酶的分離純化課件

Chapter4

TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的分離純化Contentsofchapter41、酶的提取與分離純化技術(shù)路線2、細(xì)胞破碎3、酶的提取4、酶的分離方法5、酶的精制7、酶的濃縮、干燥與結(jié)晶6、電泳技術(shù)4.1酶的分離細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。酶的提取、分離純化技術(shù)路線為何要對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理？發(fā)酵液的基本特性:液相粘度大，多為非牛頓型流體，不易過濾；目標(biāo)產(chǎn)物濃度較低，大多為1-10%，成分復(fù)雜,菌絲體、代謝產(chǎn)物、培養(yǎng)基影響提取4.1.1發(fā)酵液預(yù)處理固液分離方法:過濾、離心、膜分離對于細(xì)菌及某些放線菌，菌體細(xì)小，液體粘度大，不能直接過濾，若用高速離心，能耗很大，設(shè)備昂貴。若用膜分離技術(shù)（如微濾）易產(chǎn)生膜污染，通量降低。發(fā)酵液中由于菌體自溶，核酸、蛋白質(zhì)及其它有機(jī)粘性物質(zhì)的存在也會影響固液分離。因而尋找一種經(jīng)濟(jì)有效的方法來提高固液分離速度顯得十分必要。預(yù)處理的目的:改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，提高固液分離的效率。預(yù)處理的過程發(fā)酵液雜質(zhì)的去除蛋白質(zhì)無機(jī)離子色素培養(yǎng)液處理性能的改善降低黏度調(diào)節(jié)pH值和溫度絮凝與凝聚（3）色素及其它物質(zhì)的去除：活性炭、大孔吸附樹脂、離子交換樹脂等2.發(fā)酵液的固液分離（轉(zhuǎn)鼓式真空吸濾機(jī)、離心、半框壓濾機(jī)）（1）影響發(fā)酵液過濾的因素

a.菌種

b.培養(yǎng)基成分（2）提高過濾性能的方法凝聚、絮凝、稀釋、加熱、助濾劑等細(xì)胞結(jié)構(gòu)與酶分布4.1.2細(xì)胞破碎（一）細(xì)胞壁組成

細(xì)胞壁的主要成分：細(xì)菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸)

酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)真菌:多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖）

細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)

酵母菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)

M—甘露聚糖；P—磷酸二酯鍵；G—葡聚糖

（一）細(xì)胞破碎方法

許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。

1）機(jī)械破碎

2）物理破碎

3）化學(xué)破碎

4）酶解破碎JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型電動玻璃勻漿機(jī)細(xì)胞對破碎方法的敏感性細(xì)胞聲波機(jī)械滲透壓凍融————————————————————動植物++++++++++++革蘭氏陰性菌++++++++革蘭氏陽性芽孢菌

++++++酵母++++革蘭氏陽性球菌+-++菌絲-++-++孢子

----（三）細(xì)胞破碎確認(rèn)

1.直接測定破碎前后的細(xì)胞數(shù)：破碎前，用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)；破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。2.測定導(dǎo)電率：利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測定破碎程度。3.測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力：測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。

把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。提取目標(biāo):(a)將目的酶最大限度地溶解出來;(b)保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（0~10℃）操作。提取原則；相似相溶；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。4.1.3酶的提取(extraction)

提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。

為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇Ｒ话阏f來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。4.1.4酶的分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、萃取分離4、過濾與膜分離5、層析分離6、電泳分離1、沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀觯还爬?、?shí)用、簡單的初步分離方法。（1）鹽析沉淀法（改變離子強(qiáng)度）a:基本原理（鹽溶和鹽析）

向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：

1)鹽溶（saltingin）：低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。

2)鹽析（saltingout）：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。

原因：高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域

1）中性鹽的選擇常用（NH4）2SO4，其突出優(yōu)點(diǎn)：溶解度大分離效果好不易引起變性價格便宜b.鹽析用鹽2)鹽濃度的表示用飽和（溶解）度表示:

溶液中飽和硫酸銨的體積飽和度＝溶液的總體積3)調(diào)整鹽濃度的方式飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不太高時。配制飽和硫酸銨溶液所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計(jì)算：

