流行性乙型腦炎病毒危害評估報告

流行性乙型腦炎病毒危害評估報告流行性乙型腦炎病毒危害評估報告的部分內(nèi)容如下，流行性乙型腦炎是經(jīng)蚊蟲媒介傳播的一種人畜共患性疾病。1935年日本的學者從病死腦炎病人的腦組織中分離到該病毒，國際上，將這種病原體命名為日本腦炎病毒(JapaneseencephalitisvirusJEV)，簡稱''乙腦病毒〃。我國稱為''流行性乙型腦炎〃，簡稱''乙腦〃。根據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法》，流行性乙型腦炎屬于乙類傳染病。(-)不同實驗室操作生物安全實驗室級別要求根據(jù)《名錄》的要求，在實驗室操作可能含有和確定含有乙型腦炎病毒感染性材料或未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料以及病毒培養(yǎng)、動物感染實驗，務必在BSL—2實驗室內(nèi)進行；在對滅活、無感染性材料進行操作時，確認的乙腦病毒滅活措施有效后，方可進入BSL—1實驗室進行諸如ELISA,PCR等后續(xù)實驗檢測過程。二、背景資料(一)一般生物學特性1、形態(tài)染色乙型腦炎病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae),黃病毒屬(flavi-virus)。電鏡下病毒顆粒大致呈球形，直徑40~60nm左右。超薄切片上可看到一層外膜(膜蛋白囊膜)和一個電子密集的核心(RNA蛋白)，圍繞成一個清晰的結構。負染色體可見一些明顯的突起部分分布在外膜上，由32個子粒組成的衣殼呈明顯的對稱二十面體。病毒基因組為llkb左右的單股、正鏈RNA。脂質(zhì)雙分子層中鑲嵌有糖基化的包膜蛋白(E)和膜蛋白(M)。在脂蛋白囊膜表面有血凝素刺突，能凝集雞、鵝、羊等動物紅細胞。JEV抗原性穩(wěn)定，人和動物感染JEV后，均產(chǎn)生補體結合抗體、中和抗體和血凝抑制抗體。2、培養(yǎng)特性JEV能夠感染多種細胞，C6/36、BHK21、Vero等細胞株和金黃色地鼠腎、豬腎、狗腎、雞胚等原代細胞均對乙型肝炎病毒敏感，并引起典型的細胞病變。較敏感的細胞包括金黃色地鼠腎細胞，豬腎細胞。上述細胞感染乙型腦炎病毒后均能夠大量繁殖擴增到增到較高的滴度，并引起明顯的細胞病變，細胞病變表現(xiàn)為細胞圓縮,脫落：C6/36細胞上的病變可以表現(xiàn)為聚集、圓縮以及脫落等。在瓊脂糖覆蓋下，雞胚、地鼠腎、Vero等細胞均能形成蝕斑。本病毒的這一特性可用于減毒疫苗苗株的篩選。乙型腦炎病毒有明顯的嗜神經(jīng)特性，接種小鼠、金黃色地鼠、猴、馬、綿羊、山羊等動物內(nèi)均可引起典型的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，乳鼠可經(jīng)皮下接種而感染，小鼠是常用的實驗動物模型。能凝集多種動物血紅細胞。病毒在細胞和鼠腦內(nèi)連續(xù)傳代，可使毒力下降。(1)原代細胞：原代細胞較敏感。而常用的為黃金色地鼠腎細胞(BHK-21)o培養(yǎng)環(huán)境：含EagLe's液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素(PS)1%谷氨酰胺(G)的生長維持液；ph值至7.2~7.4；37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育。以小量病毒(10TCID50)感染后，病毒很快繁殖，24H開始出現(xiàn)病變，72H病變明顯，病毒滴度可達107TCID50/ml以上。其他常用細胞有雞胚纖維母細胞，常用于蝕斑培養(yǎng)。