檢測技術(shù)方法

檢測技術(shù)方法第1頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五免疫測定的發(fā)展（1）以抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)所致的沉淀或凝集現(xiàn)象判斷結(jié)果的免疫測定技術(shù)，如單雙擴，免疫電泳，玻片凝集，膠乳凝集，紅細胞凝集試驗等；（2）固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)，如放射免疫試驗，酶免疫試驗，熒光免疫試驗等；（3）均相免疫測定技術(shù)，如酶放大免疫測定技術(shù)（EMIT），克隆酶供體免疫測定（CEDIA）等；（4）以單克隆抗體為基礎(chǔ)的免疫測定技術(shù)的發(fā)展；（5）以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的免疫測定技術(shù)發(fā)展時期；（6）免疫測定的自動化；（7）生物芯片技術(shù)（免疫測定的集成化和微型化）。第2頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五如何區(qū)分不同的檢測方法以抗原抗體特異結(jié)合為基礎(chǔ)，以標(biāo)記示蹤物不同劃分放射免疫法酶聯(lián)免疫法化學(xué)發(fā)光法時間分辨法免疫層析法第3頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫（ELISA）

基礎(chǔ)知識第4頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五免疫檢測的基礎(chǔ)知識

1.1

抗原

抗原是能在機體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？乖M入機體后，可刺激機體產(chǎn)生抗體和引起細胞免疫。在免疫測定中，抗原是指能與抗體結(jié)合的物質(zhì)。能在機體中引起抗體產(chǎn)生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質(zhì)，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。第5頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五免疫檢測的基礎(chǔ)知識

1.1抗原

小分子化合物在與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合后能引起機體產(chǎn)生特異性抗體的，稱為半抗原（hapten）。例如某些激素、藥物等?？乖姆磻?yīng)性取決于抗原決定簇（antigenicdeterminant），或稱為表位（epitope）。一個抗原分子可帶有不同的決定簇，例如中可帶有等決定簇。第6頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五1.2抗體1.2.1抗體的結(jié)構(gòu)

抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。免疫檢測的基礎(chǔ)知識

第7頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型。在均相EIA中可不需進行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測定標(biāo)記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。第8頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法均相EIA在臨床檢驗中較少應(yīng)用。非均相EIA需先進行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay），簡稱ELISA，第9頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五第10頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五2023/4/11酶聯(lián)免疫法

ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。第11頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法

ELISA的原理

在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。第12頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法

ELISA的原理

此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。第13頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法ELISA的類型

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”；（3）酶反應(yīng)的底物。第14頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法ELISA的類型

根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗的ELISA主要

有以下幾種類型：第15頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五ELISA檢測方法根據(jù)標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。常用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：夾心法間接法競爭法捕獲法第16頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五夾心法雙抗原（抗體）夾心法是檢測抗原最常用的方法，其檢測方法：雙抗原夾心：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)抗原Ag*→Ag-Ab-Ag*+底物(TMB)→顯色雙抗體夾心：固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標(biāo)抗體Ab*→Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色第17頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五雙抗原夾心法示意圖+Y+Y抗原特異性抗體（IgG、IgM）金標(biāo)抗原顯色第18頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五夾心法雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：

1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。

4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標(biāo)本中抗原的量。第19頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五夾心法圖解TMB+H2O2TMB+H2O2顯色樣品酶標(biāo)抗原加樣洗滌加酶包被底物包被抗原21114233360’30’30’45554洗滌一步法二步法第20頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五ELISA的測定模式雙抗體夾心法測抗原

第21頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五間接法間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗

體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法第22頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五間接法圖解TMB+H2O2顯色樣品酶標(biāo)二抗洗滌加樣包被底物包被抗原加酶洗滌143215234530’30’10’第23頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五間接法測抗體第24頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五間接法第25頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五競爭法第26頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五競爭法測抗體第27頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五TMB+H2O2TMB+H2O2競爭法圖解顯色酶標(biāo)抗體加樣包被底物包被抗原加酶洗滌14321360’10’22134樣品4第28頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五捕獲法第29頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五固相捕獲法測IgM抗體第30頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五ELISA試劑盒組分完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液。第31頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶標(biāo)板固相載體固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。第32頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五包被的方式將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。第33頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五包被用抗原用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。

第34頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五包被用抗體包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。第35頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五包被的條件包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗的特點和材料的性質(zhì)而選定。第36頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。抗原或抗體

包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。第37頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五結(jié)合物結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。第38頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)

定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，有色產(chǎn)物易于測定等。HRP(辣根過氧化物酶)AP(堿性磷酸酶)第39頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五結(jié)合物的制備（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過

它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。第40頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五結(jié)合物的制備（2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用

