zhǎng)在液體培養(yǎng)基中，檢測(cè)其無細(xì)胞濾液的抗菌活性。

藥理活性化合物生產(chǎn)菌的篩選：一種化合物如果能在體外抑制某種關(guān)鍵的人體酶，它就可能在體內(nèi)具有藥理作用。若將體外篩選出的活性化合物，再用動(dòng)物作試驗(yàn)，可篩選出新的藥理活性化合物生產(chǎn)菌。生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的篩選：通過觀察分離菌能否促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）的生長(zhǎng)，便可檢出生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌。多糖生產(chǎn)菌的篩選：從制糖工業(yè)的廢水中可獲得分離株，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長(zhǎng)，可從菌落的粘液狀外觀識(shí)別這類產(chǎn)生菌。第三節(jié)、菌種的選育一、自然選育1、采樣采樣對(duì)象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對(duì)象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。2、增殖培養(yǎng)方法：控制培養(yǎng)基成分控制培養(yǎng)條件抑制不需要的菌類3、純種分離劃線法：簡(jiǎn)單、快捷。稀釋法：菌落單一均勻。接種針先以火焰滅菌法滅菌

步驟一固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法介紹如下：輕觸營(yíng)養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻

步驟二以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。

步驟三更換一個(gè)新的無菌營(yíng)養(yǎng)平板

步驟四將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營(yíng)養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)。步驟五重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。步驟六由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。步驟七重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。

步驟八重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的營(yíng)養(yǎng)平板，如右上圖。步驟九在營(yíng)養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽，標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。步驟十需要使用的儀器——震蕩機(jī)

固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液吸取充分均勻后的菌液

取含有9mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。將菌液置入，此時(shí)試管須做記號(hào)為第一次稀釋。將試管于震蕩機(jī)上，使菌液混合均勻取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL，加入另一個(gè)新的含9mL無菌水的試管中。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。

從最后稀釋菌液中吸取0.1mL菌液，置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。將三角玻璃棒浸于酒精中

將三角玻璃棒在火焰上燃燒（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒）

使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。

4、生產(chǎn)性能的測(cè)定一般采用兩步法：初篩：以量為主復(fù)篩：以質(zhì)為主二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)。誘變劑物理：紫外線，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍生物：噬菌體誘變育種的主要環(huán)節(jié)（1）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液——誘變（2）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株，選出性能優(yōu)良的正變異株——篩選

按照生產(chǎn)的要求，根據(jù)生物的遺傳和變異的理論，用人工的方法造成菌種變異，再經(jīng)過篩選、而達(dá)到菌種誘變選育的目的。誘變?cè)恚赫T變育種一般采用物理、化學(xué)誘變劑使微生物DNA的堿基排列發(fā)生變化，以使排列錯(cuò)誤的DNA模板形成異常的遺轉(zhuǎn)信息，造成某些蛋白結(jié)構(gòu)變異，而使細(xì)胞功能發(fā)生改變。

原種（出發(fā)菌株）純化斜面培養(yǎng)完全培養(yǎng)基同步培養(yǎng)離心洗滌玻璃珠震蕩分散過濾單細(xì)胞或孢子懸浮液

活菌計(jì)數(shù)誘變處理誘變處理預(yù)備實(shí)驗(yàn)

處理液活菌計(jì)數(shù)平板分離

形態(tài)變異并計(jì)算其變異率斜面培養(yǎng)

初篩、復(fù)篩

自然分離和再?gòu)?fù)篩

保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)誘變育種出發(fā)菌株的選擇誘變劑的選擇誘變操作（包括誘變劑量的選擇）突變株的篩選突變高產(chǎn)菌的表現(xiàn)及篩選條件的配合形態(tài)突變高產(chǎn)突變耐藥性突變營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變結(jié)構(gòu)類似物抗性突變形態(tài)突變型：指發(fā)生細(xì)胞形態(tài)變化或菌落形態(tài)變化的突變型。

