三氯乙烯對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的致突變實(shí)驗(yàn)

三氯乙烯對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的致突變?cè)囼?yàn)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握Ames試驗(yàn)的基本原理及應(yīng)用2、了解Ames試驗(yàn)的基本步驟3、通過該實(shí)驗(yàn)，了解三氯乙烯的致突變作用二、實(shí)驗(yàn)原理原理：是一種利用微生物進(jìn)行基因突變的體外致突變?cè)囼?yàn)方法。基本原理是利用同一種微生物的營養(yǎng)缺陷型突變型菌株與受試物接觸，若此化學(xué)物質(zhì)具有致突變性，可使突變型微生物再發(fā)生一次突變，重新成為野生型微生物。這種突變叫做回復(fù)突變。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his-）菌株，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)胞外，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后，大量細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見的菌落。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變，故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S9混合液。鑒于化學(xué)物質(zhì)的致突變作用與致癌作用之間密切相關(guān)，故此法現(xiàn)廣泛應(yīng)用于致癌物的篩選。

鼠傷寒沙門氏菌野生型（his＋）

鼠傷寒沙門氏菌突變型（his－）

正向突變回復(fù)突變受試物試驗(yàn)菌種(his-)S9試驗(yàn)菌種(his-)S9Ames試驗(yàn)原理三氯乙烯(Trichloroethylene，TCE)是一種常用的有機(jī)溶劑，主要用作金屬的脫脂劑和脂肪、油、石蠟等的萃取劑，也用于干洗毛織品和衣服。近年來，三氯乙烯職業(yè)性中毒時(shí)有發(fā)生。為了解三氯乙烯的致突變作用，開展了三氯乙烯對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的回復(fù)突變?cè)囼?yàn)。三.實(shí)驗(yàn)材料標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)菌株(配套菌株)：有四種

TA98、TA97：檢測(cè)移碼突變

TA100：檢測(cè)堿基置換突變

TA102：對(duì)醛、過氧化物及DNA交聯(lián)劑較敏感這四個(gè)試驗(yàn)菌株除了含有his-突變，還有一些附加突變，以提高敏性S9液三氯乙烯輔酶-Ⅱ6-磷酸葡萄糖單鈉鹽二甲基亞砜(DMSO)四.實(shí)驗(yàn)步驟1.菌株鑒定用于測(cè)試的菌株，需經(jīng)基因型和生物學(xué)性狀鑒定，符合要求才能投入使用。2.斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)3.平板摻入實(shí)驗(yàn)4.兩法比較1.菌株鑒定（1）組氨酸缺陷型的鑒定

（3）

紫外線損傷修復(fù)缺陷型的鑒定（2）

脂多糖屏障缺陷的鑒定

（5）

自發(fā)回變率的測(cè)定

（4）

R因子和四環(huán)素抗性的鑒定

(1).組氨酸缺陷型的鑒定

組氨酸缺陷型的鑒定加熱融化底層培養(yǎng)基兩瓶(一瓶不加組氨酸，一瓶加組氨酸)，不加組氨酸者每100mL底層培養(yǎng)基中加0.5mg分子D－生物素0.6mL；加組氨酸者每100mL底層培養(yǎng)基中加L－組氨酸(每100mL中含0.4043g)1mL和0.5mg分子D－生物素0.6mL，冷卻至50℃左右，各倒兩個(gè)平皿。接種：取有組氨酸和無組氨酸培養(yǎng)基平皿各一個(gè)，按菌株號(hào)順序各取一白金耳菌液劃線(直線)接種在培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)48h。結(jié)果：四株菌在有組氨酸培養(yǎng)基平皿表面各長出一條菌膜，無組氨酸培養(yǎng)基平皿上除自發(fā)回變菌落外無菌膜，說明受試菌株確為組氨酸缺陷型。(2).脂多糖屏障缺陷的鑒定

加熱融化營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基。接種：取菌液0.1mL移入平皿，迅速將營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基(冷卻至50℃左右)適量倒入平皿，混勻，平放凝固。將無菌濾紙片一片放入已凝固的培養(yǎng)基平皿中央，用移液器在濾紙片上滴加0.1%結(jié)晶紫溶液(鑒定菌株用)10μL，37℃培養(yǎng)24h，每個(gè)菌做一個(gè)平皿。結(jié)果：陽性者在紙片周圍出現(xiàn)一個(gè)透明的抑制帶，說明存在rfa(深粗型)突變。這種變化允許某些大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)并抑制其生長。TA97、TA98、TA100和TA102均有抑制帶，野生型鼠傷寒沙門氏菌沒有抑制帶。