此法。反應(yīng)時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。第41頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五結(jié)合物的保存酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經(jīng)復(fù)溶，頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。第42頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì),通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。第43頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶的底物HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，過氧化物為H2O2，四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)第44頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五洗滌液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水第45頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶反應(yīng)終止液常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式

ELISA中一般采用2mol/L第46頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五陽性對照品和陰性對照品陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控

制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。第47頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用

的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。第48頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五ELISA的操作要點優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條

件。第49頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五標(biāo)本的采取和保存可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進行測定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗中均以血清作為檢測標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。第50頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五標(biāo)本的采取和保存清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。

一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑（見3.2.4）。第51頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五試劑的準(zhǔn)備按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。第52頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五加樣在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。第53頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五溫育在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，第54頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五溫育ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。第55頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五溫育溫度37度43度？時間30分鐘60分鐘？環(huán)境水浴空氣浴？第56頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。第57頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。第58頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五測量酶標(biāo)儀第59頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五質(zhì)量控制質(zhì)量控制（QuailityControl,Q.C）

質(zhì)量控制是監(jiān)視全過程，排除誤差，防止變化，維持標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀的一個管理過程。這一過程是通過一個反饋環(huán)路進行的。

1）確定控制的對象；

2）規(guī)定控制對象的標(biāo)準(zhǔn)（預(yù)期值）；

3）制定或選擇控制方法和手段；

3）測量實際數(shù)據(jù)；

4）比較或較對實際數(shù)據(jù)與預(yù)期值之間的差異，并說明產(chǎn)生這一差異的原因。超出預(yù)定誤差范圍，報警系發(fā)出信號，反饋通道中斷。

5）采取行動，解決差異?；謴?fù)原狀（原標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)）的手段發(fā)揮作用。第60頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五誤差實驗誤差分為三種：系統(tǒng)誤差、隨機誤差和過失誤差。

系統(tǒng)誤差是指一系列測定結(jié)果與真值或靶值存在有同一傾向的誤差，有明顯的規(guī)律性，可在一定條件下重復(fù)出現(xiàn)，是可以通過質(zhì)控預(yù)防和校正的。

隨機誤差又稱偶然誤差，是一種偶然的、未能預(yù)料到的誤差，是難以避免和校正的誤差。檢驗工作中隨機誤差的分布符合正態(tài)分布規(guī)律。

過失誤差是人為的責(zé)任誤差。通過加強實驗室管理和開展質(zhì)量控制工作是可以避免的。第61頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五真值用確切的、最理想的決定性方法測得的值，稱為真值。真值一般是測不到的。通過可靠的決定性方法測出的值，稱為靶值，通常用靶值來表示真值的大小。第62頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五準(zhǔn)確度是指測定結(jié)果與真值（或靶值）接近的程度。準(zhǔn)確度不能以數(shù)字表示，往往用不準(zhǔn)確度來衡量。測定結(jié)果與靶值的偏離程度稱為偏差，它表示該項檢驗的不準(zhǔn)確度。

絕對偏差=檢驗的均值-真值（或靶值）

相對偏差=絕對偏差真值÷（或靶值）×100%第63頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五精密度

是指對同一樣本重復(fù)測定時，每次測定結(jié)果與平均值的接近程度，即重復(fù)測定值之間的符合程度。第64頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五標(biāo)準(zhǔn)品1、國際標(biāo)準(zhǔn)品由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的，用肯定的、公認的、準(zhǔn)確的物理或化學(xué)方法測定的定值材料。

2、國際生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的國際活性單位的材料。

3、參考標(biāo)準(zhǔn)血清國家標(biāo)準(zhǔn)化組織根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的法定材料?？捎糜阼b定儀器和鑒定方法準(zhǔn)確性。第65頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五質(zhì)量控制血清質(zhì)控血清是已有靶值的血清，在每次的常規(guī)檢驗中加入一份或數(shù)份，通過所得結(jié)果來了解本次檢驗的情況。質(zhì)控血清檢驗的結(jié)果如能控制其誤差在一定范圍內(nèi)，就說明該檢驗沒有發(fā)生不允許的誤差。如果出現(xiàn)超過允許誤差范圍的異常結(jié)果，提示該檢驗不合格，應(yīng)尋找原因，糾正后，重檢待測標(biāo)本。因此質(zhì)控血清在質(zhì)控工作中起重要作用。第66頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五室內(nèi)質(zhì)量控制程序臨床檢驗的檢測結(jié)果，每次或每天之間不可能沒有誤差。決定允許的誤差范圍，以臨床上不造成誤診與漏診為準(zhǔn)，通過以下步驟來確定質(zhì)控范圍。

