放射醫(yī)學(xué)研究所課件

2004.06中式卷煙的生物醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)報(bào)告內(nèi)容發(fā)展中式卷煙的意義

——從吸煙與健康談起中式卷煙的生物醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)

——技術(shù)原理與方法代表性中式卷煙的安全性評(píng)價(jià)舉例

——煙絲添加神農(nóng)液降低卷煙危害——使用SRM生物濾嘴降低卷煙危害

吸煙與健康

——事實(shí)與問(wèn)題1965~1998年間美國(guó)大于18歲公民中吸煙者的比例（按性別）（CDC，MMWR,2000，Vol49,No.39）

事實(shí)1964USSurgeonGeneral報(bào)告吸煙對(duì)健康的不良影響196541%的美國(guó)成年人吸煙1967煙盒上標(biāo)示“吸煙有害健康”1970電視上禁止煙草廣告2000美國(guó)只有25%的成年人吸煙1900~1998年間美國(guó)成年人年均吸煙量煙草中含有大量碳水化合物（占40%~50%），羧酸，色素，萜烯類，鏈烷烴，類脂物質(zhì)，以及一些生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物（如硝酸鹽等）和某些污染物（如農(nóng)藥、重金屬等）吸煙是不完全燃燒過(guò)程，煙草經(jīng)一系列熱分解與熱合成反應(yīng)，產(chǎn)生大量化學(xué)物質(zhì)。據(jù)分析，煙氣中化學(xué)成分共5068種，除煙草中存在的1172種外，3896種是吸煙過(guò)程中產(chǎn)生的新的化學(xué)物質(zhì)——Roberts，1988TobaccoReporter事實(shí)卷煙煙氣的粒相物（如脂肪烴、芳香烴、萜類、羰基化合物、酚類、有機(jī)酸、氮雜環(huán)、亞硝胺、金屬）和氣相物（如氮、氧、CO2、CO、氫、揮發(fā)性烴類、酯類、呋喃類、腈類）中包含多種有害成分，如氣相中的CO、氮氧化物、丙烯醛、揮發(fā)性芳香烴、氫氰酸，粒相中的稠環(huán)芳烴、酚類、煙堿、亞硝胺、雜環(huán)化合物及微量放射性元素，以及氣相與粒相中都存在的自由基等Hoffmannlist：卷煙煙氣存在44種有害成分69種致癌物中（包括一些促癌劑或輔致癌物）NNK最受關(guān)注——HoffmannD：ChemResToxicol2001;14(7):767-9040年吸煙（40支/天）的累積NNK量可致癌——HoffmannD：PrevMed1997;26(4):427-34事實(shí)全世界每年死于與吸煙有關(guān)的疾病人數(shù)達(dá)400萬(wàn)，相當(dāng)于每8秒就有1人死亡。預(yù)計(jì)這一數(shù)字在2020年會(huì)上升到1000萬(wàn)在中國(guó)，平均每天約有3000人死于吸煙——世界衛(wèi)生組織煙草與衛(wèi)生規(guī)劃署《煙草與衛(wèi)生：全球狀況報(bào)告》在美國(guó)，因吸煙引起的死亡，包括母親吸煙所致嬰兒早熟及被動(dòng)吸煙等間接的影響在內(nèi)，每年估計(jì)超過(guò)400000人，約為全部死亡數(shù)的1/5，由此花費(fèi)的醫(yī)療和保健費(fèi)用約1500億美元

美國(guó)每年死于與吸煙有關(guān)的疾病人數(shù)（430,000人）(引自：CDC,MMWR1999;48;131-38)

(1990~1994年間年平均值)事實(shí)1994年美國(guó)與吸煙有關(guān)的疾病死亡情況（引自：CDC，MMWR1997,Vol.48,No.43;993-996）疾病男性女性合并癌癥

肺癌81,17935,741116,920食道癌1,0551,9453,000其他癌癥21,6599,74331,402合計(jì)103,89347,429151,322心血管疾病

高血壓3,2332,1515,450心臟病88,64445,591134,235中風(fēng)14,9788,30323,281其他心血管疾病11,6825,17216,854合計(jì)118,60361,117

179,820呼吸器官疾病

肺炎11,292

7,881

19,173支氣管炎/肺氣腫9,2345,541

14,865慢性阻塞性肺障礙30,38518,579

48,982其他呼吸疾病

787

6681,455合計(jì)