(3).紫外修復(fù)缺陷型的鑒定

在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平皿表面用接種環(huán)劃線接種需要的菌株。接種后的平皿一半用黑紙覆蓋，另一半在距15W紫外線滅菌燈33Cm處照射8s，37℃培養(yǎng)24h。結(jié)果：對(duì)紫外線敏感的三個(gè)菌株(TA97、TA98、TA100)僅在沒有照射過的一半生長，具有野生型切除修復(fù)酶的菌株TA102仍能生長。(4)自發(fā)回變率的測(cè)定

準(zhǔn)備底層培養(yǎng)基平皿8個(gè).融化頂層培養(yǎng)基8管，每管2mL，在45℃水浴中保溫。在每管頂層培養(yǎng)基中，分別加入待鑒定的測(cè)試菌株的菌液0.1mL，一式二份，輕輕搖勻，迅速將此試管的內(nèi)容物傾入已固化的底層培養(yǎng)基平皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使頂層培養(yǎng)基均勻分布，平放固化，37℃培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)菌落數(shù)。結(jié)果：每一株的自發(fā)回變率應(yīng)落在正常范圍內(nèi)。2．斑點(diǎn)試驗(yàn)

吸取測(cè)試菌增菌培養(yǎng)后的菌液0.1ml，注入融化并保溫45℃左右的上層軟瓊脂中，需S9活化的再加0.3ml－0.4mlS9mix，立即混勻，傾于底平板上，鋪平冷凝。用滅菌尖頭鑷子夾滅菌圓濾紙片邊緣，紙片浸濕受試物溶液，或直接取固態(tài)受試物，貼放于上層培養(yǎng)基的表面。同時(shí)做溶劑對(duì)照和陽性對(duì)照，分別貼放于平板上相應(yīng)位置。平皿倒置于37℃溫箱培養(yǎng)48h。在紙片外圍長出密集菌落圈，為陽性；菌落散布，密度與自發(fā)回變相似，為陰性。3．平板摻入試驗(yàn)

將一定量樣液和0.1ml測(cè)試菌液均加入上層軟瓊脂中，需代謝活化的再加0.3ml－0.4mlS9mix，混勻后迅速傾于底平板上鋪平冷凝。同時(shí)做陰性和陽性對(duì)照，每種處理做3個(gè)平行。試樣通常設(shè)4～5個(gè)劑量。選擇劑量范圍開始應(yīng)大些，有陽性或可疑陽性結(jié)果時(shí)，再在較窄的劑量范圍內(nèi)確定劑量反應(yīng)關(guān)系。培養(yǎng)同上。同一劑量各皿回變菌落均數(shù)與各陰性對(duì)照皿自發(fā)回變菌落均數(shù)之比，為致變比（MR）。MR值≥2，且有劑量-反應(yīng)關(guān)系，背景正常，則判為致突變陽性。4.兩法比較斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)平板摻入實(shí)驗(yàn)定量測(cè)試樣品致突變性的強(qiáng)弱

較斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)敏感，獲陽性結(jié)果所需的劑量較低限于能在瓊脂上擴(kuò)散的化學(xué)物質(zhì)

敏感性較差

定性實(shí)驗(yàn)

四.實(shí)驗(yàn)結(jié)果TA102組別劑量(mg/皿)TA97-(S9)+(S9)TA98-(S9)+(S9)TA100-(S9)+(S9)-(S9)+(S9)受試物自發(fā)回變?nèi)軇?duì)照陽性物對(duì)照五.討論

菌株TA100的菌落數(shù)均比空白對(duì)照菌落數(shù)增加一倍以上，且隨三氯乙烯劑量的增加，TA100的菌落數(shù)也相應(yīng)增加三氯乙烯能導(dǎo)致菌株TA100的突變(堿基對(duì)置換)，說明三氯乙烯是一種致突變劑。

S9存在的情況下導(dǎo)致鼠傷寒沙門氏菌菌株TA100數(shù)量增加的數(shù)量比S9不存在情況下多.三氯乙烯的致突變作用可能部分是由于三氯乙烯經(jīng)過代謝成中間活性產(chǎn)物而起作用。

不論是否加S9，菌株TA97、TA98、TA102的菌落數(shù)不但未能比空白對(duì)照組的菌落數(shù)增加1倍以上，反而比空白對(duì)照組的菌落數(shù)少可能與三氯乙烯具有殺菌作用有關(guān)，同時(shí)也說明三氯乙烯在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的劑量的條件下，未能引起移碼型突變。材料和方法結(jié)果討論三氯乙烯是能導(dǎo)致菌株TA100發(fā)生突變的致突變劑(堿基對(duì)置換)。三氯乙烯的致突變作用可能部分是由于三氯乙烯經(jīng)過代謝成中間活性產(chǎn)物而起作用。結(jié)論六、作業(yè)自主設(shè)計(jì)一個(gè)試驗(yàn)，利用Ames試驗(yàn)方法檢測(cè)某種物質(zhì)的致突變性?？刹殚喯嚓P(guān)文獻(xiàn)。試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、使用溶劑；（2）試驗(yàn)菌株：所用試驗(yàn)菌株；（3）代謝活化系統(tǒng)：所用誘導(dǎo)劑；（4）試驗(yàn)方法：簡(jiǎn)述操作步驟，除受試物劑量分組外，還應(yīng)說明空白對(duì)照、溶劑對(duì)照和陽性對(duì)照，陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)；（5）結(jié)果：以列表方式報(bào)告受試物的Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）；（6）結(jié)論。證明Ames試驗(yàn)重要性的應(yīng)用實(shí)例：

