免疫組化技術(shù)課件

組織化學技術(shù)

組織化學的基本概念：

組織化學：組織水平，對組織內(nèi)存在的各種物質(zhì)進行定性、定量以及其局部的和移動的部位分析的方法

免疫組織化學：基于抗原抗體反應(yīng)酶組織化學疾病的病理學研究概括起來主要在基因和蛋白水平上進行的研究。

免疫組織化學方法主要用于基因蛋白質(zhì)水平表達的研究。蛋白表達=>分布，定位，定量；蛋白表達與與腫瘤生物學行為及預(yù)后關(guān)系等顯示物：酶標反應(yīng)：①堿性磷酸酶（Alkatine

phasphotase,AP）

AP與不同的底物（萘酚As-Mx、快藍、快紅）作用，可形成不同顏色的終產(chǎn)物。用新品紅（Newfuchsine）顯色，可形成不溶于有機溶劑的紅色沉淀，不褪色。

②辣根過氧化酶(Horseradise

peroaidase,)HRP：底物為DAB－四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺，產(chǎn)生棕色沉淀，不溶于有機溶劑，不褪色。HRPAPHE膠體金：指金的水溶膠（以微小粒子分散在水溶液中，免疫電鏡觀察主要方法：直接法：間接法：經(jīng)過了第二抗體放大效應(yīng)PAP法：以過氧化物酶和抗過氧化酶抗體形成復合物，通過第二抗體的橋接與第一抗體結(jié)合，然后以酶底物反應(yīng)檢出。

ABC法：生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）為具有高度親合性的物質(zhì)，一個卵白素分子可結(jié)合4個生物素。當生物素標上特定的標記物質(zhì)后or與抗體結(jié)合后仍能與卵白素結(jié)合，因此，將抗體結(jié)合上生物素，然后與卵白素和帶有特殊標記物的生物素的結(jié)合反應(yīng)，而以適當方式顯示。S-P法（LSAB）：采用生物素標記的第二抗體與鏈霉素生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質(zhì)素（底物）混合液來測定細胞和組織中的抗原。EnvisionⅠ法（二步法）：原理：第二抗體上標記有多聚物酶（HRPorAP）復合物與第一抗體結(jié)合。二抗上的多聚物可結(jié)合許多的HRP分子，使信號有顯著提高，敏感性較PAP法，ABC法高出幾十倍，背景因多聚物葡聚糖是人體內(nèi)不存在，無非特異性干擾，尤其是多聚物酶分子結(jié)合的第二抗體孵育時間短，該方法更省時，簡便。⑥加過氧化物酶標定的鏈菌素親生物素，370C，30min；⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min；⑧用過氧化物酶基質(zhì)液（DAB基質(zhì)液）顯色5－15min。在光鏡下觀察。⑨自來水沖洗，蘇木素淺染，自來水沖洗還藍，梯度酒精脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。免疫組化常見問題的處理：組織材料的處理：固定液為：10%中性福爾馬林液；

4%多聚甲醛磷酸緩沖液（PH7.4）；固定時間：8-24hr組織大小：2*1.5*0.3cm防脫片處理：多聚-L-賴氨酸；硫酸鉻鉀明膠液。合適的抗體稀釋度：

過高，過低均會導致陰性結(jié)果。即用型抗體；濃縮型。減少或消除非特異性染色的方法：非特異性染色：原因：方法：染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細胞或間質(zhì)細胞和間質(zhì)均勻染色或更強顯色定位特定，具有結(jié)構(gòu)性無特定部位，無結(jié)構(gòu)性顯色程度同一部位呈不同程度顯色無分布規(guī)律，某一片均勻著色

免疫組織化學的結(jié)果判斷應(yīng)非常嚴謹，陽性細胞的染色分布有三種類型：胞漿型、細胞核型和細胞膜表面型。陽性細胞顯色深淺可反映出抗原的濃度，并以此作為定性、定量和定位的依據(jù)。陽性細胞的染色常定位于細胞，并于陰性細胞間有明顯間隔，而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞，兩者可顯著區(qū)別。陽性細胞的染色特征：

