流式配色與分析

pefitc熒光素是具有熒光特性的染料只在特定波長激光照射后才發(fā)出自身熒光發(fā)出的熒光顏色（波長）也是固定的什么是熒光素關于流式抗體第一頁，共74頁。流式細胞技術：在細胞分子水平上；通過單克隆抗體；對單個細胞或其他生物粒子；進行多參數；快速的；定量分析。第二頁，共74頁。光學系統(tǒng)：經熒光染色的細胞在激光的照射下產生散射光和熒光信號，同時被前向光電二極管和一組光電倍增管（PMT）接收，熒光信號經一系列雙色性反射鏡和帶通或長通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號光源液流通路信號和數據光源液流通路液流系統(tǒng)：鞘液包繞著單行排列的細胞依次高速通過流動池，而激光聚焦于流動池中心的樣本流上，隨后經檢測的樣本和鞘液流向廢液桶。第三頁，共74頁。前向角散射光信號第四頁，共74頁。側向角散射光信號第五頁，共74頁。外周全血細胞散射光雙參數點圖

（紅細胞溶解后）第六頁，共74頁。熒光信號使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量第七頁，共74頁。光學系統(tǒng)：濾光片如何將一束混合的熒光區(qū)分開來，分別進行收集呢？濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍Longpass(LP)Shortpass(SP)Bandpass(BP)460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50第八頁，共74頁。第九頁，共74頁。第十頁，共74頁。流式結果除了染色的每個熒光抗體的表達情況，還包含了細胞的大小和復雜程度的情況FSC：前向角散射光，值越大，細胞越大SSC：側向角散射光，值越大，細胞越復雜第十一頁，共74頁。雙參數散點圖單參數直方圖第十二頁，共74頁。第十三頁，共74頁。多色組合原則強弱搭配避免補償減少偶聯(lián)染料避開自發(fā)熒光第十四頁，共74頁。流式細胞術中常見的熒光抗體一覽熒光素激發(fā)波長發(fā)射波長發(fā)射光顏色BV421(V450)405450藍BV510(V500)500綠BV605605紅Fitc(AF488,BB515)488(561）530綠Pe(PI)578橙Percpcy5.5695紅Pe-cy7780遠紅Apc(AF647,ef660)635(640)660紅Apc-cy7(Apc-H7,ef780)780遠紅第十五頁，共74頁。熒光素顏色calibur/C6Verse，CantoII，AriaFortesa，新CantoFC500CytoflexBV421(V450)藍可選可選可選BV510(V500)綠可選可選可選BV605紅可選可選Fitc(AF488,BB515)綠11111Pe(PI)橙22222Percpcy5.5紅33333Pe-cy7遠紅444可選Apc(AF647,ef660)紅45534Apc-cy7(Apc-H7,ef780)遠紅664可選常見流式儀可用熒光抗體一覽第十六頁，共74頁。熒光素顏色Verse，CantoII，AriaBV421(V450)藍7BV510(V500)綠8BV605紅Fitc(AF488,BB515)綠1Pe(PI)橙2Percpcy5.5紅3Pe-cy7遠紅4Apc(AF647,ef660)紅5Apc-cy7(Apc-H7,ef780)遠紅6可以也僅可以最多選擇8個熒光抗體去標記抗原；需要注意：同一通道不可以選2種熒光抗體，例如：AF488，BB515,FITC不可以同時使用；第十七頁，共74頁。CD5CD8染料的亮度與抗原表達強度相匹配第十八頁，共74頁。三大類:Primary:很好鑒定，容易區(qū)分陰陽性細胞群，陰陽性峰分得很開Examples:CD3,CD4,CD45Secondary:很好鑒定，較高水平表達，經常連續(xù)性表達Examples:CD27,CD28,CD45RA,CD45ROTertiary:低水平表達，激活性marker，或者表達區(qū)分不明顯Example:CD25CD4CD45RACD25染料的亮度與抗原表達強度相匹配第十九頁，共74頁。染料的亮度與抗原表達強度相匹配強弱搭配：即弱表達的抗原搭配強熒光，強表達的抗原搭配弱熒光熒光素的強弱：強4：APC,PE,PE-CY7BV421弱4：Fitcpercpcy5.5apc-cy7BV510抗原的強弱：強的：CD3,CD4,CD8,CD45等弱的：大部分胞內/核內因子（IL系列，Foxp3等）；