1）最佳條件下的測定誤差。

2）已知值的血清在常規(guī)檢驗條件下的誤差。

3）未知值的血清在常規(guī)檢驗條件下的誤差。

4）臨床應(yīng)用的要求。對任何一個試驗都應(yīng)確定一個允許的誤差范圍，前題是滿足臨床要求。如允許誤差定得過小，在臨床上不存在任何意義，但為了符合該規(guī)定卻要花費很大人力、物力和時間。相反，如果將允許誤差定得過大，將使監(jiān)測系統(tǒng)察覺不到臨床上要求檢出的誤差，失去質(zhì)控的意義。第67頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五輔助材料生物活性材料稱量包被液/封閉液配制包被/封閉微孔板干燥微孔板真空包裝微孔板其他組分配制液體分裝檢驗檢驗檢驗檢驗標(biāo)簽粘貼試劑盒組裝試劑盒入庫說明一般生產(chǎn)區(qū)十萬級潔凈區(qū)質(zhì)控點質(zhì)控要點1質(zhì)控要點2質(zhì)控要點3質(zhì)控要點4第68頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五酶免疫測定操作中的注意事項標(biāo)本的收集和保存試劑準(zhǔn)備加樣溫育洗板顯色比色結(jié)果判斷結(jié)果報告及解釋第69頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五標(biāo)本的收集和保存

一般為血清標(biāo)本，此外亦有唾液、尿液等其它體液；避免嚴重溶血，否則可能會增加非特異顯色；避免細菌污染，否則會因菌體中內(nèi)源性HRP而產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；避免反復(fù)凍融；血清如有混濁或沉淀，離心或過濾后檢上清第70頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五試劑準(zhǔn)備從冰箱中取出的試劑，待溫度與室溫平衡后使用；所用蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。第71頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五加樣避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。

第72頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五溫育

常采用的溫育溫度有43℃、37℃、室溫和4℃等。溫育所需時間與溫度成反比，即溫育溫度高，則所需時間相對較短。溫育時，微孔板應(yīng)置于水浴（浮于水面）或濕盒中，以使反應(yīng)溶液的溫度迅速與溫室平衡。第73頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五洗板每次溫育后洗板是否徹底，與非特異背景顯色有很大關(guān)系。第74頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五顯色加入底物A和B后，應(yīng)振蕩混勻當(dāng)?shù)孜餅镺PD時，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行

第75頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五比色

加酸終止顯色反應(yīng)后，比色測定前應(yīng)振蕩混勻測定時，要注意酶標(biāo)儀的波長是否已調(diào)至合適比較好的酶標(biāo)儀可選擇單波長或雙波長比色測定，所謂雙波長比色，即在敏感波長（此時對所顯色具最大光吸收）如450nm和非敏感波長（所測得的光吸收為微孔板上的劃痕、污跡以及指紋等所致），最后從儀器得到的讀數(shù)為在敏感波長測得的吸光度與非敏感波長測得的吸光度之差。第76頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五結(jié)果判斷按照試劑盒確定的Cut-off值判斷結(jié)果

ELISA測定的“灰區(qū)”（可疑結(jié)果的含義）

第77頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五定性？定量？定性測定常以“有”或“無”也即“陽性”或“陰性”來表達測定結(jié)果；半定量測定雖介于定性和定量之間，但從嚴格意義上來說，其仍屬于定性測定，只不過其對定性測定中的“陽性”作了進一步的分級，即所謂的強陽性·陽性·弱陽性的區(qū)別；定量測定的結(jié)果則以濃度（如IU/L、ug/L等〕的方式表達。第78頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五定性測定結(jié)果確定的依據(jù)定性測定結(jié)果確定的依據(jù)在于陽性陰性判定值（Cut-off）的建立，Cut-off值的確立應(yīng)盡可能地避免假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。除了Cut-off值以外，還有許多其它的設(shè)值方法以判斷陰性和陽性結(jié)果，如S/N（常稱為P/N）比值（Ratio）等。

第79頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五概念陽性測定能力指數(shù)（DI（＋））可定義為一實驗對陽性標(biāo)本測定后給出陽性結(jié)果的能力（通常稱為“敏感性”）；DI（＋）=[真陽性/（真陽性+假陰性）]×100%

陰性測定能力指數(shù)（DI（－））則為對陰性樣本測定給出陰性結(jié)果的能力（通常稱為“特異性”）；DI（－）=

[真陰性/（真陰性+假陽性）]×100%

第80頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五概念陽性結(jié)果的可靠性（‘預(yù)示值’）即測定為陽性的標(biāo)本實際上為陽性的可能性。