生化突變型：沒有形態(tài)效應(yīng)的突變型，如營(yíng)養(yǎng)缺陷型。致死突變型：生活力下降的突變型。條件致死突變型：在某些條件下能成活，在另一些條件下是致死的突變型。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株：由于代謝障礙而成為必須添加某種物質(zhì)才能生長(zhǎng)的突變株。溫度敏感性突變株：可在某一溫度下生長(zhǎng)而在另一溫度下不能生長(zhǎng)的突變型。出發(fā)菌株選擇應(yīng)考慮的問題出發(fā)菌株的穩(wěn)定性選用具備優(yōu)良特性的菌株挑選對(duì)誘變劑敏感的菌株注意菌株的生理狀態(tài)及生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間

出發(fā)菌株

野生菌株自發(fā)突變后獲得的高產(chǎn)菌株已經(jīng)誘變過的菌株考慮試驗(yàn)菌株的遺傳背景：各種誘變劑有不同的作用機(jī)制，一種誘變劑的作用常主要集中在DNA的某些特異部位上，多次反復(fù)用一種誘變因子易出現(xiàn)“飽和”或恢復(fù)突變現(xiàn)象，因此誘變時(shí)常采用多種不同的誘變因子或復(fù)合誘變因子。誘變劑的選擇菌懸液的制備

單細(xì)胞懸浮液：106個(gè)/mL孢子懸浮液：108個(gè)/mL誘變：預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適宜的誘變條件篩選：選擇合適的篩選方法紫外線的誘變育種

紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長(zhǎng)為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。

被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為106個(gè)／ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為106～107個(gè)／ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。

三、雜交育種

兩個(gè)不同基因型的菌株通過結(jié)合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再?gòu)闹蟹蛛x和篩選出具有新性狀的菌株。

雜交可以使雙親的基因重新組合，形成各種不同的類型；基因重組可以將雙親控制不同性狀的優(yōu)良基因結(jié)合于一體，或?qū)㈦p親中控制同一性狀的不同微效基因積累起來，產(chǎn)生在各該性狀上超過親本的類型。

1、細(xì)菌的雜交

細(xì)菌的雜交行為是于1946年首次在大腸桿菌K-12菌株中發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的。首先在大腸桿菌K-12菌株中誘發(fā)一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型(A-)、不能發(fā)酵乳糖(Lac-)和抗鏈霉素(SMr)以及對(duì)噬菌體T

l敏感的突變體，可以寫成A-B+Lac-SMrTs1；另一菌株誘發(fā)成一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型(B-)，能發(fā)酵乳糖(Lac+)，對(duì)鏈霉菌敏感(SMs)和抗噬菌體T

l的突變體A+B-Lac+SM

sTr1。這兩個(gè)菌株各自都不能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，如果把大約105

/ml濃度的上述兩種菌株混合在一起，并接種在基本培養(yǎng)基上，則能長(zhǎng)出少數(shù)菌落；如果把上述兩種菌株分別接種到一個(gè)特制的U型管的兩端去培養(yǎng),中間用一片可以使培養(yǎng)液流通,但不能使細(xì)菌通過的燒結(jié)玻璃隔開,那么在基本培養(yǎng)基上就不會(huì)出現(xiàn)菌落。

這說明細(xì)胞的接觸是導(dǎo)致基因重組的必要條件，即細(xì)菌通過接合完成了雜交行為。在鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、肺炎克氏桿菌、霍亂弧菌等許多細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了接合現(xiàn)象，但是至今未在革蘭氏陽(yáng)性菌中發(fā)現(xiàn)接合現(xiàn)象。2、放線菌的雜交育種

放線菌的基因重組于1955年至1957年首先在天藍(lán)鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)，以后在其它科、屬、種中相繼發(fā)現(xiàn)。現(xiàn)在常用的放線菌雜交方法主要有三種：混合培養(yǎng)法、平板雜交法和玻璃紙轉(zhuǎn)移法。國(guó)外在金霉素、土霉素、新生霉素等抗生素產(chǎn)生菌的雜交育種方面都有過成功的報(bào)道。

3、霉菌的雜交育種霉菌的雜交育種主要是通過體細(xì)胞的核融合和基因重組，即通過準(zhǔn)性生殖過程而不是通過性細(xì)胞的融合。霉菌的雜交育種的步驟為：第一