CD25,大部分CD大于100（CD127,CD133等）；第二十頁，共74頁。染料的亮度與抗原表達強度相匹配第二十一頁，共74頁。染料的亮度與抗原表達強度相匹配Panel1第二十二頁，共74頁。染料的亮度與抗原表達強度相匹配Panel2第二十三頁，共74頁。染料的亮度與抗原表達強度相匹配Panel1第二十四頁，共74頁。染料的亮度與抗原表達強度相匹配Panel2第二十五頁，共74頁。避免補償CD45-FITCDimCD4-PECD45FITC漏到PE，CD4PE弱信號分不開CD45-PerCPDimCD4-PECD45PerCP不漏到PE，弱CD4可以分開UncompensatedCompensateddataspreadduetospillover第二十六頁，共74頁。避免補償1）采用多激光激發(fā)減少重疊2）避免雙激發(fā)熒光染料488激發(fā)：fitcpepercpcy5.5pe-cy7635激發(fā)：apcapc-cy7405激發(fā)：BV421BV510CD3/CD4/CD8可選fitcapc-cy7BV510減少Pe-cy5，Amcyan等熒光抗體的使用率；第二十七頁，共74頁。0hours2hours22.5hoursPECD8CD3PE-Cy5PE-Cy7樣本曝光時間PerCP減少偶聯(lián)染料的使用率：第二十八頁，共74頁。選擇更穩(wěn)定的偶聯(lián)染料：第二十九頁，共74頁。自發(fā)熒光多的選擇用635激發(fā)的染料BDHorizonTMV500CD45BDTMAPC-H7CD14FITCCD8PerCP-CyTM5.5CD4BDHorizonTMV450CD3APCCD19PE-Cy?7CD56PECD80FluorochromeAntigenPerfect!第三十頁，共74頁。多色組合原則1、要用什么抗體？要用多少種抗體？最多8種4+2+22、強弱搭配染料的亮度與抗原表達相匹配3、避免補償不同激光器激發(fā)/避免雙激發(fā)染料4、減少偶聯(lián)染料使用更穩(wěn)定的偶聯(lián)染料5、自發(fā)熒光高的樣本：紅激光激發(fā)第三十一頁，共74頁。優(yōu)寧維流式免費課堂流式實驗上機前的準備第三十二頁，共74頁。CD19CD4CD56CD14CD16CD8CD(ClusterofDifferentiation)marker:用于鑒定白細胞的分類，不同的白細胞表面帶有不同的CDmarker第三十三頁，共74頁。通過帶有熒光標記的抗體和抗原特異性結合：CD19CD4CD56CD14CD16CD8第三十四頁，共74頁。流式鑒定白細胞的各種亞型：第三十五頁，共74頁。表面蛋白流式檢測步驟：StainAnalyzeWash*2第三十六頁，共74頁。檢測胞內細胞因子:第三十七頁，共74頁。胞內因子流式檢測步驟：FixPermeabilizeStainAnalyze第三十八頁，共74頁。表面染色和胞內染色的區(qū)別？CD4IFN-rTh1細胞CD4IFN-r正常染色情況下，由于抗體無法穿過完整的細胞膜，胞內因子無法被染上顏色，僅表面marker染色成功；第三十九頁，共74頁。通過固定破膜建立胞內染色通道IFN-rTh1細胞表面染色固定破膜胞內染色第四十頁，共74頁。固定劑和破膜劑固定劑：起穩(wěn)定細胞膜、保持細胞膜表面抗體與抗原結合的作用；破膜劑：使流動的、完整的細胞膜產生小孔以利于抗體進入細胞；（少量沉淀正常，皂角苷沉降）破膜的位置不同，破膜劑的選擇不同：對于核內/轉錄因子的檢測，我們需要采用針對破核的破膜劑；第四十一頁，共74頁。固定劑和破膜劑Thiskitenablesthefixationandpermeabilizationofcellswhichisnecessaryforstainingintracellularcytokineswithfluorochrome-conjugatedanti-cytokineantibodies.TheBDPharmingen?TranscriptionFactorBufferSetisoptimizedforfixingandpermeabilizingcellspriortoimmunofluorescentstainingandflowcytometricanalysisofcellsthatexpressspecificintracytoplasmicandintranuclearproteins.第四十二頁，共74頁。胞內因子和核內因子的同時檢測：問：同時檢測Th1/Th2/Th17和Treg這幾個細胞時是否有推薦的buffer？答：核內因子和胞內因子共測時一般推薦使用BD:562574轉錄/核內因子固定破膜試劑盒；但是：經驗證，FoxP3與IL-4無法同時檢測，但FoxP3和IL-17a、IFN-γ一起染色良好。故當需要同時檢測th2/Treg時需要準備2種固定破膜試劑盒并分開檢測。第四十三頁，共74頁。胞內因子的含量與檢測效果為何同時檢測Treg和Th，Th的陽性率很低而Treg正常？第四十四頁，共74頁。胞內因子的含量與檢測效果為何同時檢測Treg和Th，Th的陽性率很低而Treg正常？