S2-S1V=V0————1-S2式中V,V0——分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積S2,S1——分別為所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度添加固體硫酸銨適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達(dá)到的鹽濃度又很高時。按下式計(jì)算，得表中數(shù)據(jù)

B(S2-S1)W=——————1-AS2A,B——常數(shù)，與溫度有關(guān)。實(shí)際使用時，可直接查表（各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表鹽析操作低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過40％。高飽和度：固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積。1）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。2）冰箱中（4℃）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。3）沉淀再溶解后可用超濾（ultrafiltration）、透析（dialysis）或?qū)游觯╟hromatography）方法脫鹽。

鹽析曲線的制作

如要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力

102030405060708090100硫銨飽和度％

硫酸銨濃度（%）枯草桿菌-淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線

鹽析的影響因素1)離子強(qiáng)度和種類（介紹鹽析常數(shù)）蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系：I：離子強(qiáng)度，I=∑MZ2；M：離子濃度（mol/L）；

Z：離子價數(shù)S：離子強(qiáng)度為I時的蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）S0：離子強(qiáng)度為0時蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）Ks：鹽析常數(shù)，是與蛋白質(zhì)和鹽種類有關(guān)的特性常數(shù)。

Ks代表鹽析效率，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，Ks越大鹽析效果越好。

當(dāng)溫度一定時，S0對于某一溶質(zhì)是常數(shù)，用β表示，鹽析方程式可改寫為：

logS=β-KsI

兩種鹽析法：Ks分級鹽析法：在一定的pH和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì)Ks的不同，通過改變離子強(qiáng)度或鹽濃度（即改變I值）的沉淀方法。β分級鹽析法：在一定離子強(qiáng)度下，通過改變?nèi)芤旱膒H及溫度的沉淀方法。2)蛋白質(zhì)濃度：過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，2.5%-3%最好。3)pH值：等電點(diǎn)處最易沉淀。4)溫度的影響：稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。一般可在室溫下進(jìn)行。某些對溫度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。（2）有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）

利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。1)沉淀機(jī)理

降低溶液的介電常數(shù)部分地引起蛋白質(zhì)脫水2)常用有機(jī)溶劑丙酮乙醇甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為70%。

3)優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：1）分辨率比鹽析法高

2）沉淀不需脫鹽3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心缺點(diǎn)：1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活2)有機(jī)溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。

4)影響有機(jī)溶劑沉淀的因素溫度：低溫（0℃）操作。

pH值：盡可能靠近其等電點(diǎn)。離子強(qiáng)度：采用<0.05mol/L的稀鹽溶液增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度目的:防止蛋白質(zhì)變性（4）蛋白質(zhì)濃度：適當(dāng)，一般為5?20mg/ml（3）等電點(diǎn)沉淀(isoelectricprecipitation)原理蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)使用方法單獨(dú)使用較少（用于從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機(jī)溶劑法），因蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時仍有一定的溶解度。優(yōu)點(diǎn)：

1)

大多數(shù)蛋白質(zhì)的pI都在偏酸性范圍內(nèi)2）無機(jī)酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低3）無需除掉多余酸即可進(jìn)行下一步純化缺點(diǎn)：

酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活

（4）有機(jī)聚合物沉淀法

作用機(jī)理：與有機(jī)溶劑類似，是發(fā)展較快的一種新方法。沉淀劑：常用聚乙二醇（Polyethyeneglycol，簡寫PEG）多用分子量為6000～20000的PEG。優(yōu)點(diǎn)：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當(dāng)多的生物大分子。③沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。（5）選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。

1)熱變性幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。

2)pH變性等電點(diǎn)沉淀法是pH變性法中的一種變體。

3)有機(jī)溶劑變性使那些對有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。2、離心分離

離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。（1）基本原理離心力

Fc=mac

＝mr

ω2

＝mr

（2N/60）2

N為離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（r/min）；

Fc通常以相對離心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字g）表示。RCF=mr

（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r

此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系旋轉(zhuǎn)半徑用r平均代替

r平均=1/2（r大+r?。ヽm

通常：低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000r/min。高速離心（超速），常以相對離心力（RCF）表示，如：65000g。兩者可換算或查測算圖。計(jì)算近似RCF的列線圖