（2）傳代細胞：以白蚊伊蚊C6/36細胞為最敏感，培養(yǎng)環(huán)境：含EagLe's液、1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素（PS）、1%1%谷氨酰胺（G）的生長維持液；ph值至7.2~7,4。在28℃的5%CO2培養(yǎng)箱孵育。病毒反之滴度高達108TCID50/ml,但細胞病變不甚明顯。BHK-21細胞可用于培養(yǎng)，也可適用于做蝕斑，此外，人二倍體細胞也可培養(yǎng)病毒。不同細胞的敏感性不同。（二）乙腦病毒對外環(huán)境的穩(wěn)定性L自然環(huán)境中的穩(wěn)定性與對溫度的敏感性乙型腦炎病毒對外界抵抗力弱，不耐熱，50°C30min或54°C10min即可滅活，對低溫和干燥抵抗力較強，在4℃冰箱中能保存數(shù)年，如加甘油或血清保存可增加其穩(wěn)定性。病毒感染性在PH7~9時最為穩(wěn)定，在-70°C或冷凍干燥存放較為穩(wěn)定，存于4℃的患者血清或其他感染材料的感染性可保持數(shù)周之久。2.對紫外線、生物試劑的敏感性超聲波（560千周/S）、紫外線可滅活病毒。毒粒經(jīng)蛋白酶處理，不僅可以滅活，且表面突出物及血凝素也全部消失。病毒在不同的稀釋劑內(nèi)的穩(wěn)定性有明顯的不同，如10%水解乳蛋白和5%乳糖是較好的稀釋劑。3,化學因子的敏感性乙型腦炎病毒屬于有包膜的RNA病毒，對乙醛、氯仿、蛋白酶、乳酸、高鎰酸鉀、龍膽紫等均可滅活病毒。（三）乙型病毒的致病性和感染數(shù)量L致病性當攜帶乙腦病毒的蚊蟲叮咬宿主時，病毒隨蚊蟲的唾液進入人體內(nèi)。首先在局部的毛細血管內(nèi)皮細胞和局部淋巴組織的細胞中增殖，然后病毒釋放入血形成短暫的低水平的病毒血癥期，病毒經(jīng)過血液循環(huán)擴散到肝、脾等處的細胞中增殖，一般僅表現(xiàn)出輕微的癥狀或無癥狀。乙腦病毒通過附著于人體的中樞神經(jīng)的血管內(nèi)皮細胞，內(nèi)吞作用下進入細胞內(nèi)囊泡中，進而被血管周圍的細胞攝取并運送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。尤其在血腦屏障受損或腦實質(zhì)已被病毒入侵時更容易誘發(fā)腦炎。經(jīng)過4~7D的病毒增殖過程，大量病毒再次釋放入血形成第二次病毒血癥，引起發(fā)熱、寒戰(zhàn)、出疹和其他全身不適的癥狀；乙腦病毒能夠?qū)е聡乐氐闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)病理改變，表現(xiàn)為：可引起腦實質(zhì)廣泛病變，以大腦皮質(zhì)、腦干及基底核的病變最為明顯；腦橋、小腦和延髓次之，脊髓病變最輕。其基本病理改變?yōu)椋孩傺軆?nèi)皮細胞損害，可見腦膜與腦實質(zhì)小血管擴張、充血、出血及血栓形成，血管周圍套式細胞浸潤；②神經(jīng)細胞變性壞死，液化溶解后形成大小不等的篩狀軟化灶；③局部膠質(zhì)細胞增生，形成膠質(zhì)小結。部分患者腦水腫嚴重，顱內(nèi)壓升高或進一步導致腦疝。病后免疫力強而持久，罕有二次發(fā)病者。多種動物敏感對乙型腦炎病毒，將乙型腦炎病毒顱內(nèi)接種小白鼠、金黃色地鼠、馬、綿羊、山羊、馬等都能夠發(fā)生典型的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和病理改變。一般顱內(nèi)接種3日齡乳鼠，2~3D內(nèi)病變達到最強表現(xiàn)為死亡，首先表現(xiàn)為離群、抽搐、拒乳、行動遲緩、后肢活動障礙、平衡能力下降，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀漸進性發(fā)展最終對外界刺激反映能力下降或消失、體溫下降直至死亡，通常皮下方式接種21日齡以下的小白鼠，致病變作用明顯，病毒先在神經(jīng)組織繁殖，再通過血腦屏障侵入神經(jīng)組織，引起腦炎而死亡。