選擇直接親本。用來進(jìn)行雜交的兩個(gè)野生型菌株叫原始親本。假設(shè)這種菌株是用來作為形成異核體的親本,就叫直接親本。作為直接親本的遺傳標(biāo)記有多種，如營(yíng)養(yǎng)突變型、抗藥突變型、形態(tài)突變型等。第二是異核體的形成。在基本培養(yǎng)基上,強(qiáng)迫兩株?duì)I養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)，則這兩個(gè)菌株經(jīng)過菌絲細(xì)胞間的吻合形成異核體。第三是雙倍體的檢出檢出雙倍體的方法有很多種，如用放大鏡觀察異核體菌落表面，如果發(fā)現(xiàn)有野生型顏色的斑點(diǎn)和扇面，即可用接種針將其孢子挑出，進(jìn)行分離純化，即得雜合雙倍體?；蛘邔⒋罅慨惡梭w孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上從中長(zhǎng)出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化，即得雜合雙倍體。第四是分離子的檢出?？梢杂眠x擇性培養(yǎng)基篩選分離子，也可以將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至菌落成熟，檢查大量雙倍體菌落，在一些菌落上有突變顏色（隱性標(biāo)記）的斑點(diǎn)或扇面出現(xiàn)，從每個(gè)菌落接出一個(gè)斑點(diǎn)或扇面的孢子于完全培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)后經(jīng)過純化和鑒別即得分離子。四、原生質(zhì)體融合步驟：標(biāo)記菌株的篩選：對(duì)兩親株要進(jìn)行標(biāo)記，以提高篩選率。原生質(zhì)體的制備：用相應(yīng)的酶脫去菌體的細(xì)胞壁，制得完整的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的融合與再生：兩原生質(zhì)體在促融因子的存在下，發(fā)生融合，重建細(xì)胞壁，形成新的細(xì)胞。融合子的選擇：在選擇培養(yǎng)基上，通過兩個(gè)親本的遺傳標(biāo)記互補(bǔ)而選擇融合。2、特點(diǎn)及應(yīng)用：原生質(zhì)體間的雜交頻率都明顯高于常規(guī)雜交法，霉菌與放線菌已達(dá)10-1

~10-2，細(xì)菌與酵母已達(dá)10-5~10-6。原生質(zhì)體融合受接合型或致育型的限制較小，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。已報(bào)道的絲狀真菌種間的原生質(zhì)體融合主要是曲霉屬和青霉屬；屬間原生質(zhì)體融合主要在酵母中實(shí)現(xiàn)：熱帶假絲酸母×飾針復(fù)膜孢酵母，釀酒酵母×彭貝裂殖酵母等。重組體種類較多；遺傳物質(zhì)的傳遞更完整；采用溫度、藥物或紫外線照射燈處理鈍化一方的親株原生質(zhì)體，再融合，可以提高篩選頻率；可以把原生質(zhì)體融合與其他育種方法結(jié)合起來，提高篩選效率。五、DNA重組技術(shù)目標(biāo)DNA片斷的獲得與載體DNA分子的連接重組DNA分子引入宿主細(xì)胞從中選出所需重組DNA分子的宿主細(xì)胞基因重組質(zhì)粒的特點(diǎn)1、質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動(dòng)必需。2、每個(gè)細(xì)胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異，有嚴(yán)緊型和松弛型兩種。3、質(zhì)粒DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價(jià)、閉環(huán)狀DNA(CCCDNA)；其次是由于一條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán)DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性DNA。作為載體的質(zhì)粒的要求能自主復(fù)制有明顯篩選標(biāo)記有內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)以多拷貝形式存在含有啟動(dòng)子，有利于外源基因表達(dá)能在宿主中穩(wěn)定的遺傳質(zhì)粒DNA的提取方法細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴(kuò)增；細(xì)菌的收獲和裂解；質(zhì)粒DNA的提取。重組DNA中常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶：平頭連結(jié)（不常用）、黏端連結(jié)（常用）DNA連接酶DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶等限制性內(nèi)切酶的剪切方式宿主細(xì)胞必須符合以下條件對(duì)載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒有嚴(yán)格的限制；不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；在重組DNA增殖過程中，不會(huì)對(duì)它進(jìn)行修飾；重組缺陷型，不會(huì)產(chǎn)生體內(nèi)重組；容易導(dǎo)入重組DNA分子；符合重組DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。重組DNA導(dǎo)入宿主菌

體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。1、轉(zhuǎn)化指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌，它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。2、轉(zhuǎn)染和感染