51,788

32,689

84,475嬰兒患病數(shù)1,006705

1,711火災(zāi)死亡人數(shù)

863499

1,362總數(shù)

276,153142,537418,6901995年英國(guó)因吸煙的疾病死亡人數(shù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(引自：HealthEducationAuthority,1998)在英國(guó)，估計(jì)每年有28.4萬(wàn)人因吸煙引起的疾病住院治療，其中死亡人數(shù)約12萬(wàn)人。據(jù)估計(jì)，1950~2000年間，英國(guó)有600萬(wàn)人死于與吸煙有關(guān)的疾病，平均每年死于吸煙的人數(shù)是二戰(zhàn)前的12倍。1995年，英國(guó)死于吸煙的人數(shù)為12.31萬(wàn)人，是交通事故(3444人)、吸毒(2663)、犯罪謀殺(503)、自殺(4379)、愛滋病(195)以及其他意外死亡(8986)的總和（20170）的6倍疾病

死亡百分比死亡人數(shù)男性女性男性女性合并癌癥

肺癌907321,1009,50030,600咽喉癌74471,5004001,900食管癌71622,9001,6004,500膀胱癌48171,7003002,000腎癌415700100800胃癌35101,7003002,000胰癌21256008001,500其他癌癥3472,4005003,000白血病1910200100300合計(jì)

46,600心血管疾病

心臟病231118,7007,60026,400主動(dòng)脈瘤62484,0001,8005,800心肌退化2410300300600動(dòng)脈硬化癥175100100200中風(fēng)1393,4003,9007,300合計(jì)

40,300其他疾病

支氣管炎和肺氣腫867915,1009,30024,400肺炎25115,8004,1009,900胃和十二指腸潰瘍4741100010001,900總計(jì)

81,30041,700123,100吸煙避免死亡

巴金森氏癥

9003001,200子宮肌瘤

100100合計(jì)

9004001,300總數(shù)

80,40041,300121,800吸煙者的“誤區(qū)”停止吸煙會(huì)導(dǎo)致體重增加沒(méi)有直接證據(jù)表明吸煙能導(dǎo)致癌癥肺癌是多因素疾病絕大多數(shù)人都吸煙吸煙的危害遠(yuǎn)沒(méi)有政府宣傳和倡導(dǎo)的那么嚴(yán)重許多重度吸煙者并沒(méi)有得病，且壽命很長(zhǎng)目前市場(chǎng)是的煙焦油量都較低，每天吸煙少于20支應(yīng)該說(shuō)是安全的環(huán)境煙草煙氣對(duì)不吸煙者并沒(méi)有嚴(yán)重的影響問(wèn)題中式卷煙的生物醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)——技術(shù)原理與方法篩選對(duì)煙氣敏感的細(xì)胞系：用于實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞系有數(shù)百種，其中人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)富含P450酶，在無(wú)需代謝活化因子S9時(shí)能轉(zhuǎn)化利用NNK等煙氣中主要有害物質(zhì)研制中的細(xì)胞氣體中毒裝置：細(xì)胞在培養(yǎng)液中染毒，與人類吸煙實(shí)際情況有差別，研制細(xì)胞氣體中毒裝置對(duì)煙氣評(píng)價(jià)意義重大卷煙煙氣毒理學(xué)評(píng)價(jià)動(dòng)物吸煙中毒實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒ⅲ簞?dòng)物在恒氧、恒壓、恒濕、恒溫和煙氣均勻條件下自由吸入卷煙煙氣動(dòng)物吸煙試驗(yàn)煙氣細(xì)胞中毒試驗(yàn)急性毒性評(píng)價(jià)方案急性毒性慢性毒性蓄積毒性生殖毒性免疫毒性增殖死亡氧化損傷膜損傷致突致畸致癌基因毒性煙草煙氣中有數(shù)千種物質(zhì)，單一或數(shù)種有害成分的分析難以全面真實(shí)客觀地反映吸煙的健康影響。卷煙煙氣毒理學(xué)評(píng)價(jià)是以吸煙產(chǎn)生的煙氣做為整體，通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞中毒試驗(yàn)，用毒理學(xué)的方法，對(duì)卷煙煙氣的健康影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)與同品質(zhì)對(duì)照煙比較，檢驗(yàn)降焦減害技術(shù)應(yīng)用于卷煙中提高卷煙安全性的效果。

