高致病性禽流感防治技術(shù)規(guī)范

高致病性禽流感防治技術(shù)規(guī)范高致病性禽流感（HighlyPathogenicAvianInfluenza,HPAI），是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。為預(yù)防、控制和消滅高致病性禽流感，依據(jù)《中華人民共和國動(dòng)物防疫法》及有關(guān)的法律法規(guī)，特制定本規(guī)范。1適用范圍本規(guī)范規(guī)定了高致病性禽流感的診斷、疫情報(bào)告、疫情處理、防治措施、控制和凈化標(biāo)準(zhǔn)。本規(guī)范適用于中華人民共和國境內(nèi)的一切從事禽類飼養(yǎng)、經(jīng)營和禽類產(chǎn)品生產(chǎn)、經(jīng)營，以及從事動(dòng)物防疫活動(dòng)的單位和個(gè)人。2診斷2.1有下列情況之一的，可確認(rèn)為高致病性禽流感：2.1.1有典型的臨床癥狀和病理變化，發(fā)病急、死亡率高，且能排除雞新城疫和中毒性疾病，血清學(xué)檢測陽性。2.1.2未經(jīng)免疫雞場的家禽出現(xiàn)H5、H7亞型禽流感血清學(xué)陽性。2.1.3在禽群中分離到H5、H7亞型禽流感病毒株或其它亞型高致病力禽流感毒株。2.2流行特點(diǎn)雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉雞、鷓鴣、鴕鳥、鴿、孔雀等多種禽類均易感。傳染源主要為病禽和帶毒禽（包括水禽和飛禽）。病毒可長期在污染的糞便、水等環(huán)境中存活。病毒的傳播主要通過接觸感染禽及其分泌物和排泄物、污染的飼料、水、蛋托（箱）、墊草、種蛋、雞胚和精液等媒介，經(jīng)呼吸道、消化道感染，也可通過氣源性媒介傳播。2.3臨床癥狀潛伏期從幾小時(shí)到數(shù)天，最長可達(dá)21天。表現(xiàn)為突然死亡、高死亡率，飼料和飲水消耗量及產(chǎn)蛋量急劇下降，病雞極度沉郁，頭部和臉部水腫，雞冠發(fā)紺、腳鱗出血和神經(jīng)紊亂；鴨鵝等水禽有明顯神經(jīng)和腹瀉癥狀，可出現(xiàn)角膜炎癥，甚至失明。2.4病理變化2.4.1剖檢病變:全身組織器官嚴(yán)重出血。腺胃粘液增多，刮開可見腺胃乳頭出血、腺胃和肌胃之間交界處粘膜可見帶狀出血；消化道粘膜，特別是十二指腸廣泛出血；呼吸道粘膜可見充血、出血；心冠脂肪及心內(nèi)膜出血；輸卵管的中部可見乳白色分泌物或凝塊；卵泡充血、出血、萎縮、破裂,有的可見“卵黃性腹膜炎”。水禽在心內(nèi)膜還可見灰白色條狀壞死。胰臟沿長軸常有淡黃色斑點(diǎn)和暗紅色區(qū)域。急性死亡病例有時(shí)未見明顯病變。2.4.2病理組織學(xué)變化:主要表現(xiàn)為腦、皮膚及內(nèi)臟器官（肝、脾、胰、肺、腎）的出血、充血和壞死。腦的病變包括壞死灶、血管周圍淋巴細(xì)胞管套、神經(jīng)膠質(zhì)灶、血管增生和神經(jīng)元性變化；胰腺和心肌組織局灶性壞死。2.5實(shí)驗(yàn)室診斷2.5.1病原鑒定2.5.1.1符合相應(yīng)生物安全級別的,且經(jīng)國務(wù)院畜牧獸醫(yī)行政管理部門認(rèn)定的省級以上動(dòng)物疫病診斷實(shí)驗(yàn)室和研究機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室,可開展病原鑒定工作。2.5.1.2樣品采集活禽樣品應(yīng)采集泄殖腔拭子和氣管拭子；死禽樣品應(yīng)采集氣管、脾、肺、肝、腎和腦等組織器官；小珍禽樣品應(yīng)采集新鮮糞便（見附件一）。2.5.1.3病原學(xué)診斷主要包括病原分離、鑒定（見附件二）和毒力測定(見附件三)。2.5.2血清學(xué)診斷主要包括瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）（不適用于水禽）（見附件四）、血凝抑制試驗(yàn)（HI）（見附件五）。3疫情報(bào)告3.1任何單位和個(gè)人發(fā)現(xiàn)患有本病或疑似本病的禽類，都應(yīng)當(dāng)立即向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告。3.2動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到疫情報(bào)告后，按農(nóng)業(yè)部《動(dòng)物疫情報(bào)告管理辦法》和《國家高致病性禽流感防治應(yīng)急預(yù)案》等有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。4疫情處理實(shí)行以緊急撲殺為主的綜合性防治措施。4.1發(fā)現(xiàn)疑似高致病性禽流感疫情時(shí)，畜主應(yīng)立即將病禽（場）隔離，并限制其移動(dòng)。動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)要及時(shí)派員到現(xiàn)場進(jìn)行調(diào)查核實(shí)，進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀檢查、病理解剖、采集病料、實(shí)驗(yàn)室診斷等，根據(jù)診斷結(jié)果采取相應(yīng)措施。4.2當(dāng)發(fā)生高致病性禽流感時(shí)，按下列要求處理：4.2.1劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)由所在地縣級以上畜牧獸醫(yī)行政管理部門劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)。疫點(diǎn)：指患病動(dòng)物所在的地點(diǎn)。一般是指患病禽類所在的禽場（戶）或其它有關(guān)屠宰、經(jīng)營單位；如為農(nóng)村散養(yǎng)，應(yīng)將自然村劃為疫點(diǎn)。疫區(qū)：指以疫點(diǎn)為中心，半徑3-5公里范圍內(nèi)區(qū)域。疫區(qū)劃分時(shí)，應(yīng)注意考慮當(dāng)?shù)氐娘曫B(yǎng)環(huán)境和天然屏障（如河流、山脈等）。受威脅區(qū)：指疫區(qū)外延5-30公里范圍內(nèi)的區(qū)域。4.2.2封鎖由縣級以上畜牧獸醫(yī)行政管理部門報(bào)請同級人民政府決定對疫區(qū)實(shí)行封鎖；人民政府在接到封鎖報(bào)告后，應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)發(fā)布封鎖令，并對疫區(qū)進(jìn)行封鎖。對疫點(diǎn)、疫區(qū)采取不同的處理措施。其中：疫點(diǎn)出入口必須有消毒設(shè)施。嚴(yán)禁人、禽、車輛進(jìn)出和禽類產(chǎn)品及可能受污染的物品運(yùn)出，在特殊情況下必須出入時(shí)，須經(jīng)所在地動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，經(jīng)嚴(yán)格消毒后，方可出入。疫區(qū)交通要道建立動(dòng)物防疫監(jiān)督檢查站，派專人監(jiān)視動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品的流動(dòng)，對進(jìn)出人員、車輛須進(jìn)行消毒。停止疫區(qū)內(nèi)禽類及其產(chǎn)品的交易、移動(dòng)。水禽必須圈養(yǎng)，或在指定地點(diǎn)放養(yǎng)。4.2.3撲殺確認(rèn)為高致病性禽流感時(shí)，在動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)的監(jiān)督指導(dǎo)下對疫點(diǎn)內(nèi)所有的禽只進(jìn)行撲殺。4.2.4無害化處理對所有病死禽、被撲殺禽及其禽類產(chǎn)品（包括禽肉、蛋、精液、羽、絨、內(nèi)臟、骨、血等）按照GB16548《畜禽病害肉尸及其產(chǎn)品無害化處理規(guī)程》執(zhí)行；對于禽類排泄物和被污染或可能被污染的墊料、飼料等物品均需進(jìn)行無害化處理。禽類尸體需要運(yùn)送時(shí)，應(yīng)使用防漏容器，須有明顯標(biāo)志，并在動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)的監(jiān)督下實(shí)施。4.2.5緊急免疫對疫區(qū)和受威脅區(qū)內(nèi)的所有易感禽類進(jìn)行緊急免疫接種，登記免疫接種的禽群及其養(yǎng)禽場(戶)，建立免疫檔案。4.2.6消毒對疫點(diǎn)內(nèi)禽舍、場地以及所有運(yùn)載工具、飲水用具等必須進(jìn)行嚴(yán)格徹底地消毒（見附件六）。4.2.7緊急監(jiān)測對疫區(qū)、受威脅區(qū)內(nèi)禽類實(shí)施緊急疫情監(jiān)測，掌握疫情動(dòng)態(tài)。4.2.8疫源分析與追蹤調(diào)查根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，分析疫源及其可能擴(kuò)散、流行的情況。對仍可能存在的傳染源，以及在疫情潛伏期和發(fā)病期間售出的禽類及其產(chǎn)品、可疑污染物（包括糞便、墊料、飼料等）等應(yīng)立即開展追蹤調(diào)查，一經(jīng)查明立即按照GB16548-1996《畜禽病害肉尸及其產(chǎn)品無害化處理規(guī)程》采取就地銷毀等無害化處理措施。4.2.9封鎖令的解除疫點(diǎn)內(nèi)所有禽類及其產(chǎn)品按規(guī)定處理后，在動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)的監(jiān)督指導(dǎo)下，對有關(guān)場所和物品進(jìn)行徹底消毒。最后一只禽只撲殺21天后，經(jīng)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)審驗(yàn)合格后，由當(dāng)?shù)匦竽莲F醫(yī)行政管理部門向原發(fā)布封鎖令的同級人民政府申請發(fā)布解除封鎖令。疫區(qū)解除封鎖后，要繼續(xù)對該區(qū)域進(jìn)行疫情監(jiān)測，6個(gè)月后如未發(fā)現(xiàn)新的病例，即可宣布該次疫情被撲滅。4.2.10處理記錄對處理疫情的全過程必須做好完整的詳細(xì)記錄，以備檢查。5預(yù)防與控制5.1加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高環(huán)境控制水平。飼養(yǎng)、生產(chǎn)、經(jīng)營場所必須符合動(dòng)物防疫條件，取得《動(dòng)物防疫合格證》。飼養(yǎng)場實(shí)行全進(jìn)全出飼養(yǎng)方式，控制人員出入，嚴(yán)格執(zhí)行清潔和消毒程序。雞和水禽禁止混養(yǎng)，養(yǎng)雞場與水禽飼養(yǎng)場應(yīng)相互間隔3公里以上，且不得共用同一水源。養(yǎng)禽場要有良好的防止禽鳥（包括水禽）進(jìn)入飼養(yǎng)區(qū)的設(shè)施，并有健全的滅鼠設(shè)施和措施。