利用噬菌體DNA作為載體時(shí)可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。3、重組克隆的篩選與鑒定

基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽(yáng)性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達(dá)該基因的產(chǎn)物。第四節(jié)、菌種保藏工業(yè)微生物菌種保藏與其他目的的菌種保藏要求有所不同。工業(yè)微生物菌種保藏，是要使菌種生產(chǎn)能力和與生產(chǎn)工藝相適應(yīng)的優(yōu)良性狀保持穩(wěn)定，力求把衰退現(xiàn)象推遲減緩到最低限度。1、菌種保藏原理菌種保藏共同的目標(biāo)是把菌株的優(yōu)良性狀保存下來，防止退化、死亡或雜菌污染。保藏的一般程序是選取優(yōu)良的純菌種，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠體，在其休眠和停止生長(zhǎng)的條件下保藏。如將菌種處于低溫、干燥、無氧和缺乏營(yíng)養(yǎng)的條件下，就可以使菌種暫時(shí)處于休眠狀態(tài)。在低溫保藏時(shí)，注意盡量不損傷細(xì)胞。在緩慢冷凍時(shí)，胞外基質(zhì)一般較快結(jié)冰而形成冰晶使基質(zhì)濃度增高，造成細(xì)胞水分外滲而大量脫水，可能使細(xì)胞死亡?？焖俳禍兀麅?nèi)很快形成冰晶，胞內(nèi)外滲透壓基本平衡，同時(shí)胞內(nèi)冰晶較小，對(duì)細(xì)胞及原生質(zhì)膜的損傷也較小，菌株不易死亡，影響也較小。低溫保藏法

低溫定期移植法

石蠟油低溫保藏法

干燥保藏

甘油管保藏法真空冷凍干燥法

液氮超低溫保存

現(xiàn)行的菌種保藏方法有下列諸種:一、低溫保藏法

這是一種常用的簡(jiǎn)便方法。一般的斜面孢子、液態(tài)孢子、斜面種子以及用麩皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在4℃冰箱內(nèi)保藏，一般不超過1～2個(gè)月為宜。本方法雖然簡(jiǎn)便，但由于菌株處于較高的水平活性下，這對(duì)保藏株的生產(chǎn)性狀是不利的，因此，生產(chǎn)菌種一般不采用此法保藏。二、低溫定期移植法

把培養(yǎng)好的斜面菌種放在低溫干燥處保存，定期移植，一般3～6個(gè)月移植一次(視菌種特征而定)。也可以用穿刺培養(yǎng)。穿刺培養(yǎng)是將含0.6％～0.8％的瓊脂培養(yǎng)基裝試管滅菌后直立冷凝后，用接種針尖挑取少量菌體，垂直刺入瓊脂培養(yǎng)基中心，放在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，待菌長(zhǎng)好后即可放低溫保存，此法較斜面保存有利，大腸桿菌可保藏2年以上不發(fā)生明顯變異。

斜面定期移植與穿刺移植法有其缺陷:即容易發(fā)生遺傳變異；連續(xù)傳代可使一些生產(chǎn)性狀丟失或減弱，也易于污染雜菌因此，一些貴重菌株及生產(chǎn)優(yōu)良菌株不宜用此法保藏。三、石蠟油低溫保藏法

本方法的原理是在長(zhǎng)好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達(dá)到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長(zhǎng)和代謝停止?fàn)顟B(tài)，同時(shí)石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達(dá)到較長(zhǎng)期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4～4℃下。液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過長(zhǎng)；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶中經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌1～2h，將其放烘箱中(160℃左右)干熱處理，去除滅菌時(shí)滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm左右為宜。操作：四、干燥保藏

干燥法是使菌處于干燥條件下停止生長(zhǎng)及處于休眠狀態(tài)，達(dá)到較長(zhǎng)期保藏的目的。此法用于細(xì)菌芽孢或產(chǎn)分生孢子的菌種，是現(xiàn)在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中較常用的菌種保藏方法。通常將菌種的分生孢子、芽孢，甚至菌絲體吸附于一些載體表面放至干燥容器里進(jìn)行常壓干燥或真空干燥所用載體有沙土、濾紙、硅膠及大(小)米等。1、沙土管法