沉降系數(shù):（sedimentationconstant）

指單位離心力下顆粒的沉降速度（sedimentationvelocity）,用S表示。由于許多生物大分子的S值很小，所以定義1013s

為一個沉降單位，1S=11013s。

常用S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在1~200之間。

（2）離心機(jī)的種類按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同，分為：常速（低速）高速超高速

離心機(jī)的種類

實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)溫度類型：常溫及冷凍超速離心機(jī)均為冷凍型。使用冷凍離心機(jī)時提前降溫，預(yù)冷離心頭。使用超速離心機(jī)時先抽真空。離心的形式角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式由低速到超速均有。角式離心機(jī)和離心頭（轉(zhuǎn)子）角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。離心機(jī)的大?。郝涞厥郊芭_式小臺式離心機(jī)離心管材質(zhì)：玻璃，塑料強(qiáng)度：和離心速度相配大?。汉娃D(zhuǎn)子配套高速超速管要加蓋離心機(jī)操作平衡、定溫、定速、定時。（3）常用離心方法

差速離心法沉降速度法密度梯度離心沉降平衡法等密度梯度離心

差速離心

（differentialcentrifugation）

采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡單。缺點(diǎn)：1）分離效果較差，不能一次得到純顆粒。

2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。

3）沉降的顆粒受到擠壓。

差速離心分離示意圖

（a）離心前的懸浮液（b）～（e）離心不同時間后顆粒的沉降情況

密度梯度離心

（densitygradientcentrifugation）

樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。

常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。特點(diǎn)：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。

密度梯度離心示意圖

（a）離心前（b）離心后

Densitygradientultracentrifugation密度梯度離心

步驟：A.形成密度梯度B.加樣C.離心D.收集樣品

等密度梯度離心

又稱沉降平衡離心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根據(jù)顆粒的密度不同而進(jìn)行分離。離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達(dá)到與其相同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。常用氯化銫（CsCl）作為梯度介質(zhì)。特點(diǎn)：

介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。

等密度梯度離心示意圖

（a）離心前；（b）離心后

沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn)總結(jié)：等密度梯度離心是一種測定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。差速離心是一種動力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。密度梯度離心兼有以上兩種方法的特點(diǎn)，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。（4）應(yīng)用根據(jù)不同離心目的，分為制備性離心：分離純化和制備分析性離心：

測分子量、沉降系數(shù)、密度、純度4.過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)

（1）擴(kuò)散膜分離

——透析（dialysis）溶質(zhì)分子Y從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動蛋白質(zhì)透析a.透析膜

商品透析膜大多制成管狀。材料：纖維素衍生物。1）透析膜的預(yù)處理：目的：除雜質(zhì)。

2）透析袋的保存：防腐劑＋冷藏。b.透析方法及裝置

透析袋透析簡單裝置。A:透析夾，B:透析，C:透析示意圖

（2）加壓膜分離

根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為：微濾(Microfiltration，MF)

一種靜態(tài)過濾，隨過濾時間延長，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；超濾(ultrafiltration，UF)

一種動態(tài)過程，由泵提供推動力，在膜表面產(chǎn)生兩個分力：一個是垂直于膜面的法向分力，使水分子透過膜面，另一個是于膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。

超濾原理的示意圖

利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法。超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。常規(guī)過濾(A)和超濾(B)的示意圖

AB圖4-61

超濾濃縮裝置

反滲透（Reverseosmosis，RO）

利用反滲透膜選擇性地只能透過溶劑(通常是水)的性質(zhì)，對溶液施加壓力，使溶劑通過反滲透膜而從溶液中分離出來的過程。滲透與反滲透（3）電場膜分離a.電滲析：在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負(fù)電極。b.離子交換膜電滲析：用離子交換膜代替一般的半透膜。應(yīng)用：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。5.層析法層析法也稱色譜法，是1903年俄國植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過裝有CaCO3吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。

色譜起源色譜組分色素石油醚碳酸鈣顆粒

用色彩（chroma）和圖譜（graphs）組成色譜一詞（Chromatography)。層析法的基本原理

利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在流動相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。mobilephase：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體stationaryphase：靜止不動的一相層析法的分類

流動相有兩種狀態(tài)：*液體作為流動相*氣體作為流動相

固定相也有兩種狀態(tài)：*固體吸附劑作為固定相*以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的狀態(tài)分類：液相層析液-固層析液-液層析氣相層析氣-固層析氣-液層析按層析過程的機(jī)理分類：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異。分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。