2,感染數(shù)量目前尚無乙腦對人的感染劑量的相關報道（四）乙腦病毒的傳播途徑及暴露的后果.自然狀態(tài)下乙腦的傳播途徑乙腦屬于血液傳播的自然疫源性疾病。病毒通常在豬一蚊一豬之間循環(huán)。通過媒介昆蟲叮咬處于病毒血癥的動物，乙腦病毒在昆蟲體內(nèi)增殖，再叮咬人，通過口器把病毒傳到人體而引起感染發(fā)病。乙腦的傳染源是受感染的動物和人。動物：主要是豬，其次為家鼠、猴、馬、牛、羊、兔、田鼠、倉鼠、雞、鴨以及鳥類等。豬成為主要傳染源，蚊蟲是乙腦病毒的最主要的擴散宿主和傳染源。.實驗室操作所致的非自然狀態(tài)下乙腦感染途徑實驗室操作可能發(fā)生感染的途徑主要有：大量活病毒操作時形成的感染性氣溶膠傳播、開放型傷口等。氣溶膠的產(chǎn)生環(huán)節(jié)包括：離心、病毒懸液分裝、病毒培養(yǎng)換液以及實驗動物標本注射、標本解剖等環(huán)節(jié)。開放型傷口感染模式主要發(fā)生在：實驗動物接種與實驗動物解剖過程中注射器針頭或破裂的病毒培養(yǎng)瓶扎傷、劃破；被實驗室內(nèi)感染有病毒的齒動物咬傷；破損的皮膚或黏膜組織接觸到病毒等造成意外胃腸外接種等（六）乙腦的預防、診斷和治療L預防（1）免疫接種：接種乙腦疫苗以提高人群免疫力是預防乙腦的重要措施之一。接種對象是流行區(qū)的兒童及從非流行區(qū)到流行區(qū)的敏感人群。目前有滅活疫苗和活疫苗兩種。為了確保疫苗接種效果，接種時間應在流行季節(jié)前1~3個月完成。兒童初次基礎免疫后應按規(guī)定加強免疫。疫苗在運輸和儲存過程中均應在4℃保存。以保證其有效性。我國目前廣泛使用的乙腦疫苗有地鼠腎滅活疫苗和地鼠腎減毒活疫苗。目前已研制出純化濃縮的滅活疫苗。我國的乙腦減毒活疫苗自1989年批準生產(chǎn)以來，10年多共生產(chǎn)兩億多人份，接種約1億多人,實驗觀察副反應較輕，認為是安全有效的，但免疫持久性有待進一步觀察。（2）滅蚊防蚊：滅蚊、防蚊為預防本病的主要環(huán)節(jié)。針對傳播乙腦病毒的蚊蟲所采取的以環(huán)境智力為主的綜合防制措施是切斷法。宜開展以滅蚊為中心的群眾性愛國衛(wèi)生運動，在農(nóng)村重點是消滅牲畜（特別是豬圈）的蚊蟲。黃昏戶外活動應避免蚊蟲叮咬。（3）化學藥物等防制：在我國現(xiàn)階段，采用化學防制方法也是最重要的手段,對一時無法清除的孽生地，可使用滅幼蟲殺蟲劑定期噴灑,如20%清氛殺蟲乳油、生物蛙、必克幼、2%毗蟲琳滅幼顆粒劑等藥物，效果較好。尤其在發(fā)生蚊媒傳染病的疫區(qū)，使用化學藥物，迅速降低成蚊密度是當務之急，通過化學藥物的空間噴霧和滯留噴灑達到成蚊防制。（4）實驗室防護：針對前述可能出現(xiàn)實驗室感染的環(huán)節(jié)：離心時，使用帶蓋的密封離心機；嚴格按照生物安全操作規(guī)范，病毒培養(yǎng)操作時，要求實驗操作務必輕柔規(guī)范，并且要求使用負壓設施；實驗操作過程中，佩戴符合生物安全標準的防護器材包括：口罩、帽子、手套和隔離衣等；定期進行生物安全耗材的評價、評估工作；進行動物實驗，務必小心，警惕不要被銳器扎傷，動作輕柔最大限度地減少氣溶膠產(chǎn)生的可能性。2.診斷根據(jù)流行病學資料、臨床癥狀和體征以及實驗室檢查結果的綜合分析進行診斷，但確診則需要依靠抗體檢查或病原分離。(1)流行病學：在乙腦流行區(qū)居住，在蚊蟲叮咬季節(jié)發(fā)病或發(fā)病前25D內(nèi)在蚊蟲叮咬季節(jié)到過乙腦流行區(qū)。(2)臨床癥狀和體征：急性起病，發(fā)熱頭痛、噴射性嘔吐、嗜睡，伴有腦膜刺激癥狀。急性起病，發(fā)熱2~3D后出現(xiàn)不同程度的意識障礙，如昏迷、驚厥、抽搐、肢體痙攣性麻痹等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，或發(fā)展至中樞性呼吸循環(huán)衰竭。