取河(海)沙，過0.78mm(24目)篩，用10％鹽酸浸泡24h，倒去鹽酸用清水沖洗至pH中性，烘干或曬干。取菜園或果園土粉碎過篩，沙土按3：2或1：1混合裝入指形管或高100mm，直徑為10mm的小試管中，高約1cm(約2g)，塞棉塞121℃滅菌1h，也可用170℃2h干熱滅菌，蒸汽滅菌后需烘干。經(jīng)肉湯檢查確實(shí)證明無菌即可使用。將要保存的斜面菌種制成濃孢子懸液(≥106/ml)，用滅菌滴管或吸管吸取孢子懸液滴入無菌沙土上，每管約0.3～0.5ml，用接種環(huán)將其混合均勻。將真菌分生孢子用接種環(huán)從斜面直接挑取放入沙土中。然后將沙土管抽真空干燥。這時(shí)管內(nèi)砂土松散，表明已干燥。將干燥的砂土管放置在干燥器或密閉容器內(nèi)、干燥器下部放置變色硅膠等干燥劑，于4℃下保存。從斜面取出的孢子放入沙土管中混勻后，可以不抽真空直接放干燥器內(nèi)保存。在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐漸減慢，存活下來的孢子在以后保存期間穩(wěn)定性較好。用沙土管保藏的某些抗生素產(chǎn)生菌保藏期可達(dá)18年(土霉素和鏈霉素產(chǎn)生菌)到22年(新霉素產(chǎn)生菌)。對(duì)利福霉素、卡那霉素、四環(huán)素等容易產(chǎn)生變異的菌種，就不適合作長(zhǎng)期的沙土管保存。2、濾紙保藏法

本法是將要要保藏的微生物細(xì)胞或孢子吸附在滅菌濾紙上，干燥后冷藏。方法是3#濾紙剪成5mm×50mm的小條，放入干燥的培養(yǎng)皿中滅菌。將培養(yǎng)好的菌種用滅菌脫脂乳或奶粉復(fù)原乳制成孢子懸液，用滅菌鑷子將準(zhǔn)備好的濾紙條在滅菌操作下浸入菌懸液中，充分吸附菌細(xì)胞，取出后放入滅菌小試管或安瓿管中，在真空干燥機(jī)上抽干，真空條件下火焰熔封，冷藏。3、大(小)米保藏法

是根據(jù)我國(guó)制曲原理加以改進(jìn)的一種方法。此法是將曲霉等大量產(chǎn)生孢子的菌直接培養(yǎng)在大(小)米培養(yǎng)基上，待孢子充分成熟后干燥后保藏。

五、甘油管保藏法本法也是利用微生物在甘油中生長(zhǎng)和代謝受到抑制的原理達(dá)到保藏目的。方法是，將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無菌種用無菌水制成高濃度的菌懸液(108～1010/ml)。取1ml滅菌甘油放入與菌懸液充分混勻，使甘油濃度約為40%，于-20℃下凍存。六、真空冷凍干燥法

真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對(duì)病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。冷凍干燥保存的菌種存活時(shí)間長(zhǎng)、效果好，一般菌種可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發(fā)生變異。還具有體積小、不易污染、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，是一種用得最為廣泛的菌種保藏方法。冷凍干燥法是在低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，然后在真空條件下干燥，使微生物的生長(zhǎng)和酶活動(dòng)停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對(duì)細(xì)胞的損害，要采用保護(hù)劑來制備細(xì)甩懸液，使菌在凍結(jié)和脫水過程中起到保護(hù)作用的溶質(zhì)，通過氫鍵和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。1、冷凍干燥的基本原理

即是使樣品中的水分在冰凍狀態(tài)下，抽真空減壓，使凍結(jié)的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達(dá)到干燥。干燥后的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。2、設(shè)備

冷凍干燥備有不同型號(hào)和類型，但都由四個(gè)部分組成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷凍系統(tǒng)。干燥箱可控制溫度范圍為-40～40℃。