按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達(dá)到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。ColumnChromatography

層析柱的制備與層析操作

柱層析的設(shè)備:

層析柱、蠕動泵（恒流泵）、紫外檢測儀、部分收集器、梯度洗脫器。層析設(shè)備層析裝置：梯度混和器蠕動泵層析柱監(jiān)測儀記錄儀收集器

記錄儀低溫層析柜層析操作分離前：1）樹脂預(yù)處理：凝膠溶漲。離子交換纖維素需作酸堿處理。2）裝柱：重力沉降法，要求均勻，無氣泡。3）平衡：層析柱使用前，須用緩沖液平衡至所需的pH值和離子強(qiáng)度。層析操作分離中：上樣：體積盡可能小。平衡：用緩沖液使不被吸附的雜蛋白穿過。洗脫：連續(xù)梯度洗脫：連續(xù)改變緩沖液的pH或離子強(qiáng)度。階梯式梯度洗脫：分段地改變緩沖液的pH或離子強(qiáng)度。等溫平衡洗脫：用平衡緩沖液直接進(jìn)行擴(kuò)展洗脫。同時進(jìn)行分步收集和檢測。

分離后：再生，平衡，保存。蛋白質(zhì)定量-——分光比色儀(A280)法蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基（主要是色氨酸Trp和酪氨酸Tyr的共軛雙鍵）對紫外光有吸收，以色氨酸吸收最強(qiáng)，最大吸收峰為280nm。在波長280nm具有吸光的氨基酸分光比色儀裝置圖紫外吸收法平衡、吸附鹽梯度沖洗分管收集蛋白測定制圖測A280（1）吸附層析（adsorptionchromatography）

a.原理利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進(jìn)行分離。吸附作用的強(qiáng)弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。吸附層析的關(guān)鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇。b.吸附劑

吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。1）吸附劑的選擇：根據(jù)吸附能力強(qiáng)弱分為：弱吸附劑：蔗糖、淀粉中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等強(qiáng)吸附劑：氧化鋁、活性炭吸附劑的選擇根據(jù)相似相溶原則：極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。但為了便于解吸附，對于極性強(qiáng)的物質(zhì)通常選用極性弱的吸附劑進(jìn)行吸附。

2）吸附劑的性質(zhì)：活性炭：常用的吸附介質(zhì)。硅膠：常用的極性吸附介質(zhì)。羥基磷灰石（HA）

[Ca10(PO4)6.(OH)2]:

微晶型的磷酸鈣制品，表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團(tuán)；酸性和中性蛋白質(zhì)可與Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與PO43-結(jié)合。吸附原理是HA的Ca2+與蛋白質(zhì)的負(fù)電荷基團(tuán)作用。

c.洗脫劑要求：

粘度小，純度高，穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要分離的成分,易與目標(biāo)分子分離。選擇：

具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動相。生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。d.應(yīng)用

分離純化生物大分子（2）凝膠過濾層析

凝膠過濾（gelfiltration）又稱分子篩層析（molecularsievechromatography）、排阻層析（exclusionchromatography）,是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的分子量不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。a.基本原理

大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長而后流出層析柱。Size-exclusionchromatography凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Kd表示：

Ve-VoKd=————ViVo——外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi——內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ml）Ve——某組分的洗脫體積，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（ml）凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰Ⅰ.Kd=0時,即Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1時,即Ve=Vo+Vi，說明該組分能進(jìn)入凝膠的全部內(nèi)空隙，最后流出。Ⅲ.其它組分0<Kd<1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。

分配系數(shù)Kd的意義：1)可定量地衡量各組分的流出順序。2)判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，

Kd差異小，分離效果差。b.凝膠的種類和性質(zhì)

1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（dextrangel)

商品名:Sephadex

型號

SephadexG－10至G-200G后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。

葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù)

2）瓊脂糖凝膠（agarosegel)

商品名:Sepharose（瑞典）;Bio-GelA(美國）依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。Sepharose及Bio-gelA型號