(-)乙腦病毒的復蘇L凍存的細胞培養(yǎng)病毒毒種的復蘇(略).干燥管保存的毒種的復蘇(略),感染的鼠腦組織(1)可能危害：在振蕩器上振蕩破碎及離心過程中易形成氣溶膠的溢出、液體濺出和離心管的可能破裂。(2)預防及處置措施：振蕩過程中一定要把離心管口封嚴，同時要在生物安全柜內(nèi)進行操作。離心后一定要在生物安全柜內(nèi)打開離心管吸取上清液。若離心管發(fā)生破裂，按《BSL-2實驗室安全手冊》中意外事故處理辦法章節(jié)處理。打開離心管時，若液體濺出到安全柜臺面應及時消毒處理。方法參見《BSL-3實驗室安全手冊》中以外事故處理辦法章節(jié)中相關內(nèi)容。若濺到操作者身體上，其處理參見《BSL-2室安全手冊》中《意外事故處理辦法》章節(jié)中相關內(nèi)容。若手套污染必須經(jīng)高壓處理后才允許運出實驗室進行集中處理。（二）病毒的培養(yǎng)與擴增（略）（三）病毒滅活和滅活效果評價L可能危害吸取病毒液時有可能發(fā)生液體濺出、滴灑到實驗臺面上等。裝有毒液的的蓋子上可能沾有病毒液，開蓋時可能會濺出，吸液時可能會污染移液槍壁：稀釋混勻過程可能會形成氣溶膠。2,預防及處置措施加液過程中臺面上鋪上浸有消毒劑的紗布或一次性吸水紙，一旦發(fā)生意外，馬上將污染的紗布或紙棄入含10%有效氯的次氯酸鈉的消毒缸內(nèi)并立即消毒臺面并更換新的紗布或吸水紙?；脴I(yè)過程中動作要輕，棄液時應將吸管插入消毒液面下，方法參見《BSL-3實驗室安全手冊》中《意外事故處理辦法》相關章節(jié)內(nèi)容。裝有病毒液的管子開蓋前先離心；稀釋混勻過程不要用吸頭吹打，而是蓋緊瓶蓋后在振蕩器上混勻。3,病毒的保存略。（四）病毒凍干保存1,可能危害分裝操作中可能有氣溶膠的產(chǎn)生；在毒種管封口、儲存中可能發(fā)生破裂；破裂的毒種管可能劃傷實驗人員。2,預防及處置措施操作輕柔，病毒液要貼壁緩緩流下，封口時要力度合適，如發(fā)生毒種管破裂或劃傷情況，請參見《BSL-2實驗室安全手冊》中《意外事故處理辦法》章節(jié)中相關內(nèi)容處理。（五）毒種的運輸（略）（六）標本采集、運輸和保存（略）（七）病毒分離（略）（A）病毒檢測1.ELISALISA檢測中使用全病毒抗原的情況下，包被抗原和檢測后包被材料的消毒、廢棄值得注意。要求在生物安全二級實驗室生物安全柜內(nèi)進行活病毒抗原包被，操作者應著防護裝備，戴手套，包被好的檢測板最好密封，放置4℃冰箱內(nèi)過夜。由于活病毒的存在及造成擴散的危險，檢測后應將檢測板放置于消毒液內(nèi)，將可能存留的病毒滅活，而后廢棄。2.IFAIFA檢測中也會涉及使用活病毒作為抗原的情況，所以制備抗原片時應在生物安全二級實驗室生物安全柜內(nèi)進行，用過的抗原片應在消毒液中浸泡消毒后再廢棄。.PCR嚴格執(zhí)行PCR功能分區(qū)，防止病原核酸和環(huán)境雙向污染極其重要。PCR過程中使用的與核酸或CDNA接觸的槍頭要回收至密閉容器內(nèi)。使用的一次性手套等物品，務必置于密閉垃圾桶內(nèi)廢棄。.Real-timePCR對環(huán)境潔凈度要求比PCR嚴格，因此每次Real-timePCR使用的槍頭，一次性手套均應即使置于密閉容器中，回收廢棄。5,中和試驗中和試驗中一定會使用活病毒，操作費時費力，應特別注意安全，應在生物二級實驗室生物安全柜內(nèi)進行，留下的可能有活病毒的物品，要及時浸泡消毒液，消毒后方可廢棄。（九）病毒滴定（略）（+）乙型腦炎病毒的中和試驗1,可能危害裝有病毒液的蓋子上可能沾有毒液，開蓋時可能回濺出,吸液時可能會污染移液槍壁；稀釋混勻過程可能會形成氣溶膠；病毒液滴有可能發(fā)生液體濺出、灑在實驗臺面上。