其他功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其吸煙染毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠和Wistar大鼠是我國(guó)“新藥審批辦法”推薦使用的動(dòng)物。動(dòng)物到達(dá)后，按SOPA034的要求接收。每籠5只，飼養(yǎng)在二級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度30±1℃，濕度60±5%。由獲得資格認(rèn)可的人員飼養(yǎng)。所有動(dòng)物按SOPA035要求檢疫觀察1-3天，在此時(shí)間內(nèi)觀察動(dòng)物的疾病和死亡指征，出現(xiàn)異?，F(xiàn)象需向?qū)ｎ}負(fù)責(zé)人和臨床獸醫(yī)報(bào)告。由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供標(biāo)準(zhǔn)飼料。從動(dòng)物到達(dá)至研究結(jié)束自由攝食。用飲水瓶供應(yīng)消毒自來(lái)水，由動(dòng)物自由飲用。每日沖洗飲水瓶吸煙染毒用吸煙器吸煙，將煙氣導(dǎo)入中毒室（有機(jī)玻璃盒），動(dòng)物在恒氧、恒壓、恒濕、恒溫和煙氣均勻的條件下自由吸入卷煙煙氣，造成動(dòng)物吸煙中毒的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀糜趯?shí)驗(yàn)研究的靶細(xì)胞主要有鼠或人來(lái)源的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞四大類敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞（SHE）優(yōu)點(diǎn)：易獲得，易培養(yǎng)，穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)缺點(diǎn)：敏感性較差，結(jié)果難以外推到人人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）優(yōu)點(diǎn)：敏感性好，與人類接近缺點(diǎn)：難培養(yǎng)，費(fèi)用高將吸煙器抽煙的煙氣，分別經(jīng)過(guò)有機(jī)相（乙酸乙酯）和無(wú)機(jī)相（基本培養(yǎng)液）收集。將有機(jī)溶劑揮發(fā)后，與培養(yǎng)液混合，并將煙氣濃度調(diào)整為1支煙/ml，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，造成細(xì)胞煙氣中毒的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图?xì)胞系及其暴露卷煙煙氣染毒通常急性毒性是指動(dòng)物1d內(nèi)單次或多次染毒后在7~14d中連續(xù)觀察動(dòng)物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況?？紤]到吸煙的實(shí)際情況，在吸煙的急性毒性實(shí)驗(yàn)中，我們采用所有動(dòng)物同時(shí)開始吸煙，連續(xù)染毒，直至全部動(dòng)物死亡為止，觀察動(dòng)物吸煙的反應(yīng)，準(zhǔn)確記錄每只動(dòng)物的死亡時(shí)間和吸煙量，計(jì)算平均活存時(shí)間和平均致死吸煙量，提供以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一只動(dòng)物和最后一只動(dòng)物死亡的時(shí)間和致死吸煙量（即死亡時(shí)間和劑量的范圍）一半動(dòng)物發(fā)生死亡的時(shí)間和吸煙量（T1/2和LD50）對(duì)照煙動(dòng)物全部死亡時(shí)，實(shí)驗(yàn)煙動(dòng)物的活存率必要時(shí)，需對(duì)急性致死動(dòng)物的進(jìn)行病理觀察動(dòng)物暴露卷煙煙氣的急性毒性試驗(yàn)細(xì)胞氧化損傷——活性氧檢測(cè)幾乎所有的環(huán)境有害因素均能通過(guò)直接或間接作用，誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生包括活性氧在內(nèi)的自由基，這一方面是由于外源性化合物的代謝活化，并與其細(xì)胞或基因毒性密切相關(guān)；另一方面是細(xì)胞應(yīng)激性啟動(dòng)抗氧化防御機(jī)制以對(duì)抗外源性有害因素可能導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。細(xì)胞活性氧水平反應(yīng)了細(xì)胞對(duì)外源性有害因素作用時(shí)的毒性應(yīng)答，也就是外源性化合物的毒性細(xì)胞內(nèi)活性氧水平細(xì)胞中，分子探針DCFH-DA和HE可分別與H2O2和O2.—反應(yīng)，生成二氯熒光黃（DCF）和溴乙錠（EB），并產(chǎn)生綠色和紅色熒光，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DCF和/或EB的熒光強(qiáng)度，即可相對(duì)定量細(xì)胞內(nèi)H2O2和O2.—水平細(xì)胞外活性含量過(guò)氧化氫（H2O2）用辣根過(guò)氧化物酶和酚紅捕獲，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；超氧陰離子（O2.—）用細(xì)胞色素C捕獲，通過(guò)測(cè)定吸光度改變進(jìn)行定量；羥自由基（.OH）用番紅花紅捕獲，通過(guò)測(cè)定吸光度改變進(jìn)行定量過(guò)氧化氫細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界的屏蔽，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與物質(zhì)交換的重要功能。有人提出膜損傷是疾病發(fā)生甚至癌變的標(biāo)志。細(xì)胞膜損傷可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)：膜的通透性