3）聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）

商品名為Bio-Gel,型號從Bio-GelP－2至P-300，P值越大，孔徑也越大。以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。c.操作：1）凝膠的選擇和處理根據(jù)相對分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號的凝膠介質(zhì)。將干膠懸浮于5~10倍的蒸餾水中，充分溶脹，抽氣，裝柱。2）柱的選擇采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速。3）加樣體積不能過多，不超過床體積的5％，脫鹽時可在10％左右。4）洗脫洗脫液與平衡時用的buffer一致。洗速不可過快，保持恒速。5）膠的保存洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。用0.02%NaN3防腐。d.應(yīng)用

1）脫鹽２)生物大分子物質(zhì)的分離純化

3）分子量的測定

4）溶液濃縮LogMABCLogM測V測LogM=k1-k2Ve（Ve為洗脫體積）

先測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。蛋白質(zhì)的洗脫體積與其分子量有關(guān)（3）離子交換層析

（ionexchangechromatography，IEC）a.原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。1）離子交換劑：離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。

如羧甲基纖維素離子交換劑組成纖維素—O—CH2—COO-—Na+

載體電荷基團(tuán)反離子

化學(xué)原料合成：樹脂類物質(zhì)載體

天然材料制成：cellulosesephadexsepharose

陽離子交換劑:電荷基團(tuán)（－）,反離子（＋）電荷基團(tuán)陰離子交換劑:電荷基團(tuán)（＋）,反離子（－）

如：DEAE-纖維素，CM-Sepharose離子交換劑--帶有電荷基團(tuán)的不溶性載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-載體Diethylaminoethyl(DEAE)

陰離子交換劑(可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì))

陽離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質(zhì))兩種離子交換劑陰離子交換劑：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基陽離子交換劑：常用羧甲基CM—CH2COO－

磺丙基SP—C3H6SO3－DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3

離子交換葡聚糖

以SephadexG-25,G-50為骨架，接入離子交換基團(tuán)。

DEAE（QAE）SephadexA-25，A-50CM（SP）SephadexC-25，C-50

A：anion陰離子

C:cation陽離子離子交換葡聚糖

離子交換劑的選擇a.強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇：強(qiáng)型：適用的pH范圍廣，制備無離子水

弱型：適用的pH范圍窄，分離生物大分子物質(zhì)

b.陰、陽離子交換劑的選擇：酶的穩(wěn)定性若<pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶正電荷，用陽離子交換劑若>pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑2）蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)pH值如何影響蛋白質(zhì)的電荷數(shù)24681012140系統(tǒng)pH+

蛋白質(zhì)帶正電荷

蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷等電點(diǎn)-

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理利用不同的蛋白質(zhì)分子在溶液中所帶電荷不同，因而與離子交換劑有不同吸附力而分離。pH6.0pI>6.0蛋白質(zhì)帶正電pI<6.0蛋白質(zhì)帶負(fù)電b.陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)的過程平衡吸附去吸附分離結(jié)束再生+低鹽高鹽利用不同鹽濃度將不同蛋白質(zhì)洗脫下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Ion-exchangechromatographyc.操作平衡上樣平衡洗脫再生1）上樣：上樣體積不十分嚴(yán)格。2）洗脫:

增加溶液的離子強(qiáng)度

梯度洗脫法

改變?nèi)芤旱膒H值

3）再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl處理。4.應(yīng)用制備純化生物大分子圖4-39梯度溶液的制備方法和洗脫曲線（a）線性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）編程梯度（4）疏水層析（HydrophobicInteractionChromatography,HIC）從分離純化的機(jī)制看，屬吸附層析類。利用疏水層析介質(zhì)和蛋白質(zhì)分子都具有一定的疏水性質(zhì)，根據(jù)被分離成分與固定相之間疏水力大小的不同而進(jìn)行分離。

大多數(shù)蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的親水性，但分子內(nèi)部存在一個疏水核心，欲讓蛋白質(zhì)與疏水性固定相結(jié)合在一起，可以靠蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)丁（hydrophobicpatch），或讓蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性（可逆），暴露出掩藏于分子內(nèi)的疏水性殘基。a.原理:

在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)發(fā)生局部可逆變性，被迫與疏水層析的固定相結(jié)合在一起，然后通過降低流動相的離子強(qiáng)度，即可將結(jié)合于固定相的蛋白質(zhì)，按其結(jié)合力大小，依次進(jìn)行解吸附。b.吸附劑