5.2加強(qiáng)消毒，做好基礎(chǔ)防疫工作各飼養(yǎng)場、屠宰廠（場）、動(dòng)物防疫監(jiān)督檢查站等要建立嚴(yán)格的衛(wèi)生（消毒）管理制度。5.3監(jiān)測5.3.1由縣級以上動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)組織實(shí)施。5.3.2監(jiān)測方法未經(jīng)免疫區(qū)域：以流行病學(xué)調(diào)查、血清學(xué)監(jiān)測為主（包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等方法），結(jié)合病原分離和毒型鑒定、毒力鑒定進(jìn)行監(jiān)測。免疫區(qū)域：以病原學(xué)監(jiān)測為主，結(jié)合血清學(xué)監(jiān)測。5.3.3監(jiān)測對象：以雞、火雞、鴨、鵝等為主，也包括鵪鶉、雉雞、鷓鴣、鴕鳥、鴿、孔雀和候鳥等易感禽類。5.3.4監(jiān)測環(huán)節(jié)與措施5.3.4.1產(chǎn)地監(jiān)測：對未免疫和免疫的養(yǎng)禽場均可采用病原學(xué)監(jiān)測方法進(jìn)行監(jiān)測。對所有原種、曾祖代、祖代和父母代養(yǎng)禽場，有出口任務(wù)的養(yǎng)禽場，商品代養(yǎng)禽場每年要進(jìn)行兩次監(jiān)測；散養(yǎng)禽不定期抽檢。采樣比例：每群采10只禽的棉拭子，放在同一容器內(nèi)，混合為一個(gè)樣品，用于雞胚接種，進(jìn)行病毒分離。對于未免疫的養(yǎng)禽場以血清學(xué)監(jiān)測為主。有出口任務(wù)養(yǎng)禽場的監(jiān)測,每批次按照0.5%的比例采樣；每批次數(shù)量超過10萬只的，按0.1%的比例采樣；其它所有養(yǎng)禽場每半年至少監(jiān)測一次。父母代以上種禽場，每批次（群）按照0.5%的比例進(jìn)行監(jiān)測；商品代養(yǎng)禽場，每批次（群）按照0.1%的比例進(jìn)行監(jiān)測。散養(yǎng)禽不定期抽檢。每批次（群）監(jiān)測數(shù)量不得少于20份。5.3.4.2流通環(huán)節(jié)的監(jiān)測對交易市場、禽類屠宰廠（場）、異地調(diào)入的活禽和禽產(chǎn)品進(jìn)行不定期的病原學(xué)和血清學(xué)監(jiān)測。5.3.5監(jiān)測結(jié)果處理監(jiān)測結(jié)果要及時(shí)匯總，由省級動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)定期上報(bào)全國畜牧獸醫(yī)總站。發(fā)現(xiàn)病原學(xué)和非免疫禽血清學(xué)陽性的，要按照《農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫情報(bào)告管理辦法》的有關(guān)規(guī)定立即報(bào)告和處理。監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)因使用未經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)生產(chǎn)的禽流感疫苗而造成血清學(xué)陽性禽群，一律按發(fā)生禽流感疫情處理。5.3.6免疫在發(fā)生疫情時(shí)，對疫區(qū)、受威脅區(qū)內(nèi)的所有易感禽只進(jìn)行緊急免疫；在曾發(fā)生過疫情區(qū)域的水禽,必要時(shí)也可進(jìn)行免疫。所用疫苗必須是經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的禽流感疫苗。5.3.7引種檢疫國內(nèi)異地引入種禽及精液、種蛋時(shí)，應(yīng)當(dāng)先到當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)辦理檢疫審批手續(xù)且檢疫合格。引入的種禽必須隔離飼養(yǎng)21天以上，并由動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測，合格后方可混群飼養(yǎng)。從國外引入種禽及精液、種蛋時(shí)，按國家有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。6無高致病性禽流感區(qū)標(biāo)準(zhǔn)無高致病性禽流感區(qū)，必須滿足以下條件：6.1達(dá)到國家無規(guī)定疫病區(qū)基本條件。6.2有定期、快速的動(dòng)物疫情報(bào)告記錄。6.3在過去3年內(nèi)沒有發(fā)生過高致病性禽流感；在過去6個(gè)月內(nèi)，沒有接種過禽流感疫苗；停止免疫接種后，沒有引進(jìn)接種過禽流感疫苗的禽類。6.4有有效的監(jiān)測體系和監(jiān)測區(qū)，過去3年內(nèi)實(shí)施疫病監(jiān)測，未檢出H5、H7病原或H5、H7禽流感HI試驗(yàn)陰性。6.5所有的報(bào)告、監(jiān)測記錄等有關(guān)材料準(zhǔn)確、詳實(shí)、齊全。6.6若發(fā)生高致病性禽流感時(shí)，在采取撲殺措施及血清學(xué)監(jiān)測的情況下，最后一只病禽撲殺后6個(gè)月；或采取撲殺措施、血清學(xué)監(jiān)測及緊急免疫情況下，最后一只免疫禽屠宰后6個(gè)月，經(jīng)實(shí)施有效的疫情監(jiān)測和血清學(xué)檢測確認(rèn)后，方可重新申請無高致病性禽流感區(qū)。附件一：樣品采集與處理活禽病料應(yīng)包括氣管和泄殖腔拭子，最好是采集氣管拭子。小珍禽用拭子取樣易造成損傷，可采集新鮮糞便。死禽采集氣管、脾、肺、肝、腎和腦等組織樣品。將每群采集的10份棉拭子，放在同一容器內(nèi)，混合為一個(gè)樣品；容器中放有含有抗菌素的pH值為7.0-7.4的PBS液。抗生素的選擇視當(dāng)?shù)厍闆r而定，組織和氣管拭子懸液中應(yīng)含有青霉素（2000IU/mL）、鏈霉素（2mg/mL），慶大霉素（50μg/mL），制霉菌素（1000IU/mL），但糞便和泄殖腔拭子所有的抗生素濃度應(yīng)提高5倍。加入抗生素后pH值應(yīng)調(diào)至7.0-7.4。若不加抗生素，可用細(xì)菌過濾器過濾除菌。糞便、研碎的組織用含抗生素的溶液配成10-20%（W/V）的懸液，冰浴放置1-2小時(shí)內(nèi)樣品應(yīng)盡快處理，如來不及處理，可放在-70℃或以下保存,若放在4℃保存不能超過5天。將混合樣品用抗生素制成懸液,接種到9-11日齡雞胚尿囊腔內(nèi)，0.1mL／胚;置于35-37℃孵育4-7天,檢測死胚和所有到孵化末期雞胚尿囊液的血凝活性。用濃縮病毒和所有A型流感病毒共有的核衣殼或基質(zhì)抗原的抗血清作免疫擴(kuò)散試驗(yàn),能確診A型流感病毒。測定毒株對禽的致病力方法:將感染雞胚尿囊液用生理鹽水1：10稀釋，以0.1mL／羽的劑量翅靜脈接種至少8只4-8周齡的易感雞。每日觀察雞的死亡情況，連續(xù)觀察10天。10天內(nèi)如果死亡率高于75%,則認(rèn)為該病毒毒株為高致病力。附件二：病原鑒定方法增殖A型流感病毒的較好方法是將其接種于無特定病原體（SPF）雞胚。糞便和組織懸液經(jīng)1000rp/m離心10分鐘，上清液以0.2mL/胚的劑量經(jīng)尿囊腔途徑接種9～11日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種5個(gè)胚，于37℃孵化箱內(nèi)孵育4-7天。18小時(shí)后每8小時(shí)觀察雞胚死亡情況，死亡雞胚或者瀕死雞胚以及孵育末期所有的雞胚放在4℃冷卻，檢測尿囊液的HA活力（見附件4）。陽性反應(yīng)說明很可能有正粘病毒科的流感病毒，呈陰性反應(yīng)的尿囊液至少應(yīng)再接種一批雞胚。用AGID試驗(yàn)（見附件5）檢測流感病毒，可證明A型流感病毒屬所有成員共同存在的核衣殼和基質(zhì)抗原。抗原制備方法：1用濃縮的尿囊液病毒或者用已感染的絨毛尿囊膜的提取物，這些抗原用標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行標(biāo)定。將含毒尿囊液以超速離心或者在酸性條件下進(jìn)行沉淀以濃縮病毒。酸性沉淀法是將1.0mol/LHCl加入到含毒尿囊液中，調(diào)pH值到4.0，將混合物置于冰浴中作用1小時(shí)，經(jīng)1000rp/m，4℃離心10分鐘，棄去上清液。病毒沉淀物懸于甘氨-肌氨酸緩沖液中（含1%十二烷酰肌氨酸緩沖液，用0.5mol/L甘氨酸調(diào)pH值至9.0）。沉淀物中含有核衣殼和基質(zhì)多肽。2用含豐富病毒核衣殼的尿囊膜制備。從尿囊液呈HA陽性的感染雞胚中提取絨毛尿囊膜，將其勻漿或研碎，然后反復(fù)凍融三次，經(jīng)1000rp/m離心10分鐘，棄沉淀，取上清液用0.1%福爾馬林處理，制備抗原。附件三：靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）試驗(yàn)操作方法收獲接種病毒的SPF雞胚的感染性尿囊液，測定其血凝價(jià)大于1/16（24或lg24），將含毒尿囊液用滅菌生理鹽水稀釋10倍（切忌使用抗生素），將此稀釋病毒液以0.1mL/羽靜脈接種10只6周齡SPF雞,2只同樣雞只接種0.1mL稀釋液作對照（對照雞不應(yīng)發(fā)病，也不計(jì)入試驗(yàn)雞）。每隔24小時(shí)檢查雞群一次，共觀察10天。根據(jù)每只雞的癥狀用數(shù)字方法每天進(jìn)行記錄：正常雞記為0，病雞記為1，重病雞記為2，死雞記為3（病雞和重病雞的判斷主要依據(jù)臨床癥狀表現(xiàn)。一般而言，“病雞”表現(xiàn)有下述一種癥狀，而“重病雞”則表現(xiàn)下述多個(gè)癥狀，如呼吸癥狀、沉郁、腹瀉、雞冠和/或肉髯發(fā)紺、臉和/或頭部腫脹、神經(jīng)癥狀。死亡雞在其死后的每次觀察都記為3）。IVPI值＝每只雞在10天內(nèi)所有數(shù)字之和/（10只雞×10天），如指數(shù)為3.00，說明所有雞24小時(shí)內(nèi)死亡；指數(shù)為0.00，說明10天觀察期內(nèi)沒有雞表現(xiàn)臨床癥狀。當(dāng)IVPI值大于1.2時(shí)，判定分離株為高致病力禽流感病毒（HPAIV）。附件四：瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）因?yàn)锳型流感病毒都有抗原性相似的核衣殼和基質(zhì)抗原，可以利用免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測A型流感病毒的存在與否。制備的濃縮病毒制劑含有基質(zhì)和核衣殼抗原；基質(zhì)抗原與核衣殼抗原相比擴(kuò)散得較快。瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)已作為常規(guī)試驗(yàn)方法來檢測雞與火雞的特異性抗體，并可作為雞群感染證據(jù)。1抗原制備一般常用的核衣殼濃縮制劑是從被感染的10日齡雞胚絨毛尿囊膜中獲得的，將其勻漿凍融三次，以1000rp/m離心10分鐘，取上清液加0.1%福爾馬林或1%β-丙內(nèi)酯滅活，再離心即可作為抗原。流感病毒感染后不是所有的禽種都能產(chǎn)生沉淀抗體。