=[真陽性/（真陽性+假陽性）]×100%陰性結(jié)果的可靠性則為一份給出陰性結(jié)果的樣本實際上為陰性的可靠性。

=[真陰性/（真陰性+假陰性）]×100%第81頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五測定結(jié)果的報告和數(shù)據(jù)處理

酶免疫測定數(shù)據(jù)處理報告在理想情況下應(yīng)達到下述要求:(1)易于讓不熟悉該試驗的人所理解;(2)定性測定必須結(jié)果明確,即陽性或陰性、反應(yīng)或不反應(yīng)、在正常范圍內(nèi)或不正常等；（3）定量測定的線性；（4）數(shù)據(jù)的可重復(fù)性；第82頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五定義特異性Specificity真陰性結(jié)果數(shù)真陰性結(jié)果數(shù)+假陽性結(jié)果數(shù)第83頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五定義敏感性Sensitivity真陽性結(jié)果數(shù)真陽性結(jié)果數(shù)+假陰性結(jié)果數(shù)第84頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五定義陽性預(yù)測值（PPV）真陽性結(jié)果數(shù)真陽性結(jié)果數(shù)+假陽性結(jié)果數(shù)第85頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五定義陰性預(yù)測值（NPV）真陰性結(jié)果數(shù)真陰性結(jié)果數(shù)+假陰性結(jié)果數(shù)第86頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五1.不需r-計數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測儀等貴重儀器，

更適用于現(xiàn)場應(yīng)用。

2.沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)的參與，

更加安全。

3.實驗結(jié)果和金標(biāo)探針可以長期保存。

4.自帶質(zhì)控對照，不需其它試劑。

5.由于省去了底物反應(yīng)這一步，因此和EIA相比，時間大

大縮短，簡單快速，可單人份操作。

6.由于操作簡單快速，可用于個人或家庭檢測。一、快速檢測試紙條的優(yōu)勢WT第87頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五

膠體金即金的水溶液，是一種帶負電荷的疏水膠體溶液，顆粒之間由于靜電作用而保持一個穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，可通過還原劑將氯化金分子聚合成特定大小的金顆粒來制備。膠體金通過靜電及其表面的物理特性與多種生物大分子結(jié)合，形成蛋白質(zhì)-金顆粒復(fù)合物，即膠體金探針。特點：1.標(biāo)記是物理吸附過程，對生物大分子的活性沒有影響。

2.可以根據(jù)用途的不同制備不同直徑的膠體金顆粒。

3.膠體金顆粒的大小與檢測的靈敏度和特異性相關(guān)。

4.制備過程簡單，易于控制。WT二、金標(biāo)試紙條原理第88頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五采用化學(xué)還原法，其過程可以認為是一個結(jié)晶過程，顆粒的大小取決于還原劑所致晶核的形成速度和結(jié)晶生長速度。目前主要有以下幾種制備方法：1.硼氫化鈉還原法（2-5nm）

2.白磷還原法（3-12nm）

3.乙醇超聲波還原法（6-10nm）

4.抗壞血酸還原法（10-15nm）

5.檸檬酸三鈉還原法（15-150nm）WT膠體金的制備第89頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五WT膠體金標(biāo)記物的制備1.待標(biāo)記生物大分子的處理：

緩沖液成分、離子強度、pH值、蛋白濃度。

2.膠體金顆粒的標(biāo)記：

標(biāo)記pH值、標(biāo)記濃度、穩(wěn)定劑、稀釋液。3.標(biāo)記物的濃縮純化及儲存：

高速離心、凝膠過濾。第90頁，共100頁，2023年，2月20日，星期五試紙條工作原理在硝酸纖維素膜的檢測線上包被有HIV特異性抗原，對照線上包被有兔抗HIV抗體，另一個HIV特異性抗原在標(biāo)記膠體金后干燥于硝酸纖維素膜下端的玻璃纖維上。當(dāng)樣品由于層析原理流動時，首先溶解干燥的金標(biāo)sAb單抗，特異性HBsAg抗原與其反應(yīng)，在流過檢測線時再和另一個單抗結(jié)合形成免疫復(fù)合物。由于包被單抗被固定在硝酸纖維素膜上，免疫復(fù)合物就被留下，逐漸形成肉眼可見的紅紫色條帶，此時該樣品為陽性。繼續(xù)流動到對照線時，金標(biāo)sAb單抗和羊抗鼠IgG結(jié)合顯色，出現(xiàn)對照帶。當(dāng)樣品中不含HBsAg特異性抗原時，標(biāo)記膠體金的單抗流過對照線時也可和該處的羊抗鼠抗體結(jié)合也可形成紅紫色條帶，導(dǎo)致對照線顯色。WT