2,預防及處置措施裝有病毒液的管子開蓋前先離心；稀釋混勻過程不要用吸頭吹打，而是蓋緊后在振蕩器上混勻；吸液過程中動作要輕,棄液時應將吸管插入液面下；加液過程中臺面上鋪上浸有消毒劑的紗布，一旦發(fā)生上述意外，實驗過程中產(chǎn)生的耗材等都必須經(jīng)高壓處理后才允許運出實驗室進行處理。（H八一）蚊蟲飼養(yǎng)與蚊蟲的病毒接種（略）四.工作人員的預防接種和工作人員素質(zhì)（-）工作人員的預防接種根據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法》及《突法公共衛(wèi)生事件應急條例》有關法律法規(guī)，并參照《中國疾病預防控制中心實驗室人員管理規(guī)定（試行）》及世界衛(wèi)生組織關于《實驗室生物安全手冊》等制定出實驗室人員健康管理規(guī)定。集體措施如下：1,進行乙型腦炎病毒相關操作的人員必須取得以下資格或處于以下工作狀態(tài)（1）完成乙型腦炎病毒疫苗接種程序，并且進行抗體檢測（2）經(jīng)過規(guī)范的生物安全培訓，并經(jīng)過嚴格考核和取得上級主管部門人員許可；發(fā)生嚴重的發(fā)熱性疾病、卡他性炎癥以及有近期較深的開放性傷口的人員應該禁止或限制其進入相關實驗操作區(qū)。（3）限制在妊娠早期的工作人員進行乙型腦炎病毒相關的感染性材料的操作。.根據(jù)實驗室從事乙腦病毒需要，為實驗室人員建立健康檔案；新工作人員進實驗室前必須進行本實驗室規(guī)定項目的體檢，并根據(jù)需要進行疫苗接種；每年最少一次為本實驗室職工提供相關項目體檢，體檢日期定在每年9、10月份流行期過后，有條件的話，最好每年流行期前后都要進行體檢；項目包括內(nèi)科常規(guī)檢查，血常規(guī)、尿常規(guī)檢查,肝功能、肝、脾B超，心電圖，抗體檢測，血凝抑制試驗。.實行健康監(jiān)測報告，實驗室人員必須在身體狀況良好的情況下，才能進入實驗室工作。建立監(jiān)測網(wǎng)，有關人員必須每天監(jiān)察實驗人員健康狀況，一旦出現(xiàn)體溫升高和身體狀況異常及時向本單位醫(yī)務室報告，進行必要的醫(yī)學觀察和處置。從事與乙腦病毒有關的實驗工作后,在相應疾病的平均潛伏期內(nèi)不得離開實驗室所在地，因工作原因必須離開時，務必采取相應的監(jiān)測或預防措施。.對所有從事乙腦病毒的實驗室工作人員在進入實驗室前都要做健康體檢，保留血樣，定期體檢采集的血清標本留在健康檔案中備案。五,評估結論（一）各種實驗活動的防護措施1?凡是涉及到活病毒的操作如病毒分離、組織培養(yǎng)、TCID50測定、中和實驗和空斑實驗等，因為一直病毒，而且病毒種子的濃度較高，可能會發(fā)生通過意外胃腸外接種、皮膚和黏膜接觸感染或通過氣溶膠感染等實驗室意外感染。因此，對JEV活病毒的操作都必須在生物安全二級實驗室的外排式生物安全柜內(nèi)操作。上崗前必須接受嚴格的生物安全以及該病毒實驗技術的培訓I,在個人防護措施上應按生物安全二級實驗室防護級別進行個人防護。實驗完畢后能高壓的廢棄物在實驗室內(nèi)121C高壓處理20min后才允許運出實驗室，不能高壓的物品用含10%有效氯的次氯酸鈉溶液進行浸泡消毒30min以上。2.臨床疑是病人標本（血清和腦脊液標本）中JEV的分離：如果知識未知病毒性腦炎暴發(fā)，而且根據(jù)流行季節(jié)和暴露史等懷疑為蟲媒病毒性腦炎，因臨床疑是病人標本中病毒較少，且蟲媒病毒一般都需要通過感染的媒介蚊蟲叮咬傳播，氣溶膠造成的感染罕見報道，因此分離病毒可在生物安全二級實驗室，在個人防護措施上應按生物安全二級實驗室防護級別進行個人防護。3,已經(jīng)滅活的病毒或標本，用于病毒特異性核酸和特異性抗體的檢測：此類實驗因病毒已經(jīng)滅活，可BSL級實驗室進行操作。用于核酸提取的已知病毒和臨床疑是病人標本的滅活過程，而且在PCR室進行后續(xù)抽提過程，然后進