2瓊脂板制備該試驗(yàn)常用1克優(yōu)質(zhì)瓊脂粉或0.8-1克瓊脂糖加入100mL0.01mol/L、pH值7.2的8%氯化鈉-磷酸緩沖液中，水浴加熱融化，稍涼（60℃-65℃），倒入瓊脂板內(nèi)（厚度為3mm），待瓊脂凝固后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ么蚩灼髟诃傊迳习?孔梅花圖案打孔，孔徑約3mm3加樣用移液器滴加抗原于中間孔，周圍1、4孔加陽性血清，其余孔加被檢血清，每孔均以加滿不溢出為度，每加一個(gè)樣品應(yīng)換一個(gè)滴頭,并設(shè)陰性對照血清。4感作將瓊脂板加蓋保濕，置于37℃溫箱。24-48小時(shí)后，判定結(jié)果。5結(jié)果判定5.1陽性。[CX]陽性血清與抗原孔之間有明顯沉淀線時(shí)，被檢血清與抗原孔之間也形成沉淀線，并與陽性血清的沉淀線末端吻合，則被檢血清判為陽性。5.2弱陽性。被檢血清與抗原孔之間沒有沉淀線，但陽性血清的沉淀線末端向被檢血清孔偏彎，此被檢血清判為弱陽性（需重復(fù)試驗(yàn)）。5.3陰性。被檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線，且陽性血清沉淀線直向被檢血清孔，則被檢血清判為陰性。附件五：血凝抑制（HI）試驗(yàn)1操作程序1.1抗原血凝效價(jià)測定1.1.110%和0.5%雞紅細(xì)胞液的制備1.1.1.1采雞血：用注射器吸取阿氏液約1mL，取3日齡-10日齡SPF雞（最少2只），心臟采血約2mL-4mL，與阿氏液混合，放入裝10mL阿氏液的離心管中混勻。1.1.1.2洗滌雞紅細(xì)胞：將離心管中的血液經(jīng)1500rp/m-1800rp/m離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液，輕輕混合，再經(jīng)1500rp/m-1800rp/m離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再多次重復(fù)以上過程后，加入阿氏液20mL，輕輕混合成紅細(xì)胞懸液，4℃1.1.1.310%雞紅細(xì)胞懸液：取阿氏液保存不超過5天的紅細(xì)胞，在錐行刻度離心管中離心1500rp/m-1800rp/m8分鐘，棄去上清液，準(zhǔn)確觀察刻度離心管中紅細(xì)胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的生理鹽水，用吸管反復(fù)吹吸使生理鹽水與紅細(xì)胞混合均勻。1.1.1.40.5%雞紅細(xì)胞液：取混合均勻的10%雞紅細(xì)胞懸液1mL，加入19mL生理鹽水，混合均勻即可。1.1.2抗原血凝效價(jià)測定1.1.2.1于微量血凝板的A-G排各孔分別加入生理鹽水50μL。1.1.2.2A-G排每排的第1孔加入抗原50μL，每一種抗原的血凝效價(jià)測定應(yīng)作兩排檢驗(yàn)，如A1孔與B1孔各加入新城疫病毒抗原50μL；C1孔與D1孔各加入禽流感病毒（A型）抗原501.1.2.3用微量移液器從第1孔至第12孔對抗原作系列倍比稀釋，即將第1孔的抗原與生理鹽水用移液器反復(fù)吹吸3次，吸出50μL移至第2孔，用生理鹽水清洗吸頭3次后，再用于下一個(gè)孔的混合，以此類推，直至第12孔，從第12孔吸出50μL棄去，此孔抗原的最終稀釋度為1:4096。1.1.2.4每孔中加入0.5%雞紅細(xì)胞懸液50μL，包括H11孔與H12孔。1.1.2.5將血凝板置振蕩器上中速振蕩1-2分鐘。1.1.2.6置室溫（18℃1.1.2.7抗原血凝價(jià)判定：感作完畢，觀察血凝板，判讀結(jié)果（見下表）。表1：血凝試驗(yàn)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)類別孔底所見結(jié)果12345紅細(xì)胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細(xì)胞凝集紅細(xì)胞凝集基本同上，但孔底有大圈紅細(xì)胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊紅細(xì)胞于孔底形成小圓點(diǎn)，四周有少許凝集塊紅細(xì)胞于孔底呈小圓點(diǎn)，邊緣光滑整齊，即紅細(xì)胞完全不凝集++++++++++-能使紅細(xì)胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價(jià)，此效價(jià)為1個(gè)血凝單位。注意對照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗(yàn)無效。1.2血凝抑制試驗(yàn)1.2.1被檢血清樣品準(zhǔn)備1.2.1.1血清滅活：被檢血清，包括陽性、陰性血清，56℃1.2.2抗原準(zhǔn)備禽流感病毒（A型）作血凝抑制試驗(yàn)時(shí)各種抗原所用血凝單位是8個(gè)與4個(gè)血凝單位。8個(gè)血凝單位抗原的配置：如果某抗原的血凝效價(jià)為1：1024，8個(gè)血凝單位為1024/8=128（即1：128），取生理鹽水11.8mL，加入1：10稀釋的抗原1.0mL，混合均勻即為1：128稀釋液。1.2.3抗原血凝效價(jià)的重測定1.2.3.1為了確保血凝抑制試驗(yàn)時(shí)使用抗原的活性，有必要對已配置的8個(gè)血凝單位抗原進(jìn)行血凝效價(jià)的重測定，此項(xiàng)試驗(yàn)常與血凝抑制試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。1.2.3.2A至H各排第1孔分別加入1001.2.3.3A-H各排第2-8孔分別加入生理鹽水501.2.3.4將抗原分別作系列倍比稀釋至第8孔，從第8孔吸出50μL棄去。1.2.3.5每孔加0.5%雞紅細(xì)胞懸液50μL。1.2.3.6將血凝板置微量振蕩器振蕩1-2分鐘。1.2.3.7室溫（18℃1.2.3.8觀察結(jié)果，若血凝單位偏離兩個(gè)以上稀釋度，則血凝抑制試驗(yàn)無效。若血凝單位偏離1個(gè)稀釋度，屬可校正范圍，按常規(guī)對被檢血清的血凝抑制效價(jià)進(jìn)行校正。1.2.4血凝抑制試驗(yàn)1.2.4.1血凝板每排檢測一份被檢血清。第1孔分別加入被檢血清20μL，再加入生理鹽水80μL，被檢血清稀釋度為1：5。1.2.4.2設(shè)陽性血清和陰性血清對照。1.2.4.3每排第2孔分別加入50μL8個(gè)單位抗原，第3-11孔分別加入50μL4個(gè)單位抗原。1.2.4.4用移液器自第1孔吹吸3次后，取出50μL移至第2孔，以此倍比稀釋至第11孔，從11孔吸出50μL棄去。1.2.4.5第1孔為血清對照，第2孔被檢血清為1：10稀釋，第3孔為1：20，第4孔為1：40，以此類推，第11孔為1：5120。1.2.4.6每孔加入0.5%雞紅細(xì)胞懸液50μL。1.2.4.7將血凝板置微量振蕩器上振蕩1-2分鐘。1.2.4.8置室溫（18℃1.2.4.9感作完畢，將血凝板傾斜70°，凡沉淀于孔底的紅細(xì)胞沿傾斜面向下呈線狀流動(dòng)，呈現(xiàn)與紅細(xì)胞對照孔一樣者為完全不凝集孔。出現(xiàn)完全不凝集的血清最高稀釋度為該被檢血清血凝抑制效價(jià)。2結(jié)果判定禽流感（A型）的血凝抑制效價(jià)≥1:10為陽性。該試驗(yàn)中，雞血清極少出現(xiàn)非特異性陽性反應(yīng)，被檢血清不必進(jìn)行預(yù)處理。其它禽類血清可能對雞紅細(xì)胞有非特異性凝集反應(yīng)，可用雞紅細(xì)胞對被檢血清進(jìn)行吸附，以除去這種非特異性凝集特性。方法是在每0.5mL的被檢血清中加入0.025mL的雞紅細(xì)胞，輕搖后靜置30分鐘以上，1500rp/m離心2～5分鐘。也可用不具有特異性抗體的被檢禽紅細(xì)胞代替雞紅細(xì)胞。附件六：消毒1藥品種類燒堿、醛類、氧化劑類、氯制劑類、雙季胺鹽類等。2消毒范圍禽舍地面及內(nèi)外墻壁，舍外環(huán)境，飼養(yǎng)、飲水等用具，運(yùn)輸?shù)仍O(shè)施設(shè)備以及其它一切可能被污染的場所和設(shè)施設(shè)備。3消毒前的準(zhǔn)備3.1消毒前必須清除有機(jī)物、污物、糞便、飼料、墊料等；3.2消毒藥品必須選用對禽流感病毒有效的；3.3備有噴霧器、火焰噴射槍、消毒車輛、消毒防護(hù)器械（如口罩、手套、防護(hù)靴等）、消毒容器等。4消毒方法4.1金屬設(shè)施設(shè)備的消毒，可采取火焰、薰蒸等方式消毒；4.2禽舍、場地、車輛等，可采用消毒液清洗、噴灑等方式消毒；4.3養(yǎng)禽場的飼料、墊料等，可采取堆積發(fā)酵或焚燒等方式處理；4.4糞便等可采取堆積密封發(fā)酵或焚燒等方式處理；4.5飼養(yǎng)、管理等人員可采取淋浴消毒；4.6衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取消毒液浸泡、高壓滅菌等方式消毒；4.7疫區(qū)范圍內(nèi)辦公、飼養(yǎng)人員的宿舍、公共食堂等場所，可采用噴灑的方式消毒；4.8屠宰加工、貯藏等場所以及區(qū)域內(nèi)池塘等水域的消毒可采取相應(yīng)的方式進(jìn)行，避免造成污染。馬傳染性貧血防治技術(shù)規(guī)范馬傳染性貧血（EquineInfectiousAnemia,EIA,簡稱馬傳貧）,是由反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬馬傳貧病毒引起的馬屬動(dòng)物傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動(dòng)物疫病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。為預(yù)防、控制和消滅馬傳貧，依據(jù)《中華人民共和國動(dòng)物防疫法》及有關(guān)的法律法規(guī)，特制定本規(guī)范。1適用范圍本規(guī)范規(guī)定了馬傳貧的診斷、疫情報(bào)告、疫情處理、防治措施、控制和消滅標(biāo)準(zhǔn)。本規(guī)范適用于中華人民共和國境內(nèi)一切從事馬屬動(dòng)物飼養(yǎng)、經(jīng)營，馬屬動(dòng)物產(chǎn)品的生產(chǎn)、經(jīng)營，及從事動(dòng)物防疫活動(dòng)的單位和個(gè)人。2診斷本病依據(jù)流行特點(diǎn)、臨床癥狀、病理變化可做出初步診斷，確診需進(jìn)一步做瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）或病原分離鑒定。2.1流行特點(diǎn)本病只感染馬屬動(dòng)物，其中，馬最易感，驢、騾次之，且無品種、性別、年齡的差異。病馬和帶毒馬是主要的傳染源。主要通過虻、蚊、刺蠅及蠓等吸血昆蟲的叮咬而傳染，也可通過病毒污染的器械等傳播。多呈地方性流行或散發(fā)，以7～9月份發(fā)生較多。在流行初期多呈急性型經(jīng)過，致死率較高，以后呈亞急性或慢性經(jīng)過。2.2臨床癥狀本病潛伏期長短不一，一般為20～40天，最長可達(dá)90天。根據(jù)臨床癥狀，常分為急性、亞急性、慢性和隱性四種類型。急性型高熱稽留。