親水性（如Sepharose）基質(zhì)固定相疏水性（如硅膠、樹脂）配體（疏水性基團(tuán)）（苯基、辛基、烷基）

一些商品疏水層析介質(zhì)

c.操作1）加樣：樣品溶液中補(bǔ)加適量的鹽。2）洗脫：用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。3）再生：除去固定相吸附的雜質(zhì)，用水或

8mol/L脲素溶液。4.應(yīng)用主要用于分離純化大分子物質(zhì)。

（5）親和層析(AffinityChromatography)

由吸附層析發(fā)展起來的，是從復(fù)雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。又稱：功能層析（functionchromatography）生物專一吸附（biospecificadsorption）選擇層析（selectivechromatography）a.原理

利用生物大分子間特異的親和力來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補(bǔ)的DNA等。

將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附，從層析柱流出，變換洗脫條件，即可將欲分離的物質(zhì)洗脫下來，實(shí)現(xiàn)分離提純。+CCC配基蛋白質(zhì)1.配基固相化2.親和吸附固體載體3.解吸附Affinitychromatographyb.基質(zhì)的選擇理想的基質(zhì)應(yīng)滿足以下要求：①高度的親水性。②極低的非特異性吸附性（惰性）。③具有足夠的化學(xué)基團(tuán)。④適當(dāng)?shù)亩嗫仔?。⑤較好的理化穩(wěn)定性?？杀粦?yīng)用的基質(zhì)（載體）：（按性能優(yōu)劣排序）瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。最常用的是瓊脂糖，Sepharose1B到10Bc.配體的選擇一對可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。如抑制劑，底物，抗體，輔酶等。

優(yōu)良配體須具備的條件：1）與待純化的物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力。2）具有與基質(zhì)共價結(jié)合的基團(tuán)。

目的產(chǎn)物與相應(yīng)的配基

d.偶聯(lián)（親和吸附劑的制備）配體一定，改造載體（基質(zhì)）1）基質(zhì)活化：不同的載體活化需要不同的活化劑。常用：溴化氰（CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr作用于葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基2）引入連接臂（spacearm）

又稱手臂（spacer）“接臂”的目的：克服影響配基與生物大分子的結(jié)合的空間障礙。“接臂”的途徑：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前帶有各種手臂的系列載體已有商品供應(yīng)。如：AH-Sepharose4B常用手臂e.操作：1）層析前：制備親和層析劑

選擇根據(jù)欲分離物質(zhì)特性配基選擇根據(jù)配基分子大小及基團(tuán)特性載體2）洗脫：能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。包括：非專一性洗脫和專一性洗脫偶聯(lián)親和層析劑非專一性洗脫：改變溫度改變pH值改變離子強(qiáng)度專一性洗脫：競爭性洗脫劑（半抗原、抑制劑、底物類似物）被吸附物質(zhì)結(jié)合競爭性地與配體結(jié)合f.應(yīng)用1)純化大分子物質(zhì)如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)），Lectin-Sepharose4B2)研究酶的結(jié)構(gòu)與功能：分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質(zhì)。6.電泳電泳（electrophoresis,EP）：

指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動的過程。電泳技術(shù)是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進(jìn)行分離的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。一、電泳的基本理論

1.原理:在一定pH條件下（用buffer），不同大小、形狀及帶電顆粒在電場中的移動速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。

+-

遷移率與內(nèi)在特性和外界條件有關(guān)內(nèi)在特性：顆粒性質(zhì)（凈電荷量，顆粒大小、形狀）外界條件：電場強(qiáng)度、溶液性質(zhì)、支持體特性

將帶凈電荷Q的粒子放入電場，受到的電引力為：F引=EQ

在溶液中,運(yùn)動粒子與溶液之間存在阻力F阻

F阻=6πrηV當(dāng)F引=F阻時EQ=6πrηVEQV=6πrη

影響遷移率的因素：1）顆粒性質(zhì)：

Q越大、r越小、形狀越接近球形，v越快。2）電場強(qiáng)度：E越高，v越快。3）溶液性質(zhì)：

pH值：離pI越遠(yuǎn)，v越快。（用buffer保持恒定）離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高，v越低。原因：離子氛（ionicatmosphere）。通常，緩沖液離子強(qiáng)度在0.02-0.2之間。4）電滲：在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。自由界面電泳：又稱移動界面電泳（movingboundaryelectrophoresis,MBEP），指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。區(qū)帶電泳:（zoneelectrophoresis,ZEP）指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用:防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散。2.電泳的分類按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。

③瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。④聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。

3.電泳常用設(shè)備

（1）電泳儀：為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置。

常壓電泳儀（600V）

高壓電泳儀（3000V）

超高壓電泳儀（30000V～50000V）（2）電泳槽：

自由界面電泳槽管狀電泳槽板狀電泳槽（3）附屬設(shè)備：

水平板式電泳槽垂直板式電泳槽二、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。

1.原理

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑和加速劑作用下聚合的。CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：1）化學(xué)催化系統(tǒng)：AP-TEMED

催化劑：過硫酸銨（ammoniumpersulfate，AP）加速劑：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光－（TEMED）催化劑:核黃素（維生素B2）

引發(fā)劑:光

TEMED的存在，可加速聚合。.聚丙烯酰胺凝膠：丙烯酰胺＋N,N’－甲叉雙丙烯酰胺聚合而成凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性和透明度粘著度取決于凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）。

T=

C=凝膠濃度越大（?。?，孔徑越小（大），可分離分子量較小（大）的顆粒。Acr與Bis的重量比應(yīng)在30左右。

凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系A(chǔ)cr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表2.分離效應(yīng)

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為：連續(xù)電泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系電荷效應(yīng)不連續(xù)PAGE分子篩效應(yīng)濃縮效應(yīng)

連續(xù)PAGE1）電荷效應(yīng):

分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。2）分子篩效應(yīng)：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。3）濃縮效應(yīng)：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：

1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

3.在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。因此，在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，提高了分辨率。8.38.38.96.7聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品緩沖液pH6.7(2)濃縮膠pH6.7

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

三、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）簡稱SDS－PAGE。是目前測定蛋白質(zhì)亞基相對分子量（relativemolecularmass,Mr）的一種最好的辦法。

SDSseparatesproteinsbyMW1.原理：

SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。

SDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，巰基乙醇使二硫鍵打開，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm），長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。因此，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物(SDS-denaturedprotein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。

兩者關(guān)系：蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：遷移率；k、b均為常數(shù)將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)其相對遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。2.操作：（SDS及PAGE，即變性及非變性）1）制膠:

（變性：buffer中加0.4%SDS）

a.分離膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇一定濃度的分離膠（查表），配制分離膠溶液：

Acr:Bis=29:1，分離膠buffer,TEMED,AP,水迅速倒膠，加水使液面平坦，室溫0.5h聚合完全。

b.濃縮膠：用濃縮膠buffer。插上梳子。2）樣品制備：

a.PAGE:樣品＋樣品緩沖液（蔗糖或甘油＋指示劑溴酚藍(lán)）

b.SDS:樣品＋樣品緩沖液（SDS，甘油，巰基乙醇，溴酚藍(lán)），煮沸2~5min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。3）加樣及電泳：

SDS:電極buffer中加0.1%SDS，溴酚藍(lán)距下端1cm時停止電泳。4）固定及染色a.固定：將凝膠浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸中固定蛋白質(zhì)組分。b.染色：

考馬斯亮藍(lán)染色法

銀染法（靈敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿爾辛藍(lán)，過碘酸－Schiff試劑（糖蛋白）。四、等電聚焦(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)的特性，以聚丙烯酰胺為電泳支持物，在其中加入載體兩性電解質(zhì)（商品名：Ampholine，一種含有各種連續(xù)

pI的小分子混合物）的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（IEF）。1.原理

兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時不再泳動，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足夠的緩沖能力——以便保持穩(wěn)定的pH梯度。(2)導(dǎo)電性能好——以保持電場強(qiáng)度的均勻性。(3)分子量小——電泳后易分離除去。(4)化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)——不干擾測定。等電聚焦電泳2.操作：

1）凝膠配制：凝膠濃度T為5％~7.5％（C=3%

左右）

2）加樣：任意位置

3）電泳：陽極：磷酸溶液電極溶液陰極：NaOH溶液只有在凝膠兩端給予高電壓（600V）時，才能獲得較好的分辨率。而高電壓的維持需要有效的凝膠冷卻系統(tǒng)。4）固定及染色：TCA固定，考馬斯亮藍(lán)染色。5）等電點(diǎn)測定：