乳酸脫氫酶（LDH）是胞漿中的一種常見酶，通常情況下不能透過(guò)細(xì)胞膜外逸，因此，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外LDH的活性，可以評(píng)價(jià)膜通透性的改變膜的結(jié)構(gòu)與功能

腺苷三磷酸酶（ATPase）是細(xì)胞膜上的一種重要酶，負(fù)責(zé)重要離子的主動(dòng)跨膜運(yùn)輸。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞膜ATPase的活性，可以評(píng)價(jià)膜功能性的改變膜的流動(dòng)性

采用熒光偏振法，細(xì)胞經(jīng)DPH熒光探針標(biāo)記后，用熒光分光光度計(jì)測(cè)熒光偏振度。Kex362nm,Kem432nm,狹縫10nm,測(cè)溫25℃細(xì)胞膜損傷長(zhǎng)期毒性（也稱為亞急性毒性、亞慢性毒性、慢性毒性或終生毒性）是指動(dòng)物反復(fù)多次染毒的毒性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，動(dòng)物每天固定時(shí)間吸煙1次，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求控制吸煙時(shí)間和吸煙量，持續(xù)3個(gè)月后活殺一批，余下動(dòng)物繼續(xù)飼養(yǎng)1個(gè)月進(jìn)行恢復(fù)期觀察。分別在吸煙前、吸煙期間的1個(gè)月和2個(gè)月、停止吸煙時(shí)（吸煙后3個(gè)月）、停止吸煙后1個(gè)月（吸煙后4個(gè)月）觀察動(dòng)物體重變化、血液學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，全部處死動(dòng)物，進(jìn)行肺組織病理學(xué)觀察。觀察指標(biāo)包括一般觀察

外觀體征和行為活動(dòng)（如神態(tài)萎靡、倦縮不動(dòng)或過(guò)度興奮、躁動(dòng)驚跳、肌肉麻痹或震顫、步態(tài)異常等），皮毛帖身或稀疏豎散，糞便性狀、顏色，食量及體重變化等血液學(xué)指標(biāo)

紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞細(xì)胞數(shù)，血紅蛋白含量，白細(xì)胞及其分類細(xì)胞數(shù)，血小板計(jì)數(shù)，凝血時(shí)間等血液生化指標(biāo)

天氡氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、總膽紅素（TBIL）、肝酐（CREA）、總膽固醇（TCH）、鈣濃度（CA）等病檢器官

心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、胸腺、睪丸(子宮)、腦、交列腺等的重量及其系數(shù)，以及部分器官的病理學(xué)檢查動(dòng)物暴露卷煙煙氣的慢性毒性試驗(yàn)Hchr11分帶AL細(xì)胞(×400)AL細(xì)胞染色體核型次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HPRT）主要參與嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合途徑，正常細(xì)胞能從頭合成DNA，因此HPRT酶對(duì)細(xì)胞存活繁殖是非必需的，HPRT基因突變后仍能較長(zhǎng)期活存。利用正常細(xì)胞中HPRT酶活性，加入毒性嘌呤類似物6-巰基鳥嘌呤（6-TG）培養(yǎng)，細(xì)胞死亡，而HPRT基因突變的細(xì)胞對(duì)6-TG有抗性而活存，并形成克隆，以此可以檢測(cè)HPRT基因突變?nèi)祟?1號(hào)染色體基因突變分析用人-中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢雜交細(xì)胞（AL細(xì)胞）檢測(cè)人類11號(hào)染色體（Hchr11）基因突變是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、靈敏的檢測(cè)基因突變的實(shí)驗(yàn)方法基因突變細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)化是是細(xì)胞失去原有正常形態(tài)和功能的表型特征，是細(xì)胞癌前病變的重要標(biāo)志，表現(xiàn)在細(xì)胞增殖速度加快（倍增時(shí)間縮短），細(xì)胞間接觸抑制消失（疊層生長(zhǎng)），并具有異種組織的浸潤(rùn)性（轉(zhuǎn)移）。檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力是評(píng)價(jià)外源性化合物致癌性的基本方法動(dòng)物致癌試驗(yàn)