發(fā)熱初期，可視粘膜潮紅，輕度黃染；隨病程發(fā)展逐漸變?yōu)辄S白至蒼白；在舌底、口腔、鼻腔、陰道粘膜及眼結(jié)膜等處，常見鮮紅色至暗紅色出血點(diǎn)（斑）等。亞急性型呈間歇熱。一般發(fā)熱39℃以上，持續(xù)3～5天退熱至常溫，經(jīng)3～15天間歇期又復(fù)發(fā)。有的患病馬屬動(dòng)物出現(xiàn)溫差倒轉(zhuǎn)現(xiàn)象。慢性型不規(guī)則發(fā)熱，但發(fā)熱時(shí)間短。病程可達(dá)數(shù)月或數(shù)年。隱性型無可見臨床癥狀，體內(nèi)長期帶毒。2.3病理變化2.3.1剖檢變化急性型主要表現(xiàn)敗血性變化，可視粘膜、漿膜出現(xiàn)出血點(diǎn)（斑），尤其以舌下、齒齦、鼻腔、陰道粘膜、眼結(jié)膜、回腸、盲腸和大結(jié)腸的漿膜、粘膜以及心內(nèi)外膜尤為明顯。肝、脾腫大，肝切面呈現(xiàn)特征性檳榔狀花紋。腎顯著增大，實(shí)質(zhì)濁腫，呈灰黃色，皮質(zhì)有出血點(diǎn)。心肌脆弱，呈灰白色煮肉樣，并有出血點(diǎn)。全身淋巴結(jié)腫大，切面多汁，并常有出血。亞急性和慢性型主要表現(xiàn)貧血、黃染和細(xì)胞增生性反應(yīng)。脾中（輕）度腫大，堅(jiān)實(shí)，表面粗糙不平，呈淡紅色；有的脾萎縮，切面小梁及濾泡明顯；淋巴小結(jié)增生，切面有灰白色粟粒狀突起。不同程度的肝腫大，呈土黃或棕紅色，質(zhì)地較硬，切面呈豆蔻狀花紋（豆蔻肝）；管狀骨有明顯的紅髓增生灶。2.3.2病理組織學(xué)病變主要表現(xiàn)為肝、脾、淋巴結(jié)和骨髓等組織器官內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹和增生。急性病例主要為組織細(xì)胞增生，亞急性及慢性病例則為淋巴細(xì)胞增生，在增生的組織細(xì)胞內(nèi)，常有吞噬的鐵血黃素。2.4實(shí)驗(yàn)室診斷2.4.1馬傳貧瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)（見附件一）。2.4.2馬傳貧酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)(見附件二)。2.4.3馬傳貧病原分離鑒定（見附件三）。2.4.4結(jié)果判定AGID試驗(yàn)陰性反應(yīng)馬屬動(dòng)物，還應(yīng)在1～2周后再次采血檢查，方可確診。ELISA可檢測早期和較低濃度的抗體。基于ELISA試驗(yàn)易產(chǎn)生假陽性，有必要時(shí)，陽性反應(yīng)血清需再次用AGID試驗(yàn)確診。幼駒檢測為陽性的，必須檢查母體的抗體情況。如果母體存在馬傳貧抗體,須隔6個(gè)月后再次檢查幼駒方可確診。3疫情報(bào)告3.1任何單位和個(gè)人發(fā)現(xiàn)患有本病或疑似本病的動(dòng)物，都應(yīng)當(dāng)及時(shí)向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告。3.2動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到疫情報(bào)告后，按《動(dòng)物疫情報(bào)告管理辦法》及有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。已經(jīng)通過農(nóng)業(yè)部驗(yàn)收達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)的地區(qū)，一旦再次發(fā)現(xiàn)疫情，視同新發(fā)動(dòng)物疫病的疫情報(bào)告規(guī)定處理和上報(bào)。4疫情處理4.1發(fā)現(xiàn)疑似馬傳貧病馬屬動(dòng)物后，畜主應(yīng)立即隔離疑似患病馬屬動(dòng)物，限制其移動(dòng),并立即向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告。動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到報(bào)告后,應(yīng)及時(shí)派員到現(xiàn)場診斷，包括流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀檢查、病理解剖檢查、采集病料、實(shí)驗(yàn)室診斷等，并根據(jù)診斷結(jié)果采取相應(yīng)防治措施。4.2在馬屬動(dòng)物飼養(yǎng)地，確診為馬傳貧病畜后，當(dāng)?shù)乜h級以上人民政府畜牧獸醫(yī)行政管理部門應(yīng)當(dāng)劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū);縣級以上地方人民政府根據(jù)需要組織有關(guān)部門和單位采取隔離、撲殺、銷毀、消毒、限制易感動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品及有關(guān)物品出入等控制、撲滅措施。若呈暴發(fā)流行時(shí)，由當(dāng)?shù)匦竽莲F醫(yī)行政管理部門，及時(shí)報(bào)請同級人民政府決定對疫區(qū)實(shí)行封鎖，逐級上報(bào)國務(wù)院畜牧獸醫(yī)行政管理部門?？h級以上人民政府根據(jù)需要組織有關(guān)部門和單位采取隔離、撲殺等強(qiáng)制性控制和撲滅措施，并迅速通報(bào)毗鄰地區(qū)。4.2.1劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)疫點(diǎn)指患病馬屬動(dòng)物所在的地點(diǎn)，一般是指患病馬屬動(dòng)物所在的養(yǎng)殖場（戶）或其它有關(guān)屠宰、經(jīng)營單位。疫區(qū)是指患病馬屬動(dòng)物所在的自然村（屯）、馬屬動(dòng)物飼養(yǎng)單位以及發(fā)病前3個(gè)月經(jīng)常活動(dòng)，可能污染的地區(qū)或以疫點(diǎn)為中心，半徑3～5公里范圍內(nèi)的區(qū)域。疫區(qū)劃分時(shí)注意考慮疫區(qū)的飼養(yǎng)環(huán)境和天然屏障（如河流、山脈等）。受威脅區(qū)是指疫區(qū)鄰近的自然村（屯）、單位，或疫區(qū)外順延5～30公里范圍內(nèi)的區(qū)域。4.2.2封鎖疫點(diǎn)（區(qū)）封鎖期間，禁止染疫和疑似染疫的馬屬動(dòng)物及其產(chǎn)品出售、轉(zhuǎn)讓和調(diào)群；繁殖馬屬動(dòng)物要用人工授精方法進(jìn)行配種；種用馬屬動(dòng)物不得對疫區(qū)外馬屬動(dòng)物配種；對可疑馬屬動(dòng)物要嚴(yán)格隔離檢疫；關(guān)閉馬屬動(dòng)物交易市場。禁止非疫區(qū)的馬屬動(dòng)物進(jìn)入疫區(qū)，并根據(jù)撲滅疫情的需要對出入封鎖區(qū)的人員、運(yùn)輸工具及有關(guān)物品采取消毒和其它限制性措施。4.2.3隔離當(dāng)發(fā)生馬傳貧時(shí)，要及時(shí)應(yīng)用臨床檢查、血清學(xué)試驗(yàn)等方法進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，將馬屬動(dòng)物群分為患病群、疑似感染群和假定健康群三類。立即撲殺患病群，隔離疑似感染群、假定健康群，經(jīng)過3個(gè)月觀察，不再發(fā)病后，方可解除隔離。4.2.4監(jiān)測疫區(qū)內(nèi)應(yīng)對同群馬屬動(dòng)物隔離飼養(yǎng)，所有馬屬動(dòng)物每隔1個(gè)月進(jìn)行一次血清學(xué)監(jiān)測；受威脅地區(qū)每3個(gè)月進(jìn)行一次血清學(xué)監(jiān)測。4.2.5撲殺患病馬屬動(dòng)物、陽性馬屬動(dòng)物在不放血條件下進(jìn)行撲殺。4.2.6無害化處理病畜和陽性畜及其胎兒、胎衣、排泄物等按照GB16548《畜禽病害肉尸及其產(chǎn)品無害化處理規(guī)程》進(jìn)行。4.2.7消毒對患病和疑似患病的馬屬動(dòng)物污染的場所、用具、物品嚴(yán)格進(jìn)行消毒；受污染的糞便、墊料等必須采用堆積密封發(fā)酵1個(gè)月等方法處理。4.2.8封鎖的解除封鎖的疫區(qū)內(nèi)最后一匹陽性馬屬動(dòng)物撲殺處理后，并經(jīng)徹底消毒等處理后，對疫區(qū)監(jiān)測90天，未見新病例；且經(jīng)血清學(xué)檢查3次（每次間隔30天），未檢出陽性馬屬動(dòng)物的，對所污染場所、設(shè)施設(shè)備和受污染的其它物品徹底消毒，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢查合格后，方可由原發(fā)布封鎖令機(jī)關(guān)解除封鎖。5預(yù)防與控制5.1加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高馬匹抗病能力。5.2認(rèn)真做好衛(wèi)生消毒、消滅蚊虻等工作，防止疫病傳播。5.3控制區(qū)、穩(wěn)定控制區(qū)和無疫區(qū),禁止接種疫苗。5.4異地調(diào)入的馬屬動(dòng)物，必須來自無疫區(qū)。調(diào)出馬屬動(dòng)物的單位和個(gè)人，應(yīng)按規(guī)定報(bào)檢，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢疫(應(yīng)包括血清學(xué)檢查),合格后方可調(diào)出。調(diào)入后必須隔離觀察30天以上，并經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)兩次臨床綜合診斷和血清學(xué)檢查，確認(rèn)健康無病，方可混群飼養(yǎng)。5.5運(yùn)出縣境的馬屬動(dòng)物，運(yùn)輸部門要憑當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)出具的檢疫證明運(yùn)輸。運(yùn)輸途中發(fā)現(xiàn)疑似馬傳貧病畜時(shí)，貨主及運(yùn)輸部門應(yīng)及時(shí)向就近的動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告，確診后，由動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)就地監(jiān)督畜主實(shí)施撲殺等處理措施。5.6監(jiān)測馬傳貧控制區(qū)、穩(wěn)定控制區(qū)采取“監(jiān)測、撲殺、消毒、凈化”的綜合防治措施。每年對全縣6～12月齡的幼駒，用血清學(xué)方法監(jiān)測一次。如果檢出陽性馬屬動(dòng)物，除按規(guī)定撲殺處理外，應(yīng)對疫區(qū)內(nèi)的所有馬屬動(dòng)物進(jìn)行臨床檢查和血清學(xué)檢查，每隔3個(gè)月檢查一次，直至連續(xù)2次血清學(xué)檢查全部陰性為止。馬傳貧消滅區(qū)采取“以疫情監(jiān)測為主”的綜合性防治措施,每縣每年抽查存欄馬屬動(dòng)物的1%（存欄不足10000匹的，抽檢數(shù)不少于100匹，存欄不足100匹的全檢）,做血清學(xué)檢查,進(jìn)行疫情監(jiān)測,及時(shí)掌握疫情動(dòng)態(tài)。