國外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物“反應(yīng)停”，由于其藥效顯著，在60-70年代十分流行，但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用“反應(yīng)?！?，后來采用Ames試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具有很強(qiáng)的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用但如果能在這種藥物上市之前就進(jìn)行Ames試驗(yàn)檢測(cè)，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免。Ames實(shí)驗(yàn)室無菌操作

吸入染毒試驗(yàn)裝置（液氣）吸入染毒試驗(yàn)裝置（粉塵)

）動(dòng)物飼養(yǎng)裝置

鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶實(shí)驗(yàn)（Ames實(shí)驗(yàn)）目的:為了研究復(fù)方生物黃酮（圣安泰牌百力康片）的潛在致突變性。方法我們對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行了Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果:為陰性，均未見毒性改變。結(jié)論:復(fù)方生物黃酮在服用劑量?jī)?nèi)未見致突變性。1材料與方法

1.1樣品復(fù)方生物黃酮的商品名稱為圣安泰牌百力康片，由哈爾濱圣安泰生物科技有限公司提供。樣品以枸杞、黃芪、銀杏葉為主要原料，輔以其他輔料制成，功效成分為總黃酮。

1.2材料昆明種小白鼠（批準(zhǔn)證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第09-2-7號(hào)），購自黑龍江省腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。TA97a、TA98、TA100和TA102四種菌株引自美國加州大學(xué)Ames實(shí)驗(yàn)室。

1.3方法

TA97a、TA98、TA100和TA102四種菌株引自美國加州大學(xué)Ames實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)菌株特性鑒定均符合實(shí)驗(yàn)要求?；罨到y(tǒng)為PCB-五氯誘導(dǎo)的雄性Wistar大鼠肝s-9液。按1：9加入輔助因子（Ames

1983年配方）配成10％s-9混合液，經(jīng)陽性誘變劑活性鑒定符合實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)XAD-11樹脂柱過濾及洗脫預(yù)處理，最后以DMSO為溶劑，劑量設(shè)計(jì)分別為5mg/皿、1mg/皿、0.2mg/皿、0.04mg/皿和0.008mg/皿受試物。除上述5個(gè)劑量組外，又設(shè)未處理對(duì)照組、溶劑對(duì)照組（DMSO）和陽性對(duì)照組［加s-9用2-AF（TA102用1，8-二羥蒽醌），不加s-9用DEXON（TA100用疊氮鈉）］。采用平板滲入法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入測(cè)試菌株新鮮增菌液0.1ml，混勻；加受試物或?qū)φ瘴?.1ml［需活化時(shí)加入10％s-9混合液0.5ml（含s-9

5μl）］，論文聯(lián)盟整理再混勻，迅速傾入底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層上，平放固化，37℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。每個(gè)劑量平行做了3皿，并重復(fù)一次，最后以3皿平均值報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

2結(jié)果

表1圣安泰牌百力康片第一次Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(x±s)

注：以上結(jié)果為3皿回變菌落數(shù)的平均值表2圣安泰牌百力康片第二次Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s）

注：以上結(jié)果為3皿回變菌落數(shù)的平均值

結(jié)論受檢樣品對(duì)Ames各實(shí)驗(yàn)菌株在加與不加活化系統(tǒng)條件下均呈陰性結(jié)果，即鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶實(shí)驗(yàn)為突變陰性結(jié)果。昆明種小白鼠，體重25～30g，共50只，在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境7天后，隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半。高劑量組劑量為10g/kgbw；中劑量組為5g/kgBw；低劑量組為2.5g/kgbw。陰性對(duì)照組經(jīng)口灌胃蒸餾水；陽性對(duì)照組灌胃給予環(huán)磷酰胺，劑量為40.0mg/kgbw。按20ml/kgbw灌胃容積進(jìn)行灌胃。采用30h給受試物法，即二次給受試物間隔24h，第二次給受試物后6h頸椎脫臼處死小鼠，取股骨，常規(guī)制片。顯微鏡雙盲法閱片，每只小鼠觀察1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE），記錄有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出微核率。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，觀察嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值。

1.3.2小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)