選擇腫瘤易感性高和腫瘤自然發(fā)生率低的純品系動(dòng)物，常用小鼠和大鼠。年齡以剛斷乳為宜，因它們的易感性較高，同時(shí)也可具有較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間。計(jì)算癌瘤發(fā)生率，一般以病理組織診斷為依據(jù)，并與對(duì)照組相比較，以確定致癌的顯著性。確定誘癌潛伏期的長(zhǎng)短以第一例癌瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)間或平均癌瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)間計(jì)。判定癌瘤多發(fā)性，應(yīng)計(jì)數(shù)包括同一機(jī)體內(nèi)發(fā)生兩種或兩種以上類型的腫瘤，或同一臟器、同一系統(tǒng)中出現(xiàn)多個(gè)同類型的癌瘤

致癌試驗(yàn)代表性中式卷煙安全性評(píng)價(jià)舉例——煙絲添加神農(nóng)液降低卷煙危害——使用SRM生物濾嘴降低卷煙危害煙絲添加神農(nóng)液降低卷煙危害的生物醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)——五葉神卷煙試驗(yàn)樣品五葉神品牌卷煙

煙絲中添加2.5‰神農(nóng)萃取液制成的卷煙(編號(hào)205#)同品牌對(duì)照煙

未使用神農(nóng)萃取液的空白煙煙絲添加神農(nóng)液降低卷煙危害對(duì)照煙五葉神煙動(dòng)物數(shù)(只)3030動(dòng)物體重(g)20.072.63

19.922.67

死亡時(shí)間(min)76.25~224.50

211.60~263.93

平均活存時(shí)間(min)180.0142.22

233.0611.57平均致死吸煙量(支)41.249.19

55.232.50

與同品質(zhì)對(duì)照煙比較，吸五葉神煙組，小鼠的平均活存時(shí)間和平均致死吸煙量分別增加了29.4%和34.1%吸煙210min，五葉神煙組小鼠100%存活，而對(duì)照煙組小鼠存活率僅為40%，當(dāng)對(duì)照煙組小鼠全都死亡時(shí)，五葉神煙組小鼠的存活率為高達(dá)86.7%

小鼠吸煙急性致死毒性試驗(yàn)空白煙五葉神淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)1.830.581.000.71*肺泡壁增厚2.500.672.110.60出血2.250.452.780.67*氣管上皮變溥2.170.941.440.73肺囊泡1.920.671.110.78*管周水腫2.170.391.890.60肺損傷總分值

12.831.7510.331.00**n=6,與空白煙比較，*p<0.05,**p<0.005吸煙急性致死小鼠肺組織病理改變空白煙五葉神淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)3.400.552.800.45肺泡壁增厚2.200.451.800.45出血2.600.552.000.00*氣管上皮變溥3.200.841.600.55*肺囊泡2.600.551.600.55*管周水腫3.800.452.800.45*肺損傷總分值

17.800.4512.601.34***n=6,與空白煙比較，*p<0.05,***p<0.001吸煙急性致死大鼠肺組織病理改變小鼠大鼠正常肺組織

對(duì)照煙

五葉神

吸煙急性致死動(dòng)物肺組織病理形態(tài)改變肺組織病理觀察結(jié)果表明，同為吸煙急性致死動(dòng)物，五葉神煙組肺損傷程度明顯減輕，表現(xiàn)在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚、出血、氣管擴(kuò)張、上皮變薄、肺囊泡和管周水腫等多項(xiàng)病理?yè)p傷指標(biāo)均明顯好于對(duì)照煙組五葉神及其對(duì)照煙的細(xì)胞毒性比較五葉神煙誘發(fā)SHE和BEAS-2B細(xì)胞增殖的半數(shù)致死劑量分別是對(duì)照煙的1.7倍和4倍。提示：五葉神煙的細(xì)胞毒性明顯降低不同細(xì)胞系對(duì)卷煙煙氣敏感性不同BEAS-2B細(xì)胞對(duì)空白煙的敏感性約是SHE細(xì)胞的11.5倍；而對(duì)五葉神煙的敏感性僅為SHE細(xì)胞的4.5倍：提示：五葉神卷煙煙氣中能被P450酶活化的有害物質(zhì)降低？