6控制和消滅標(biāo)準(zhǔn)6.1穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)6.1.1縣級穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)必須滿足以下兩個(gè)條件:A、全縣（市、區(qū)或旗）范圍內(nèi)連續(xù)5年沒有馬傳貧臨床病例；B、全縣（市、區(qū)或旗）停止注苗一年后，連續(xù)兩年每年抽檢300匹份馬屬動(dòng)物血清（不滿300匹全檢），經(jīng)血清學(xué)檢查，全部陰性。6.1.2市級穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)全市（地、盟、州）所有縣（市、區(qū)、旗）均達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)。6.1.3省級穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)全省所有市（地、盟、州）均達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)。6.1.4全國穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)全國所有省（市、自治區(qū)）均達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)。6.2消滅標(biāo)準(zhǔn)6.2.1縣級達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)，在達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，還應(yīng)符合以下兩個(gè)條件:A、全縣（市、區(qū)或旗）范圍內(nèi)臨床綜合診斷無病畜。B、全縣（市、區(qū)或旗）范圍內(nèi)在達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)后，連續(xù)兩年每年抽檢200匹份馬屬動(dòng)物血清（不滿200匹者全檢），血清學(xué)檢查全部為陰性。6.2.2市級消滅標(biāo)準(zhǔn)全市（地、盟、州）所有縣（市、區(qū)、旗）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。6.2.3省消滅標(biāo)準(zhǔn)全省所有市（地、盟、州）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。6.2.4全國消滅標(biāo)準(zhǔn)全國所有?。ㄊ?、自治區(qū)）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。附件一:馬傳染性貧血瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)試行操作方法1檢驗(yàn)用瓊脂板的制備1.1取高級瓊脂糖1克或普通瓊脂1.2克直接放入加有500mL蒸餾水的三角瓶中，配成2%的瓊脂溶液，在沸水浴中煮沸，全融化后再冷凝，切成1～1.5cm3小塊，裝入干凈砂布袋中，用10倍量自來水沖漂兩天，每天換水兩次，然后改用無離子水沖漂1～2天，每天換水兩次。將沖漂完畢的瓊脂小塊裝入1000mL三角燒瓶中，同時(shí)加入500mL無離子水再加入相當(dāng)于配制1000mL磷酸緩沖液（PBS液）或硼酸緩沖液（BBS液）的各種鹽類用量，再加入1%硫柳汞溶液10mL，在沸水浴中使之全融化并混勻。若是取優(yōu)質(zhì)瓊脂1克時(shí)，可直接放入含有1/萬硫柳汞的100mL的PBS或BBS液中，用熱水浴融化混勻。1.2融化后以兩層紗布夾薄層脫脂棉過濾，除去不溶性雜質(zhì)。1.3將直徑90mm的平皿放在水平臺(tái)上，每平皿倒入熱融化瓊脂液15～18mL，厚度約2.5mm左右，注意不要產(chǎn)生氣泡，冷凝后加蓋，把平皿倒置，防止水分蒸發(fā)，放在普通冰箱中可保存兩周左右。根據(jù)受檢血清樣品多少亦可采用大、中、小三種不同規(guī)格的玻璃板。10×16cm的玻璃板加注熱瓊脂液40mL；6×7cm的加注11mL；32×7.6cm的加注6mL。瓊脂經(jīng)處理后配成的瓊脂液，可裝瓶中用膠塞蓋好，以防水分蒸發(fā)，待使用瓊脂板時(shí)，現(xiàn)融化現(xiàn)倒。1.4打孔反應(yīng)孔現(xiàn)用現(xiàn)打。打孔器為外徑4及6mm直徑的薄壁型金屬打孔器。在坐標(biāo)紙上畫好七孔型圖案。把坐標(biāo)紙放在帶有瓊脂板的平皿或玻璃板下面，照圖案在固定位置上用金屬管打孔，將切下的瓊脂板取出，勿使瓊脂膜與玻璃面離動(dòng)。外周孔徑為6mm，中央孔徑為4mm，孔間距3mm，如圖1所示。圖17孔型(1)(2)(3)G(4)(5)(6)當(dāng)受檢血清數(shù)量多時(shí)，可用如圖2所示的檢測40份血清的圖案。圖240孔型010203040506+G+G+G+0708091011121314151617181920+G+G+G+G+2122232425262729293031323334+G+G+G+353637383940注解：圖1、圖2中的“G”字周圍應(yīng)有圓圈。2抗原檢驗(yàn)用抗原按馬傳貧瓊擴(kuò)抗原生產(chǎn)制造及檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行生產(chǎn)。3血清3.1檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：能與合格抗原在12小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生明顯致密的沉淀線的馬傳貧血清，做8倍以上的稀釋仍保持陽性反應(yīng)者為宜，小量分裝，凍結(jié)保存，使用時(shí)要注意防止散毒。3.2受檢血清：來自受檢馬的不腐敗的血清，勿加防腐劑和抗凝劑。4抗原及血清的添加打孔完畢，在瓊脂板上端寫上日期及編號等。在圖1(7孔型)的中央孔加抗原，2、5孔加檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，其余1、3、4、6孔加入受檢血清。在圖2(40份血清)的孔型所有①②③……數(shù)字號孔分別加入受檢馬血清，G為加抗原孔，+為加檢驗(yàn)用包被陽性血清孔，加至孔滿為止。平皿加蓋，待孔中液體吸干后，將平皿倒置，以防水分蒸發(fā)；瓊脂板則放入鋪有數(shù)層濕紗布的帶蓋搪瓷盤中。置15～30℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，逐日觀察3天并記錄結(jié)果。5判定陽性：當(dāng)檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間只有一條明顯致密的沉淀線時(shí)，受檢血清孔與抗原孔之間形成一條沉淀線；或者陽性血清的沉淀線末端向毗鄰的受檢血清的抗原側(cè)偏彎者，此種受檢血清判定為陽性。陰性：受檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線，或者標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線向毗鄰的受檢血清孔直伸或向受檢血清孔側(cè)偏彎者，此種受檢血清為陰性。疑似：標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線末端，似乎向毗鄰受檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎，但不易判斷時(shí)，可將抗原稀釋2倍、4倍、6倍、8倍進(jìn)行復(fù)試，最后判定結(jié)果。觀察時(shí)間可延至5天。判定結(jié)果時(shí)，應(yīng)從不同折光角度仔細(xì)觀察平皿上抗原孔與受檢血清孔之間有無沉淀線。判斷時(shí)要注意非特異性沉淀線。例如當(dāng)受檢馬匹近期注射過組織培養(yǎng)疫苗，如乙型腦炎疫苗等，可見與檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的沉淀線末端不是融合而為交叉狀，兩個(gè)血清間產(chǎn)生的自家免疫沉淀線等。6溶液的配制6.1pH7.4的0.01mol/L磷酸緩沖生理鹽水（PBS液）6.212水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）2.9克磷酸二氫鉀0.3克氯化鈉8.0克無離子水或蒸餾水加至1000mL6.3pH8.6硼酸緩沖液（BBS液）四硼酸鈉8.8克硼酸4.65克無離子水或蒸餾水加至1000mL6.4硫柳汞溶液硫柳汞1.0克無離子水或蒸餾水1000mL附件二:馬傳染性貧血酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接法）1總則本規(guī)程所規(guī)定的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）適用于馬傳染性貧血（以下簡稱馬傳貧）的檢疫，也可以用于馬傳貧弱毒苗免疫馬的抗體監(jiān)測。2材料準(zhǔn)備2.1器材2.1.1聚苯乙烯微量反應(yīng)板2.1.2酶標(biāo)儀2.2抗原、酶標(biāo)記抗體和陰、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清2.3試驗(yàn)溶液（配置方法見附錄）2.3.1抗原稀釋掖2.3.2沖洗液2.3.3酶標(biāo)記抗體及血清稀釋液2.3.4底物溶液2.3.5反應(yīng)終止液3操作方法3.1包被抗原用抗原稀釋液將馬傳貧ELISA抗原作20倍稀釋，用微量移液器將稀釋抗原加到各孔內(nèi)，每孔100μ1。蓋好蓋，置4℃冰箱放置24小時(shí)。3.2沖洗甩掉孔內(nèi)的包被液，注入沖洗液浸泡3分鐘，甩干，再重新注入沖洗液，按此方法洗3次。3.3被檢血清每份被檢血清及陽性對照血清、陰性對照血清均以血清稀釋液作20倍稀釋，每份被檢血清依次加兩孔，每孔加100μ1。每塊反應(yīng)板均需設(shè)陽性及陰性對照血清各兩孔，蓋好蓋，置37℃3.4沖洗方法同“3.2”3.5加酶標(biāo)記抗體將酶標(biāo)記抗體用稀釋液作1000倍稀釋。每孔加100μ1，蓋好蓋，置37℃3.6沖洗方法同“3.2”3.7加底物溶液每孔加新配制的底物溶液100μ1，于25℃～303.8終止反應(yīng)每孔滴加終止劑25μ1。3.9比色用酶標(biāo)測試儀在波長492nm下，測各孔降解產(chǎn)物的吸收值。4結(jié)果判定被檢血清兩孔的平均吸收值與同塊板陰性對照血清兩個(gè)孔的平均吸收值之比≥2，且被檢血清吸收值≥0.2者，為馬傳貧陽性。5附錄5.1聚苯乙烯微量板的處理5.1.1將聚苯乙烯微量板用溫水反復(fù)沖洗，徹底沖掉灰塵。5.1.2用無離子水沖洗3～4遍，室溫或37℃5.2試液的配制5.2.1抗原稀釋液：0.1mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液。