Marker與未知樣品同時電泳染色后，以pH值為縱軸，距陰極距離為橫軸，做pH梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)未知蛋白遷移距離可推知pI。IEF測定蛋白質(zhì)pI3.應(yīng)用：蛋白質(zhì)的分離純化測等電點(diǎn)電泳：帶電粒子在電場中向著與其本身電荷相反的電極移動的過程。電泳技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好電泳方法分類按電場分：常壓（<500V，適用大分子）、高壓（>500V，適用小分子）支持體分：自由電泳、區(qū)帶電泳儀器裝置分：水平式、垂直式、懸架式電泳條件：水溶液（緩沖液）、支持物（區(qū)帶電泳）、電場（電泳儀、電泳槽）5、電泳分離電泳的簡單原理蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H+濃度或與其它大分子的相互作用。帶電粒子在電場中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小和形狀、分子所帶電荷或分子的生物學(xué)與化學(xué)特性。雙相電泳第一相等電聚焦第二相SDS－PAGE目的：為了獲得更詳細(xì)的組分信息目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組研究中

由O’Farrel等1975年建立的雙向電泳技術(shù)是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離與展示的分離技術(shù)，一般能分離1000–3000個蛋白質(zhì)點(diǎn)，最好的膠能分離得到11000個左右的蛋白質(zhì)點(diǎn)。

第一向進(jìn)行等電聚焦（isoelectricfocusing,IEF）,由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點(diǎn)特性，將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進(jìn)行電泳時，會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。移動過程中，蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子，并隨著移動的進(jìn)行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當(dāng)?shù)鞍走w移至其等電點(diǎn)pH位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動。當(dāng)?shù)鞍讛U(kuò)散到低于其等電點(diǎn)pH區(qū)域時，帶正電荷，在電場的影響下重新向陰極移動。同樣，如果蛋白質(zhì)擴(kuò)散到高于其等電點(diǎn)的pH區(qū)域時，則帶負(fù)電，在電場的作用下會向陽極移動。根據(jù)各自不同的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個很窄的pH梯度介質(zhì)區(qū)域內(nèi)。目前常使用預(yù)制膠條（IPG）用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的IPG膠條在含有SDS的緩沖液中平衡。第二向是將在IPG膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到SDS凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對質(zhì)量或分子量（MW）大小與第一向相垂直的分離。沿垂直的方向進(jìn)行SDS電泳，按分子量大小進(jìn)行分離。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后，得到等電點(diǎn)和分子量的信息。7

酶的濃縮、干燥與結(jié)晶一、酶的濃縮

(一)蒸發(fā)濃縮

圖4-60減壓蒸發(fā)濃縮的簡易裝置1蒸餾瓶2毛細(xì)管3螺旋夾4橡皮管5溫度計(jì)6出水口7冷凝器8進(jìn)水口9連接管10抽氣口11接收瓶（二）

超濾濃縮

超濾(ultrafiltration)濃縮以壓力差為動力，將待濃縮溶液通過超濾膜，酶分子較大被滯留，水分子和小分子選擇性透過，達(dá)到濃縮目的。圖4-61

酶的超濾濃縮

（三）吸水劑

1.膠過濾濃縮：

利用葡聚糖凝膠SephadexG-25或G-50等的吸水特性。將干膠直接加入樣品溶液，吸水膨潤后，再過濾或離心分出濃縮的酶液。2.聚乙二醇濃縮：聚乙二醇（polyethyleneglycol），簡稱PEG。

利用PEG的吸水特性。將PEG涂于裝有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和鹽類，酶溶液即被濃縮。一般用分子量大的PEG,如PEG6,000和PEG20,000，以防止PEG進(jìn)入蛋白質(zhì)溶液。（四）反復(fù)凍融濃縮利用酶溶液相對于純水冰點(diǎn)較低的原理使酶分子與小分子物質(zhì)分離。

（五）沉淀法鹽析法，有機(jī)溶劑法二、酶的干燥

酶的干燥多采用冷凍干燥法。

將酶溶液在較低溫度下（-10℃