3、操作方法

(1)安瓿管準(zhǔn)備選取規(guī)格約直徑為8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%鹽酸浸泡8～10h，再經(jīng)自來水沖洗多次，用蒸餾水涮洗2～3次，烘干；貼好菌號(hào)及日期的標(biāo)簽，管口塞好棉塞，滅菌備用。(2)保護(hù)劑的選擇及制備一些對(duì)熱敏感的保護(hù)劑如血清等用過濾除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數(shù)菌種可以用脫乳為保護(hù)劑。(3)菌種準(zhǔn)備及分裝菌種要求為生長(zhǎng)良好的純種，菌齡以處于穩(wěn)定期為好，孢子是新鮮的。每支長(zhǎng)好的斜面加2～3ml保護(hù)劑，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起(注意勿刮起培養(yǎng)基)，制成菌懸液。液體培養(yǎng)的菌種，則需經(jīng)離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細(xì)胞，收集的菌體用保護(hù)劑懸浮制成菌懸液。(4)預(yù)凍分裝好的安瓿管需要進(jìn)行預(yù)凍，即放在-30～-40℃下凍結(jié)20～60min，也可以用干冰和無水乙醇凍5～10min。(5)冷凍干燥經(jīng)預(yù)凍的安瓿放入干燥箱中抽真空干燥。此時(shí)干燥箱溫度控制在-30℃以下，并盡快使真度達(dá)到66Pa以下，可升溫以加速水分升華，升溫不宜過快，以免引起樣品融化。干燥時(shí)間以樣品最終水分含量達(dá)到1%～3%為準(zhǔn)。凍干樣品呈酥塊工松散片狀。干燥完畢將安瓿管在真空下用火焰燒熔密封。(6)保藏及凍干管的啟用密封好的凍干管在4℃或-18℃下保藏。需用凍干菌種時(shí)，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂輪在無菌條件下打開，或?qū)碴稠敳吭诰凭珶艋鹧嫔献茻杆俚紊侠涞臒o菌水，使管破裂，然后用鑷子等輕輕敲碎管口，加入0.3～0.5ml液體培養(yǎng)基溶解凍干菌塊成為懸液，用無菌滴管或接種環(huán)移至斜面或液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。（1)菌的質(zhì)量保藏的菌種應(yīng)在營(yíng)養(yǎng)豐富的最適條件下，使之進(jìn)入穩(wěn)定期，稍老一些的菌體對(duì)環(huán)境抵抗力強(qiáng)。另處，作為冷凍干燥的菌懸液細(xì)胞濃度要高，如果保存的菌液細(xì)胞濃度不高，就會(huì)使以后傳種造成困難，保存期也會(huì)受到影響。注意事項(xiàng)：(2)保護(hù)劑一般情況下，那些容易保存的菌種對(duì)保護(hù)劑的要求不很嚴(yán)格，而不易保存的菌種對(duì)保護(hù)劑的要求卻很苛刻。如個(gè)別菌種在脫脂乳作保護(hù)劑的情況下死亡率高達(dá)99.99%，而采用葡聚糖等混和保護(hù)劑時(shí)死亡率大大減少。（3）干燥速度實(shí)驗(yàn)表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存活率為67.3%，而3h為59%。（4）空氣的影響

冷凍干燥后空氣對(duì)細(xì)菌細(xì)胞影響較大，可導(dǎo)致細(xì)胞損傷進(jìn)而死亡，故在凍干后應(yīng)立即在真空下融封，才有利于長(zhǎng)期保存。

（5）溫度的影響可以在室溫下保存，但許多微生物在4℃保存的存活率要比在室溫下高1倍。（6）含水量的影響

水分含量過高對(duì)菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細(xì)胞含水量控制在3%以下(1%～3%)。

(7)復(fù)蘇培養(yǎng)

打開安瓿管后加入無菌水使凍干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。菌種能否適宜凍干保存，需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)來證明。凍干保藏的效果因微生物種類而異，一般是細(xì)菌＞放線菌＞真菌＞藻類，而菌絲體不宜用此法保存。七、液氮超低溫保存

本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。大多數(shù)微生物如病毒、噬菌體，立克氏體，各種細(xì)菌、放細(xì)菌、支原體，各種絲狀菌、酵母、藻類和原蟲，特別是一些無法用凍干保存的微生物，都可用此法長(zhǎng)期保存。工業(yè)微生物高產(chǎn)菌種也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130℃以下溫度時(shí)，它的新陳代謝作用停止，化學(xué)反應(yīng)也消失，而液氮溫度可達(dá)-19