甲液：0.1mol/LpH9.5碳酸鈉溶液，稱取無水Na2CO310.6克，以無離子水溶液溶解至1000mL。乙液：0.1mol/LpH9.5碳酸氫鈉溶液，稱取NaHCO38.4克，以無離子水溶液溶解至1000mL。取甲液200mL、乙液700mL混合即成。5.3沖洗液：0.02mol/LpH7.2PBS-0.05%吐溫-20。5.3.10.02mol/LpH7.2PBS液甲液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液稱取Na2HPO4.12H2O71.64克，以無離子水溶液溶解至1000mL。乙液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液稱取NaH2PO4.2H2O31.21克，以無離子水溶液溶解至1000mL。取甲液360mL，乙液140mL，NaCL38克，無離子水溶解至5000mL。5.3.20.02mol/LpH7.2PBS液1000mL，加吐溫-20液0.5mL混勻即成。5.3.3酶標(biāo)記抗體和血清稀釋液：0.02mol/LpH7.2PBS-0.05%吐溫-20，加0.1%明膠，加10%健康牛血清。5.3.4底物溶液：pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液，內(nèi)含0.04%鄰苯二胺和0.045%過氧化氫。5.3.4.1pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液：甲液0.1mol/L檸檬酸溶液，稱取檸檬酸（C6H8O7·H2O）21.01克以無離子水溶液溶解至1000mL。乙液0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液。取甲液243mL，乙液257mL混合即成。5.3.4.2稱取鄰苯二胺40mg溶于pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液100mL中。臨用前加30%過氧化氫150μL即成。根據(jù)試驗(yàn)需要可按此比例增減。5.3.5反應(yīng)終止劑：2mol/L硫酸；取濃H2SO4（純度95～98%）4mL加入32mL無離子水中混勻即成。附件三:馬傳染性貧血病毒分離鑒定通常是將病料接種于健康馬駒或接種于馬白細(xì)胞培養(yǎng)物，其中以接種馬駒法更為敏感。1馬匹接種試驗(yàn)1.1試驗(yàn)駒：選自非馬傳染性貧血（以下簡稱馬傳貧）疫區(qū)，1～2歲，經(jīng)3周以上系統(tǒng)檢查，確認(rèn)健康者。1.2接種材料：無菌采取可疑馬傳貧馬（最好是可疑性較大或高熱期病馬）的血液。如懷疑混合感染時(shí)，須用細(xì)菌濾器過濾血清，接種材料應(yīng)盡可能低溫保存，保存期不宜過長。接種前進(jìn)行無菌和安全檢查。1.3接種方法：常用2～3匹馬的材料等量混合，接種2匹以上的試驗(yàn)駒，皮下接種0.2～0.3mL左右。1.4觀察期3個(gè)月。每日早、晚定期測溫兩次，定期進(jìn)行臨床、血液學(xué)及抗體檢查。當(dāng)馬駒發(fā)生典型馬傳貧的癥狀和病理變化，或血清中出現(xiàn)馬傳貧特異性抗體時(shí)，即證明被檢材料中含有馬傳貧病毒。2用白細(xì)胞培養(yǎng)物分離病毒培養(yǎng)驢白細(xì)胞1～2天后，細(xì)胞已貼壁并伸出突起，換入新鮮營養(yǎng)液，并在營養(yǎng)液中加入被檢材料，接入被檢材料的量應(yīng)不大于營養(yǎng)液量的10%，否則可能使培養(yǎng)物發(fā)生非特異性病變。也可在傾棄舊營養(yǎng)液后，直接接種被檢材料，37℃吸附1～2小時(shí)后吸棄接種物，換入新鮮營養(yǎng)液。初代分離培養(yǎng)通常難以出現(xiàn)細(xì)胞病變，一般需盲傳2～3代，甚至更多的代次（每代7～8天）。如果被檢材料中有馬傳貧病毒存在，培養(yǎng)物將最終出現(xiàn)以細(xì)胞變圓、破碎、脫落為特征的細(xì)胞病變。為了證明細(xì)胞病變是由馬傳貧病毒而不是由其它原因引起的，應(yīng)該以馬傳染性貧血酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接法）（附件二）等檢查培養(yǎng)物的抗原性。如果引起白細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變并具有明顯的馬傳貧抗原性，則說明被檢材料中含有馬傳貧病毒。馬鼻疽防治技術(shù)規(guī)范馬鼻疽(Glanders)是由假單胞菌科假單胞菌屬的鼻疽假單胞菌感染引起的一種人獸共患傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動(dòng)物疫病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。為預(yù)防、控制和消滅馬鼻疽，依據(jù)《中華人民共和國動(dòng)物防疫法》及有關(guān)的法律法規(guī)，特制定本規(guī)范。1適用范圍本規(guī)范規(guī)定了馬鼻疽的診斷、疫情報(bào)告、疫情處理、防治措施、控制和消滅標(biāo)準(zhǔn)。本規(guī)范適用于中華人民共和國境內(nèi)一切從事馬屬動(dòng)物的飼養(yǎng)、經(jīng)營和馬屬動(dòng)物產(chǎn)品的生產(chǎn)、經(jīng)營，以及從事動(dòng)物防疫活動(dòng)的單位和個(gè)人。2診斷無臨床癥狀慢性馬鼻疽的診斷以鼻疽菌素點(diǎn)眼為主，血清學(xué)檢查為輔；開放性鼻疽的診斷以臨床檢查為主，病變不典型的，則須進(jìn)行鼻疽菌素點(diǎn)眼試驗(yàn)或血清學(xué)試驗(yàn)。2.1流行特點(diǎn)以馬屬動(dòng)物最易感，人和其它動(dòng)物如駱駝、犬、貓等也可感染。鼻疽病馬以及患鼻疽的其它動(dòng)物均為本病的傳染源。自然感染主要通過與病畜接觸，經(jīng)消化道或損傷的皮膚、粘膜及呼吸道傳染。本病無季節(jié)性,多呈散發(fā)或地方性流行。在初發(fā)地區(qū)，多呈急性、暴發(fā)性流行；在常發(fā)地區(qū)多呈慢性經(jīng)過。2.2臨床癥狀本病的潛伏期為6個(gè)月。臨床上常分為急性型和慢性型。急性型病初表現(xiàn)體溫升高，呈不規(guī)則熱（39～41℃）和頜下淋巴結(jié)腫大等全身性變化。肺鼻疽主要表現(xiàn)為干咳，肺部可出現(xiàn)半濁音、濁音和不同程度的呼吸困難等癥狀；鼻腔鼻疽可見一側(cè)或兩側(cè)鼻孔流出漿液、粘液性膿性鼻汁，鼻腔粘膜上有小米粒至高粱米粒大的灰白色圓形結(jié)節(jié)突出粘膜表面，周圍繞以紅暈，結(jié)節(jié)壞死后形成潰瘍，邊緣不整，隆起如堤狀，底面凹陷呈灰白色或黃色；皮膚鼻疽常于四肢、胸側(cè)和腹下等處發(fā)生局限性有熱有痛的炎性腫脹并形成硬固的結(jié)節(jié)。結(jié)節(jié)破潰排出膿汁，形成邊緣不整、噴火口狀的潰瘍，底部呈油脂樣，難以愈合。結(jié)節(jié)常沿淋巴管徑路向附近組織蔓延，形成念珠狀的索腫。后肢皮膚發(fā)生鼻疽時(shí)可見明顯腫脹變粗。慢性型臨床癥狀不明顯，有的可見一側(cè)或兩側(cè)鼻孔流出灰黃色膿性鼻汁，在鼻腔粘膜常見有糜爛性潰瘍，有的在鼻中膈形成放射狀斑痕。2.3病理變化主要為急性滲出性和增生性變化。滲出性為主的鼻疽病變見于急性鼻疽或慢性鼻疽的惡化過程中；增生性為主的鼻疽病變見于慢性鼻疽。肺鼻疽鼻疽結(jié)節(jié)大小如粟粒，高粱米及黃豆大，常發(fā)生在肺膜面下層，呈半球狀隆起于表面，有的散布在肺深部組織，也有的密布于全肺，呈暗紅色、灰白色或干酪樣。鼻腔鼻疽鼻中膈多呈典型的潰瘍變化。潰瘍數(shù)量不一，散在或成群，邊緣不整，中央象噴火口，底面不平呈顆粒狀。鼻疽結(jié)節(jié)呈黃白色，粟粒呈小豆大小，周圍有暈環(huán)繞。鼻疽斑痕的特征是呈星芒狀。皮膚鼻疽初期表現(xiàn)為沿皮膚淋巴管形成硬固的念珠狀結(jié)節(jié)。多見于前驅(qū)及四肢，結(jié)節(jié)軟化破潰后流出膿汁，形成潰瘍，潰瘍有堤狀邊緣和油脂樣底面，底面覆有壞死性物質(zhì)或呈顆粒狀肉芽組織。2.4實(shí)驗(yàn)室診斷2.4.1變態(tài)反應(yīng)診斷變態(tài)反應(yīng)診斷方法有鼻疽菌素點(diǎn)眼法、鼻疽菌素皮下注射法、鼻疽菌素眼瞼皮內(nèi)注射法，常用鼻疽菌素點(diǎn)眼法（見附件）。2.4.2鼻疽補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試驗(yàn)（見附件）。該方法為較常用的輔助診斷方法，用于區(qū)分鼻疽陽性馬屬動(dòng)物的類型，可檢出大多數(shù)活動(dòng)性患畜。2.5病畜的判定2.5.1具有明顯鼻疽臨床癥狀的馬屬動(dòng)物為開放性鼻疽病畜。2.5.2鼻疽菌素點(diǎn)眼陽性者為鼻疽陽性畜。3疫情報(bào)告3.1任何單位和個(gè)人發(fā)現(xiàn)患有本病或疑似本病的動(dòng)物，都應(yīng)當(dāng)及時(shí)向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告。3.2動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到疫情報(bào)告后，按《動(dòng)物疫情報(bào)告管理辦法》及有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。已經(jīng)通過農(nóng)業(yè)部驗(yàn)收達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)的地區(qū)，一旦再次發(fā)現(xiàn)疫情，視同新發(fā)動(dòng)物疫病的疫情報(bào)告規(guī)定處理和上報(bào)。4疫情處理4.1發(fā)現(xiàn)疑似患病馬屬動(dòng)物后，畜主應(yīng)立即隔離患病馬屬動(dòng)物，限制其移動(dòng)，并立即向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告。動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到報(bào)告后，應(yīng)及時(shí)派員到現(xiàn)場進(jìn)行診斷，包括流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀檢查、病理解剖、采集病料、實(shí)驗(yàn)室診斷等，并根據(jù)診斷結(jié)果采取相應(yīng)防治措施。4.2確診為馬鼻疽病畜后，當(dāng)?shù)乜h級以上人民政府畜牧獸醫(yī)行政管理部門應(yīng)當(dāng)立即派人到現(xiàn)場，劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū);采集病料、調(diào)查疫源，及時(shí)報(bào)請同級人民政府對疫區(qū)實(shí)行封鎖，并將疫情逐級上報(bào)國務(wù)院畜牧獸醫(yī)行政管理部門。縣級以上人民政府根據(jù)需要組織有關(guān)部門和單位采取隔離、撲殺、銷毀、消毒等強(qiáng)制性控制、撲滅措施，并通報(bào)毗鄰地區(qū)。