僅活化狀態(tài)下的T細胞才會特異性的分泌相關分泌型細胞因子，而正常情況下大部分T細胞處于未活化狀態(tài)；

Foxp3本身屬于轉錄因子，始終存在于Treg細胞之中；如想要鑒定到th中的細胞因子，則必須對其進行“開源”與“節(jié)流”。第四十五頁，共74頁。胞內因子的含量與檢測效果如想要鑒定到th中的細胞因子，則必須對其進行“開源”與“節(jié)流”。開源：刺激活化T細胞。方法有二：1:PMA（PHA/LPS...)＋Ionomycin:PMA能自由透過細胞膜，因此能繞過細胞膜受體直接激活PKC;Ionomycin則能使細胞膜外Ca2+進入膜內增加，導致細胞內游離鈣濃度升高；只有PMA+Ionomycin聯(lián)合應用才是使T細胞進入細胞周期的最有效的方法.2.CD3/CD28：通過包被CD3和添加游離的CD28來封閉抗原提呈，從而一定程度上可以促進T細胞增殖；但是效果不如PMA+離子霉素，并且對于某些T細胞亞型的活化效果也不好；第四十六頁，共74頁。胞內因子的含量與檢測效果如想要鑒定到th中的細胞因子，則必須對其進行“開源”與“節(jié)流”。節(jié)流：阻斷細胞內的蛋白轉運：1:Monensin：莫能霉素是一種離子載體(ionophore)，可以破壞高爾基體，抑制細胞內的蛋白轉運；2.BFA:全稱BrefeldinA（布雷霉素），是一種常用的蛋白轉運抑制劑，特異性地可逆地阻斷蛋白質從內質網(ER)轉運到高爾基體(Golgi)第四十七頁，共74頁。胞內因子的含量與檢測效果TheLeukocyteActivationCocktail,withBDGolgiPlug?isaready-to-usepolyclonalcellactivationmixturecontainingthephorbolester,PMA(Phorbol12-Myristate13-Acetate),acalciumionophore(Ionomycin)andtheproteintransportinhibitorBDGolgiPlug?(BrefeldinA).第四十八頁，共74頁。胞內因子的含量與檢測效果經過“開源”和“節(jié)流”之后的樣本和先前的實驗結果對比：未刺激活化刺激活化后第四十九頁，共74頁。流式實驗上機模版設置和結果分析第五十頁，共74頁。流式實驗上機模版設置設置上機模版需要用到：空白對照管：去除自發(fā)熒光同型對照管：去除非特異性熒光單陽補償管：去除熒光泄漏實驗樣本管：檢測樣本第五十一頁，共74頁。一、空白對照管：即只有樣本的對照管；用來排除細胞的自發(fā)熒光，調節(jié)閾值、電壓，設定陰性區(qū)域；第五十二頁，共74頁。同型對照（IsotypeControl）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色。二、同型對照管：即樣本+同型對照抗體孵育的實驗管；用來排除細胞和抗體FC段非特異性結合產生的熒光第五十三頁，共74頁。非特異熒光產生原因分兩類，一類是抗體Fc段與細胞表面的Fc受體非特異結合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光，可使用FCR阻斷劑阻斷；另細胞損傷也會導致非特異性染色，此類染色無法阻斷，需用同型對照對比或進行死細胞排除。