過(guò)氧化氫（H2O2）超氧陰離子（O2.-）五葉神及其對(duì)照煙誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS增高五葉神卷煙誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧經(jīng)氫和超氧陰離子增高的能力分別僅為對(duì)照煙的65%和60%。提示五葉神卷煙對(duì)細(xì)胞的氧化損傷顯著降低。不同種類活性氧對(duì)煙氣的敏感性不同：超氧陰離子的增高為過(guò)氧化氫的2.3倍五葉神煙誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化氫和超氧陰離子含量含量增高分別僅為同品質(zhì)對(duì)照煙的40%和29%，羥自由基含量不僅明顯低于同品質(zhì)對(duì)照煙，而且觀察到對(duì)羥自由基的清除(?)作用。表明五葉神卷煙對(duì)細(xì)胞的氧化損傷顯著降低。五葉神及其對(duì)照煙誘發(fā)細(xì)胞外ROS含量增高五葉神及其對(duì)照煙對(duì)膜通透性影響乳酸脫氫酶（LDH）是胞漿中一種常見酶，通常情況下不能透過(guò)細(xì)胞膜外逸，因此通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外LDH的活性，可以評(píng)價(jià)膜通透性的改變五葉神卷煙誘發(fā)細(xì)胞釋放的LDH活性增高僅為同品質(zhì)對(duì)照煙的36%，表明五葉神卷煙對(duì)細(xì)胞膜損傷顯著降低。五葉神及其對(duì)照煙對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能影響腺苷三磷酸酶（ATPase）是細(xì)胞膜上的一種重要酶，負(fù)責(zé)重要離子的主動(dòng)跨膜運(yùn)輸。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞膜ATPase的活性，可以評(píng)價(jià)膜功能性的改變對(duì)照煙誘發(fā)細(xì)胞膜ATP酶活性的降低程度為五葉神煙的1.5倍，表明五葉神卷煙對(duì)細(xì)胞膜損傷明顯減輕?？侫TPase活性五葉神及其對(duì)照煙對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能影響不同ATP酶活性鈉/鉀-ATP酶鎂-ATP酶鈣-ATP酶鈣/鎂-ATP酶鈣、鎂-ATP酶是對(duì)煙氣敏感的指標(biāo)除鈣-ATP酶外，五葉神煙對(duì)其他ATP酶的損傷作用明顯輕于對(duì)照煙神農(nóng)萃取液含有活化鈉/鉀-ATP酶的活性成分(?)五葉神及其對(duì)照煙對(duì)Hchr11基因突變的影響人類11號(hào)染色體(Hchr11)對(duì)包含單拷貝Hchr11的人-中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢雜交細(xì)胞(AL細(xì)胞)的存活無(wú)明顯影響。利用Hchr11表達(dá)CD59表面抗原的特性，用CD59抗體可以篩選Hchr11基因突變的AL突變細(xì)胞，從而檢測(cè)Hchr11基因突變率。五葉神卷煙誘發(fā)Hchr11基因突變率明顯低于同品質(zhì)對(duì)照煙，提示五葉神煙具有較低的基因毒作用。五葉神及其對(duì)照煙對(duì)HPRT基因突變的影響次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HPRT）對(duì)正常細(xì)胞DNA合成是非必需的，而HPRT基因突變體對(duì)基因毒物6-巰基鳥嘌呤具有抗性，以此可檢測(cè)HPRT基因突變。低劑量時(shí)，五葉神卷煙誘發(fā)HPRT基因突變率與對(duì)照煙無(wú)明顯差異高劑量時(shí)，五葉神卷煙誘發(fā)HPRT基因突變率明顯低于同品質(zhì)對(duì)照煙五葉神及其對(duì)照煙誘發(fā)SHE細(xì)胞轉(zhuǎn)化的比較細(xì)胞轉(zhuǎn)化是細(xì)胞失去原有正常形態(tài)和功能的表型特征，是細(xì)胞癌前病變的重要標(biāo)志。檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力是評(píng)價(jià)外源性化合物致癌性的基本方法。五葉神有2個(gè)連續(xù)劑量組（0.008和0.010）轉(zhuǎn)化率明顯增高，對(duì)照煙有3個(gè)連續(xù)劑量組（0.006、0.008和0.010）轉(zhuǎn)化率明顯增高。相同劑量下五葉神誘發(fā)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯低于對(duì)照煙，誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率增高的能力比對(duì)照煙減少50%。組別咳嗽次數(shù)(次)P值對(duì)照煙3支/d14.7±1.6五葉神煙1支/d14.0±1.7>0.052支/d13.2±2.4>0.053支/d12.3±2.2<0.05復(fù)方甘草合劑20ml/kg/d9.1±1.7<0.001減少氨水刺激小鼠致咳反應(yīng)（治咳）延長(zhǎng)喘息性抽搐潛伏期（平喘）組別潛伏期(min)P值對(duì)照煙3支/d39.6±5.8五葉神煙1支/d41.3±6.6>0.052支/d45.2±9.8>0.053支/d50.6±11.0<0.05陽(yáng)性對(duì)照藥102.7±19.4<0.001組別酚紅排泌量P值對(duì)照煙3支/d0.59±0.027五葉神煙1支/d0.60±0.061>0.052支/d0.63±0.045>0.053支/d0.67±0.065<0.05淑芬氏劑20ml/kg/d0.98±0.18<0.001增加離體氣管酚紅排泌量（祛痰）改善瘀血組織的血液流動(dòng)性組別全血粘度(CP)低切(20S)中切(60S)高切(120S)正常組10.62±1.897.59±1.045.96±0.65對(duì)照煙3支/d15.82±1.5610.32±0.728.06±0.71五葉神煙1支/d15.78±1.4110.14±0.657.82±0.392支/d14.09±2.039.30±1.167.20±0.873支/d13.55±2.219.29±1.287.12±0.85水20ml/kg/d13.12±1.719.15±1.107.16±0.90降低吸煙所致細(xì)胞染色單體交換（SCE）率組別SCE數(shù)范圍/細(xì)胞平均SCE數(shù)/細(xì)胞空白對(duì)照0~84.16±1.50溶劑對(duì)照2~94.28±1.60對(duì)照煙4~116.84±1.57五葉神煙3~95.50±1.73某外煙5~2011.42±3.15組別觀察細(xì)胞數(shù)微核數(shù)微核率空白對(duì)照組10000171.7‰對(duì)照煙組10136403.95‰實(shí)驗(yàn)煙組10075252.48‰陽(yáng)性對(duì)照組1019423523.05‰抑制吸煙所致細(xì)胞微核形成神農(nóng)萃取液應(yīng)用于卷煙中，使小鼠和大鼠吸煙急性死亡的時(shí)間和致死吸煙量分別增加了約60%和30%；特別是當(dāng)吸對(duì)照煙組動(dòng)物全部死亡時(shí)，五葉神煙組動(dòng)物存活率高達(dá)85%以上同為吸煙急性致死動(dòng)物，五葉神煙組肺損傷程度明顯減輕，表現(xiàn)在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚、出血、氣管擴(kuò)張、上皮變薄、肺囊泡和管周水腫等多項(xiàng)病理?yè)p傷指標(biāo)均明顯好于對(duì)照煙組。與同品質(zhì)對(duì)照煙比較，五葉神卷煙的細(xì)胞毒性降低了約2~4倍，誘發(fā)的細(xì)胞氧化損傷、膜損傷、染色體基因突變和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等細(xì)胞生物學(xué)改變均明顯減輕與同品質(zhì)對(duì)照煙比較，五葉神卷煙減少動(dòng)物的刺激性咳嗽反應(yīng)，延長(zhǎng)喘息性抽搐的潛伏期，增加離體氣管酚紅排泌量，改善瘀血的血液流動(dòng)性，降低了吸煙所致染色單體交換率，抑制吸煙所致微核形成結(jié)論使用SRM生物濾嘴降