4.2.1劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)疫點(diǎn)指患病馬屬動(dòng)物所在的地點(diǎn)，一般是指患病馬屬動(dòng)物的同群畜所在的養(yǎng)殖場（戶）或其它有關(guān)屠宰、經(jīng)營單位。疫區(qū)是指患病馬屬動(dòng)物所在的自然村（屯）、飼養(yǎng)馬屬動(dòng)物單位以及發(fā)病前三個(gè)月經(jīng)?；顒?dòng)的地區(qū)或以疫點(diǎn)為中心，半徑3～5公里范圍內(nèi)的區(qū)域。疫區(qū)劃分時(shí)注意考慮當(dāng)?shù)氐娘曫B(yǎng)環(huán)境和天然屏障（如河流、山脈等）。受威脅區(qū)是指疫區(qū)鄰近的自然村（屯）、單位，或疫區(qū)外順延5～30公里范圍內(nèi)的區(qū)域。4.2.2封鎖疫點(diǎn)（區(qū)）封鎖期間，染疫和疑似染疫的馬屬動(dòng)物及其產(chǎn)品不得出售、轉(zhuǎn)讓和調(diào)群,禁止移出疫區(qū)；繁殖馬屬動(dòng)物要用人工授精方法進(jìn)行配種；種用馬屬動(dòng)物不得對疫區(qū)外馬屬動(dòng)物配種；對可疑馬屬動(dòng)物要嚴(yán)格隔離檢疫；關(guān)閉馬屬動(dòng)物交易市場。禁止非疫區(qū)的馬屬動(dòng)物進(jìn)入疫區(qū)，并根據(jù)撲滅疫情的需要對出入封鎖區(qū)的人員、運(yùn)輸工具及有關(guān)物品采取消毒和其它限制性措施。4.2.3隔離當(dāng)發(fā)生馬鼻疽時(shí)，要及時(shí)應(yīng)用變態(tài)反應(yīng)等方法在疫點(diǎn)對馬屬動(dòng)物進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，將馬屬動(dòng)物群分為患病群、疑似感染群和假定健康群三類。立即撲殺患病群，隔離觀察疑似感染群、假定健康群。經(jīng)6個(gè)月觀察，不再發(fā)病方可解除隔離。4.2.4監(jiān)測疫區(qū)內(nèi)須對疑似感染馬屬動(dòng)物和周圍的馬屬動(dòng)物隔離飼養(yǎng)，每隔6個(gè)月監(jiān)測一次，受威脅區(qū)每年進(jìn)行兩次血清學(xué)（鼻疽菌素試驗(yàn)）監(jiān)測，直至全部陰性為止;無疫區(qū)每年進(jìn)行一次血清學(xué)監(jiān)測。4.2.5撲殺對臨床病畜和鼻疽菌素試驗(yàn)陽性畜，均須在不放血條件下進(jìn)行撲殺。4.2.6銷毀處理病畜和陽性畜及其胎兒、胎衣、排泄物等按照GB16548《畜禽病害肉尸及其產(chǎn)品無害化處理規(guī)程》進(jìn)行無害化處理。焚燒和掩埋的地點(diǎn)應(yīng)選擇距村鎮(zhèn)、學(xué)校、水源、牧場、養(yǎng)殖場等1公里以外的地方，挖深坑將尸體焚燒后掩埋，掩埋土層不得低于1.5米。4.2.7消毒對患病或疑似感染馬屬動(dòng)物污染的場所、用具、物品等嚴(yán)格進(jìn)行消毒；污染的墊料及糞便等采取堆積泥封發(fā)酵、高溫等方法處理后方可使用。4.2.8封鎖的解除疫區(qū)從最后一匹患病馬屬動(dòng)物撲殺處理后，并經(jīng)徹底消毒等處理后，對疫區(qū)內(nèi)監(jiān)測90天，未見新病例；且經(jīng)過半年時(shí)間采用鼻疽菌素試驗(yàn)逐匹檢查，未檢出鼻疽菌素試驗(yàn)陽性馬屬動(dòng)物的，并對所污染場所、設(shè)施設(shè)備和受污染的其它物品徹底消毒后，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢查合格，由原發(fā)布封鎖令機(jī)關(guān)解除封鎖。5預(yù)防與控制5.1加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好消毒等基礎(chǔ)性防疫工作，提高馬匹抗病能力。5.2異地調(diào)運(yùn)馬屬動(dòng)物，必須來自非疫區(qū)；出售馬屬動(dòng)物的單位和個(gè)人，應(yīng)在出售前按規(guī)定報(bào)檢，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢疫，證明馬屬動(dòng)物裝運(yùn)之日無馬鼻疽癥狀，裝運(yùn)前6個(gè)月內(nèi)原產(chǎn)地?zé)o馬鼻疽病例，裝運(yùn)前15天經(jīng)鼻疽菌素試驗(yàn)或鼻疽補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果為陰性，并簽發(fā)產(chǎn)地檢疫證后，方可啟運(yùn)。調(diào)入的馬屬動(dòng)物必須在當(dāng)?shù)馗綦x觀察30天以上，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)連續(xù)兩次（間隔5～6天）鼻疽菌素試驗(yàn)檢查，確認(rèn)健康無病，方可混群飼養(yǎng)。5.3運(yùn)出縣境的馬屬動(dòng)物，運(yùn)輸部門要憑當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)出具的運(yùn)輸檢疫證明承運(yùn)，證明隨貨同行。運(yùn)輸途中發(fā)生疑似馬鼻疽時(shí)，貨主及承運(yùn)者應(yīng)及時(shí)向就近的動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告，經(jīng)確診后，動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)就地監(jiān)督畜主實(shí)施撲殺等處理措施。5.4監(jiān)測穩(wěn)定控制區(qū)每年每縣抽查200匹（不足200匹的全檢），進(jìn)行鼻疽菌素試驗(yàn)檢查，如檢出陽性反應(yīng)的，則按控制區(qū)標(biāo)準(zhǔn)采取相應(yīng)措施。消滅區(qū)每縣每年鼻疽菌素試驗(yàn)抽查馬屬動(dòng)物100匹（不足100匹的全檢）。6控制和消滅標(biāo)準(zhǔn)6.1控制標(biāo)準(zhǔn)6.1.1縣級控制標(biāo)準(zhǔn)控制縣（市、區(qū)、旗）應(yīng)達(dá)到以下三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)：A、全縣（市、區(qū)、旗）范圍內(nèi),連續(xù)兩年無馬鼻疽臨床病例。B、全縣（市、區(qū)、旗）范圍內(nèi)連續(xù)兩年檢查，每年抽檢200匹（不足200匹全檢），經(jīng)鼻疽菌素試驗(yàn)陽性率不高于0.5%。C、鼻疽菌素試驗(yàn)陽性馬屬動(dòng)物全部撲殺，并做無害化處理。6.1.2市級控制標(biāo)準(zhǔn)全市（地、盟、州）所有縣（市、區(qū)、旗）均達(dá)到控制標(biāo)準(zhǔn)。6.1.3省級控制標(biāo)準(zhǔn)全省所有市（地、盟、州）均達(dá)到控制標(biāo)準(zhǔn)。6.1.4全國控制標(biāo)準(zhǔn)全國所有?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）均達(dá)到控制標(biāo)準(zhǔn)。6.2消滅標(biāo)準(zhǔn)6.2.1縣級消滅標(biāo)準(zhǔn)必須具備以下兩項(xiàng)條件：A、達(dá)到控制標(biāo)準(zhǔn)后，全縣（市、區(qū)、旗）范圍內(nèi)連續(xù)兩年無馬鼻疽疫情。B、達(dá)到控制標(biāo)準(zhǔn)后，全縣（市、區(qū)、旗）范圍內(nèi)連續(xù)兩年鼻疽菌素試驗(yàn)檢查，每年抽檢100匹（不足100匹者全檢），全部陰性。6.2.2市級消滅標(biāo)準(zhǔn)全市（地、盟、州）所有縣（市、區(qū)、旗）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。6.2.3省消滅標(biāo)準(zhǔn)全省所有市（地、盟、州）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。6.2.4全國消滅標(biāo)準(zhǔn)全國所有?。ㄊ?、自治區(qū)）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。附件:馬鼻疽診斷技術(shù)及判定標(biāo)準(zhǔn)1總則1.1為統(tǒng)一馬鼻疽（以下簡稱鼻疽）檢疫診斷技術(shù)及判定標(biāo)準(zhǔn)，并提高鼻疽診斷技術(shù)及判定標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性，特制定鼻疽診斷技術(shù)及判定標(biāo)準(zhǔn)（以下簡稱本標(biāo)準(zhǔn)）。1.2對馬、驢、騾進(jìn)行鼻疽檢疫時(shí)，統(tǒng)一按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定辦理。1.3本標(biāo)準(zhǔn)以鼻疽菌素點(diǎn)眼反應(yīng)為主。必要時(shí)進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、鼻疽菌素皮下注射反應(yīng)或眼瞼皮內(nèi)注射反應(yīng)。1.4凡鼻疽臨床癥狀顯著的馬、騾、驢，確認(rèn)為開放性鼻疽的，可以不進(jìn)行檢疫。1.5各種檢疫記錄表（見7附件），須保存2年以上。2鼻疽菌素點(diǎn)眼操作方法2.1器材藥品：2.1.1鼻疽菌素、硼酸、來蘇爾、脫脂棉、紗布、酒精、碘酒、記錄表。2.1.2點(diǎn)眼器、唇（耳）夾子、煮沸消毒器、鑷子、消毒盤、工作服、口罩、線手套。注意：在所盛鼻疽菌素用完或在點(diǎn)眼過程中被污染（接觸結(jié)膜異物）的點(diǎn)眼器，必須消毒后再使用。2.2點(diǎn)眼前必須兩眼對照，詳細(xì)檢查眼結(jié)膜和單、雙瞎等情況，并記錄。眼結(jié)膜正常者可進(jìn)行點(diǎn)眼，點(diǎn)眼后檢查頜下淋巴結(jié)，體表狀況及有無鼻漏等。2.3規(guī)定間隔5～6日做兩回點(diǎn)眼為一次檢疫，每回點(diǎn)眼用鼻疽菌素原液3～4滴（0.2～0.3mL），兩回點(diǎn)眼必須點(diǎn)于同一眼中，一般應(yīng)點(diǎn)于左眼，左眼生病可點(diǎn)于右眼，并在記錄中說明。2.4點(diǎn)眼應(yīng)在早晨進(jìn)行，最后第9小時(shí)的判定須在白天進(jìn)行。2.5點(diǎn)眼前助手固定馬匹，術(shù)者左手用食指插入上眼瞼窩內(nèi)使瞬膜露出，用拇指撥開下眼瞼構(gòu)成凹兜，右手持點(diǎn)眼器保持水平方向，手掌下緣支撐額骨眶部，點(diǎn)眼器尖端距凹兜約1cm，拇指按膠皮乳頭滴入鼻疽菌素3～4滴。2.6點(diǎn)眼后注意系栓。防止風(fēng)沙侵入、陽光直射眼睛及動(dòng)物自行磨擦眼部。2.7判定反應(yīng)。在點(diǎn)眼后3、6、9小時(shí)，檢查3次，盡可能于注射24小時(shí)處再檢查一次。判定時(shí)先由馬頭正面兩眼對照觀察，在第6小時(shí)要翻眼檢查，其余觀察必要時(shí)須翻眼。細(xì)查結(jié)膜狀況，有無眼眥，并按判定符號記錄結(jié)果。