例如：針對紅細胞的抗體第五十四頁，共74頁。當使用FCr阻斷劑進行阻斷后同型對照依舊有較強雜信號和非特性干擾時，可用PI,7-aad,FVS等染料進行死活細胞染色排除干擾；第五十五頁，共74頁。選擇BDFixableViabilityStainReagents（FVS染料）：FVS染色不會被固定，破膜以及洗滌步驟影響；FVS的光譜多樣，適合多種染色組合的搭配，發(fā)射波普也非常集中；第五十六頁，共74頁。選擇BDFixableViabilityStainReagents（FVS染料）：第五十七頁，共74頁。熒光補償：所謂“補償”就是除去某一熒光素誤入到其它熒光通道中的發(fā)射光信號。通過調節(jié)儀器完成這一步驟。往往我們通過檢測帶有單一熒光素的樣本來減除誤入其他熒光通道的信號。既單陽管。三、單陽管：帶有單一熒光抗體的樣本管用來排除熒光補償**注意，實驗用到幾種熒光，就要制備幾種單陽管**第五十八頁，共74頁。完整的流式實驗方案完整的流式實驗方案包括：空白對照管：去除自發(fā)熒光同型對照管：去除非特異性熒光單陽補償管：去除熒光泄漏實驗樣本管：檢測樣本第五十九頁，共74頁。陰性對照與陽性對照通過設置陰性對照和陽性對照更好的界定實驗組的樣本表達情況；第六十頁，共74頁。流式上機時的儀器條件設置閾值設定光電倍增管電壓設定補償調節(jié)門與設門第六十一頁，共74頁。閾值設定流式細胞分析的對象主要是細胞和微球，但實際上細胞碎片，顆粒性雜質也會被檢測到。通過設定閾值可以減少后者的干擾；每個通道閾值都可以設定。通常選擇FSC通道進行閾值的設定，特定情況下會同時/或設定其他通道的閾值；通常使用空白對照調整閾值；第六十二頁，共74頁。電壓設定每一個流式通道都有自己特定的光電倍增管，其電壓獨立調控，在初次上機時一定都要調節(jié)到位，例如行fitc/pe雙染，需調節(jié)fsc，ssc，fitc，pe4個通道的各自電壓；通常使用空白對照進行設定電壓偏低電壓合適電壓偏高在行多色實驗時，電壓應該盡可能的合適甚至是稍微偏低，否則會影響到補償調節(jié)；電壓必須先于補償調節(jié)，改變電壓補償亦會隨之改變；第六十三頁，共74頁。補償設定通常使用單陽管進行設定光譜重疊會導致不同熒光通道間干擾，通過補償調節(jié)將干擾信號減去，從而保證流式分析結果的正確；調節(jié)補償是按照“被減原則”進行；第六十四頁，共74頁。RelativeIntensity650nm700nm500nm550nm600nmWavelength

(nm)Detector-%SignalFITCCompensationFL1530/30FL2585/42第六十五頁，共74頁。FITCCompensation24.8%oftheSignalSensedinFL2650nm700nm500nm550nm600nmRelativeIntensityWavelength

(nm)Figure

CFL1530/30FL2585/42第六十六頁，共74頁。650nm700nm500nm600nmRelativeIn