①陽性細胞的染色分布有三種：

胞漿；細胞核；細胞膜表面②陽性細胞分布：灶性；彌漫性③染色強度不一④切片邊緣，刀痕or組織折疊，壞死，擠壓區(qū)，膠原結(jié)締組織等常表現(xiàn)為相同的陽性染色強度。對于陽性結(jié)果的定量判斷：-，+，++，+++等分級和計數(shù)統(tǒng)計

免疫組化A細胞B細胞D細胞上皮性腫瘤標記上皮膜抗原（EMA）：

廣泛分布于各種正常上皮細胞膜及腫瘤中。癌胚抗原（CEA）：主要存在于胎兒消化道上皮，胰腺以及絕大部分內(nèi)臟癌。

前列腺特異性抗原（PSA）：甲胎蛋白（AFP）：甲狀腺球蛋白（Tg）：軟組織標記軟組織：全身各處的纖維結(jié)締組織，脂肪組織，肌肉組織，滑膜組織及血管淋巴組織。肌動蛋白（Actin）：分布于所有的肌型細胞中肌紅蛋白（Myoglobin）：是骨骼肌肌漿中的一種可溶性蛋白，具有較高組織特異性。內(nèi)皮細胞標記CD34：主要標記內(nèi)皮細胞；亦可用于各種腫瘤間質(zhì)中血管生成的研究。第八因子相關(guān)抗原（Factor-Ⅷ-relatedantigen,FⅧ-RAg）：血管瘤陽性表達程度強于血管肉瘤。CD34優(yōu)于FⅧ-RAg。溶菌酶（Lysozyme）：為組織細胞及其腫瘤的標記物?？挂让拥鞍酌福ˋAcT）：主要用于惡纖組的診斷。

淋巴細胞標記物：白細胞共同抗原（LCA,CD45）：主要分布于T,B細胞，單核細胞，粒細胞表面。CD20：B細胞標記物。CD45RO、CD3：T細胞標記物。CD57：為自然殺傷細胞的標記物。CD38：為漿細胞的標記物。CD68：主要標記各種組織中的巨噬細胞。神經(jīng)內(nèi)分泌標記物：嗜鉻素A（Chromogranin,CgA）：存在于神經(jīng)元，神經(jīng)內(nèi)分泌細胞及其腫瘤中。突觸素（Synaptophysin,Sy）：存在于神經(jīng)元突觸前囊泡膜上，腎上腺髓質(zhì)細胞，神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中。髓磷脂鹼性蛋白（Myelinbasicprotein,MBP）：

激素及激素受體類標記：雄激素受體（Androgenreceptor,AR）：雌激素受體（Estrogenreceptor,ER）孕激素受體（Progesteronereceptor,PR）：垂體激素：ACTH,GH,PRL,LH,TSH主要用于垂體腺瘤的功能分類。降鈣素（Calcitotin,CT）：甲狀腺旁細胞（C細胞）分泌。

以上抗體及標記物主要用于疾病的病理診斷和鑒別診斷其聯(lián)合應(yīng)用的作用和意義：Keratin＋Vimentin－上皮性腫瘤Keratin＋滑膜腫瘤Vimentin＋間皮腫瘤上皮樣肉瘤癌肉瘤Des＋orActin＋肌源性腫瘤CD34＋orFⅧ＋血管性腫瘤Keratin－S-100＋orMBP＋神經(jīng)鞘膜瘤Vimentin＋LCA＋淋巴細胞

AACT＋骨腫瘤、纖維組織細胞腫瘤GFAP＋膠質(zhì)細胞腫瘤

Keratin－NSE＋orSy＋Vimentin－NF－／＋節(jié)細胞神經(jīng)母細胞瘤免疫組化用于病理診斷及鑒別診斷原則：①免疫組化用于病理診斷及鑒別診斷，必須以HE染色的形態(tài)學為基礎(chǔ)，免疫組化只能作為輔助手段。不能把免疫組化染色作為診斷的“金標準”。②免疫組化對良、惡性的判斷僅供參考。③免疫組化用于判斷組織起源，分型，預(yù)后的估計。④免疫組化染色不好或出現(xiàn)相互矛盾的結(jié)果時，以形態(tài)學為準。涂片磨片骨bone電子顯微鏡技術(shù)：透射電鏡透射電鏡掃描電鏡電子顯微鏡技術(shù)透射電鏡掃描電鏡固定：為了盡量保