2.8每次檢查點(diǎn)眼反應(yīng)時(shí)均應(yīng)記錄判定結(jié)果。最后判定以連續(xù)兩回點(diǎn)眼之中最高一回反應(yīng)為準(zhǔn)。2.9鼻疽菌素點(diǎn)眼反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)：2.9.1陰性反應(yīng)：點(diǎn)眼后無反應(yīng)或結(jié)膜輕微充血及流淚，為陰性。記錄為“－”。2.9.2疑似反應(yīng)：結(jié)膜潮紅，輕微腫脹，有灰白色漿液性及粘液性（非膿性）分泌物（眼眥）的，為疑似陽性。記錄為“±”。2.9.3陽性反應(yīng)：結(jié)膜發(fā)炎，腫脹明顯，有數(shù)量不等膿性分泌物（眼眥）的為陽性。記錄為“＋”。3鼻疽菌素皮下注射（熱反應(yīng)操作方法）3.1藥品器材：3.1.1鼻疽菌素原液、來蘇爾、酒精、碘酒、脫脂棉、紗布、記錄表。3.1.2工作服、口罩、線手套、毛刷、毛剪、耳夾子、注射器、針頭、體溫計(jì)、煮沸消毒器、消毒盤、鑷子。3.2皮下注射前一日做一般臨床檢查，早午晚分別測量并記錄體溫，體溫正常的方可做皮下注射。3.3皮下注射前所測3次體溫，其中如有一次超過39℃，或3次體溫平均數(shù)超過38.53.4注射部位通常在左頸側(cè)或胸部肩胛前，術(shù)部剪毛消毒后注射鼻疽菌素原液1mL。3.5牲畜在注射后24小時(shí)內(nèi)不得使役，不得飲冷水。3.6注射通常在零點(diǎn)進(jìn)行。注射后6小時(shí)起測溫，每隔2小時(shí)測一次（即注射后6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小時(shí)），連續(xù)測溫10次后，再于36小時(shí)測溫一次，詳細(xì)記錄并劃出體溫曲線，同時(shí)記錄局部腫脹程度，以備判定。局部腫脹以手掌大（橫徑10cm）為明顯反應(yīng)。3.7皮下注射鼻疽菌素的馬、驢、騾可發(fā)生體溫反應(yīng)及局部或全身反應(yīng)。3.7.1體溫反應(yīng)：鼻疽病畜一般在皮下注射鼻疽菌素后6～8小時(shí)體溫開始上升，12～16小時(shí)體溫上升到最高，此后逐漸降低，有的在注射30～36小時(shí)后，體溫再度輕微上升。3.7.2局部反應(yīng)：注射部位發(fā)熱，腫脹疼痛，以注射后24～36小時(shí)最為顯著，直徑可達(dá)10～20cm，并逐漸消散，有時(shí)腫脹可存在2～3天。3.7.3全身反應(yīng)：注射后精神不振，食欲減少，呼吸短促，脈搏加快，步態(tài)踉蹌、戰(zhàn)栗，大小便次數(shù)增加，頜下淋巴結(jié)腫大。3.8鼻疽菌素皮下注射（熱反應(yīng)）判定標(biāo)準(zhǔn)如下：3.8.1陰性反應(yīng)：體溫升至攝氏39℃3.8.2疑似反應(yīng)：體溫升至39℃（不超過39.6℃），有輕微全身反應(yīng)及局部反應(yīng)者，或體溫升至3.8.3陽性反應(yīng)：體溫升至40℃以上稽留及有輕微局部反應(yīng)，或體溫在39℃以上稽留并有顯著的局部反應(yīng)（腫脹橫徑4鼻疽菌素眼瞼皮內(nèi)注射操作方法4.1藥品及器材：4.1.1鼻疽菌素（用前隨時(shí)稀釋，鼻疽菌素1份用0.5%石炭酸生理鹽水3份充分混勻）。4.1.21～2mL注射器、針頭（用前煮沸消毒）、消毒盤、煮沸消毒器、鑷子、耳夾子、工作服、口罩、線手套。4.1.3酒精、碘酒、硼酸、來蘇爾、紗布、脫脂棉、記錄表。4.2注射前檢查結(jié)膜及眼睛是否單、雙瞎等情況。注射后檢查頜下淋巴結(jié)及有無鼻漏，并詳細(xì)記錄檢查情況。4.3注射部位通常在左下眼瞼邊緣1～2cm內(nèi)側(cè)眼角三分之一處皮膚實(shí)質(zhì)內(nèi)，注射前用硼酸棉消毒注射部位。4.4注射前助手保定馬匹，術(shù)者用食指、拇指捏住下眼瞼，右手持注射器，手掌（小指外緣）支撐頭部對左手捏起的眼瞼皺襞術(shù)部斜向刺入下眼瞼皮內(nèi)，注入0.1mL鼻疽菌素，食指感覺注射液推進(jìn)遲滯，局部呈現(xiàn)小包，即為藥液已進(jìn)入皮內(nèi)。4.5注射一般在早晨。注射后第24、36、48小時(shí)分別進(jìn)行檢查。詳細(xì)記錄結(jié)果。4.6鼻疽菌素眼瞼皮內(nèi)注射反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)：4.6.1陰性反應(yīng)：無反應(yīng)或下眼瞼有極輕微腫脹、流淚的，為陰性反應(yīng)。記錄為“－”。4.6.2疑似反應(yīng)：下眼瞼稍腫脹，有輕微疼痛及發(fā)熱，結(jié)膜潮紅，無分泌物或僅有漿粘液性分泌物的，為疑似陽性，記錄為“±”。4.6.3陽性反應(yīng)：下眼瞼腫脹明顯，有顯著的疼痛及灼熱，結(jié)膜發(fā)炎畏光，有膿性分泌物的，為陽性。記錄為“＋”。5開放性鼻疽臨床診斷鑒別要領(lǐng)5.1將病畜保定，術(shù)者和助手穿工作服（避免白色），帶膠皮手套、口罩、風(fēng)鏡及保護(hù)面具，先用3%來蘇爾水，洗凈病畜鼻孔內(nèi)外后，在病畜前側(cè)面適當(dāng)位置，術(shù)者用手打開鼻孔，助手用反射鏡或手電筒照射鼻腔深部，仔細(xì)檢查粘膜上有無鼻疽特有結(jié)節(jié)潰瘍及星芒狀瘢痕及其它異狀。檢查完畢將服裝、器材分別進(jìn)行消毒（用3%來蘇爾水浸1小時(shí)或煮沸10分鐘），避免交叉?zhèn)魅尽?.2鼻腔鼻疽臨床癥狀如下：5.2.1鼻汁：初在鼻孔一側(cè)（有時(shí)兩側(cè)）流出漿液性或粘液性鼻汁，逐漸變?yōu)椴粷嵒尹S色膿性鼻汁，內(nèi)混有凝固蛋白樣物質(zhì)，有時(shí)混有血絲并帶有臭味，呼吸帶哮鳴音。5.2.2鼻粘膜發(fā)生結(jié)節(jié)及潰瘍：在流鼻汁同時(shí)或稍遲，鼻腔粘膜尤其是鼻中膈粘膜上出現(xiàn)新舊大小不同灰白色或黃白色的鼻疽結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)破潰構(gòu)成大小不等、深淺不一、邊緣隆起的潰瘍（結(jié)節(jié)與潰瘍多發(fā)生于鼻腔深部粘膜上），已愈者呈扁平如星芒狀、冰花狀的瘢痕。5.2.3頜下淋巴結(jié)腫大：急性或慢性鼻疽的經(jīng)過期頜下淋巴結(jié)腫脹，初有痛覺，時(shí)間長久，則變硬、觸摸無痛感，附著于下頜骨內(nèi)面不動(dòng)，有時(shí)也呈活動(dòng)性。5.3皮膚鼻疽臨床癥狀如下：皮膚鼻疽多發(fā)于四肢、胸側(cè)及下腹部，在皮膚或皮下組織發(fā)生黃豆大小或胡桃、雞蛋大結(jié)節(jié)，不久破裂流出粘稠灰黃或紅色膿汁（有時(shí)帶血）形成淺圓形潰瘍或向外穿孔呈噴火狀潰瘍。結(jié)節(jié)和潰瘍附近淋巴結(jié)腫大，附近淋巴管粗硬呈念珠狀索腫，腫脹周圍呈水腫浸潤，皮膚肥厚，有時(shí)呈蜂窩織炎，橡皮腿，公畜并發(fā)睪丸炎。5.4開放性鼻疽判定標(biāo)準(zhǔn)：5.4.1凡有5.2.1、5.2.2、5.2.3病變的，均為開放性鼻疽。5.4.2凡有第5.2.1病狀而無5.2.2、5.2.3病狀的或有5.2.1、5.2.3項(xiàng)病狀而無5.2.2病狀的，可用鼻疽菌素點(diǎn)眼，呈陽性反應(yīng)的為開放性鼻疽。5.4.3凡有5.3癥狀的，即為開放性鼻疽。5.5不具備5.4項(xiàng)癥狀，并有可疑鼻疽臨床癥狀的，判定為可疑開放性鼻疽。6鼻疽補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試驗(yàn)操作辦法6.1采取被檢血清6.1.1藥品器材：6.1.1.1來蘇爾、石炭酸、酒精、碘酒、紗布、脫脂棉。6.1.1.2滅菌試管、試管架、試管簽、送血箱、煮沸消毒器、消毒盤、鑷子、毛刷、毛剪、采血針（帶膠管、每針采一次后必須清洗煮沸消毒后，再行使用）。6.1.2在被檢牲畜頸前三分之一處靜脈溝部位剪毛消毒，將滅菌采血針刺入頸靜脈，使血液沿管壁流入試管內(nèi)，防止血液滴入產(chǎn)生泡沫，引起溶血現(xiàn)象。6.1.3采出的血液，冬季應(yīng)放置室內(nèi)防止血清凍結(jié)，夏季應(yīng)放置陰涼之處并迅速送往實(shí)驗(yàn)室。如在3晝夜內(nèi)不能送到，應(yīng)先將血清倒入另一滅菌試管內(nèi)，按比例每1mL血清加入1～2滴5%石炭酸生理鹽水溶液，以防腐敗。運(yùn)送時(shí)使試管保持直立狀態(tài)，避免振動(dòng)。6.2預(yù)備試驗(yàn)（溶血素、補(bǔ)體、抗原等效價(jià)測定）6.2.1準(zhǔn)備下列材料6.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)血清：鼻疽陰、陽性馬血清。6.2.1.2鼻疽抗原。6.2.1.3溶血素。6.2.1.4補(bǔ)體：采取健康豚鼠血清。采血前饑餓7～8小時(shí)，于使用前一日晚由心臟采血，如檢查材料甚多，需大量補(bǔ)體時(shí)，亦可由頸動(dòng)脈放血，放于培養(yǎng)皿或試管中，待血液凝固后再輕輕劃破或剝離血塊后移于冰箱，次日清晨分離血清。如當(dāng)日采血，可直接盛于離心管中，置恒溫箱20分鐘，將血塊攪拌后，在離心器中分出血清亦可。每次補(bǔ)體應(yīng)由3～4個(gè)以上豚鼠血清混合。6.2.1.5綿羊紅細(xì)胞：綿羊頸靜脈采血，脫纖防止血液凝固，并離心3次，以清洗紅細(xì)胞；第一次1500～2000rp/m離心15分鐘，吸出上清液加入細(xì)胞量3～4倍的生理鹽水輕輕混合后做第二次離心，方法同前。使用前將洗滌后的細(xì)胞做成2.5%細(xì)胞液（即1：40倍溶液）。稀釋后的紅細(xì)胞最多保存一天，但離心后的紅細(xì)胞在冰箱中可保存3～4日。6.2.1.6生理鹽水：1000mL蒸餾水中加入8.5g氯化鈉，滅菌后使用。6.2.2溶血素效價(jià)測定，每一月左右測價(jià)一次，按下列方法進(jìn)行（參照表一）。6.2.2.1將稀釋成1：100～1：5000不同倍數(shù)的溶血素血清各0.5mL分別置于試管中。6.2.2.2將1：20倍補(bǔ)體及1:40綿羊紅細(xì)胞各0.5mL分別加入上述試管中。6.2.2.3另外制作缺少補(bǔ)體、缺少溶血素的對照管，并補(bǔ)充等量生理鹽水。6.2.2.4每管分別添加生理鹽水1mL，置于攝氏37～38℃6.2.2.5觀察結(jié)果：能完全溶血的最少量溶血素，即為溶血素的效價(jià)，也稱為1單位（對照管均不應(yīng)溶血），當(dāng)補(bǔ)體滴定和正式試驗(yàn)時(shí)，則應(yīng)用2單位（或稱為工作量）即減少1倍稀釋。表一溶血素稀釋1：1001：5001：10001：15001：20001：25001：30001：35001：40001：5000對照溶血素1：20補(bǔ)體2.5%紅細(xì)胞生理鹽水0.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.00.50.50.51.0-0.50.51.50.5-0.51.5--0.52.06.2.3補(bǔ)體效價(jià)測定每次進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試驗(yàn)，應(yīng)于當(dāng)日測定補(bǔ)體效價(jià)。先用生理鹽水，將補(bǔ)體做1：20稀釋，然后按表二進(jìn)行操作。表二