板藍根顆粒開發(fā)方案

板藍根顆粒開發(fā)方案第1頁/共44頁

423前言1新藥申報與注冊5臨床研究4目錄臨床前研究3新藥的尋找2第2頁/共44頁新藥的發(fā)現(xiàn)臨床前研究臨床研究申報及后續(xù)工作基礎和應用研究發(fā)現(xiàn)并篩選藥物來源藥學藥理學毒理學Ⅰ期臨床試驗Ⅱ期臨床試驗Ⅲ期臨床試驗填寫新藥申請后續(xù)登記活動

新藥研發(fā)項目IV期臨床試驗第3頁/共44頁一、前言第4頁/共44頁分類及癥狀中醫(yī)分類：風寒型感冒（怕冷、發(fā)低熱、無汗、頭痛全身痛、痰稀、咳嗽痰為白粘痰，四肢酸痛、舌苔薄而潤，脈?。?/p>

風熱型感冒（高熱、咳嗽痰為黃稠膿性痰，不怕冷，頭痛，咽喉痛，舌苔微黃、口干、出汗多、舌苔白而干燥、脈浮數(shù)（較快））

暑濕型感冒（高熱、頭暈腦漲、心中燥熱，容易感到疲倦，無汗、口干，伴有嘔吐、惡心，尿量少而黃，舌苔黃膩）西醫(yī)分類：細菌性感冒、病毒性感冒感冒定義：感冒是由于上呼吸道感染引起的一種自愈性疾病，是包括鼻腔、咽或喉部急性炎癥的總稱，一般7d左右就會自行康復。第5頁/共44頁二、新藥的尋找第6頁/共44頁板藍根板藍根RadixIsatidis為十字花科植物菘藍IsatisindigoticaFort.的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，已有2000多年的歷史?！吨袊幍洹?985年版開始收載。具有清熱解毒、涼血利咽之功效，臨床上常用于病毒性疾病及細菌感染性疾病。作用：抗病毒（流感病毒、肝炎病毒、單純皰疹病毒、其他種類病毒）抗菌（金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、流感桿菌、腦膜炎雙球菌等）抗內(nèi)毒素、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛以及增強免疫等板藍根第7頁/共44頁板藍根化學成分1、有機酸類化合物吡啶三羧酸，順丁烯二酸，2-羥基-1,4-苯二甲酸和羥甲基糠酸2、生物堿類化合物2.1吲哚類生物堿2,5-羥基吲哚，2,3-二氫-4-羥基-2-氧-吲哚-3-乙腈，吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-葡萄糖苷，(E)-二氧羥芐吲哚酮2.2喹唑類生物堿

3-(2-hydroxyphenyl)-4-(3H)-quinazolinone和isaindigotonet2.3其他類型生物堿依靛藍雙酮3、微量元素K，Ca，Mg，Zn，F(xiàn)e，Cu，Mn，Pb，Hg，Ce,Co,Ni,Cd和As其中Ca,Mn,Zn,Fe含量較為豐富4、其他化學成分告依春、表告依春、1硫氰基-2-羥基-3-丁烯、(+)異落葉松樹脂醇，2-羥基-3-丁烯基-硫氰酸酯，1-硫氰酸-2-羥基-3-丁烯，5羥甲基糖醛，正丁基-β-D-吡喃型果糖板藍根第8頁/共44頁三、臨床前研究第9頁/共44頁板藍根新藥臨床前研究內(nèi)容藥學評價

藥材產(chǎn)地、產(chǎn)量、提取路線和制劑工藝、物質(zhì)基礎及質(zhì)量標準草案制訂等。藥理研究

藥效學、一般藥理學、藥代動力學及可能的作用機制研究。

毒理評價

急性毒性、長期毒性、特殊毒性（致畸、致癌、致突變）及其它毒性（刺激性、溶血、過敏、藥物依賴性）研究

。第10頁/共44頁一、藥學評價1板藍根配方顆粒制備工藝的研究1.1藥材種類板藍根飲片。板藍根又稱北板藍根，氣微，味微甜而苦澀。1.2有效成分多數(shù)學者還是認可板藍根中的有效成分為核苷類成分和表告依春。1.3提取工藝研究1.3.1提取方法：水提醇沉法由于表告依春是脂溶性成分，而腺苷是水溶性成分，所以為了最大限度的提高有效成分的含量，故采用先醇提再水提的提取工藝，增加了板藍根中有效成分的含量和提取率。提取方式選擇加熱提取方法，即熱提取法，且固液分離時應注意趁熱濾過，使藥效物質(zhì)較少損失。1.3.2提取工藝路線確定：第一步選擇乙醇作為提取溶劑，以醇濃度、液料比、提取時間為主要影響因素，通過單因素和響應面試驗對醇溶液提取最優(yōu)條件進行優(yōu)化，以其有效成分（表告依春）的含量為考察指標；第二步選擇水作為提取溶劑，選擇藥材的浸泡時間、加水量、提取時間及次數(shù)等以其核苷類（尿苷、鳥苷和腺苷）和表告依春的總含量為考察指標。第11頁/共44頁1.3.3分析方法的建立1.3.3.1色譜條件的確定1.3.3.2標準曲線的建立1.3.3.3精密度試驗1.3.3.4穩(wěn)定性試驗1.3.3.5重現(xiàn)性試驗1.3.3.6加樣回收率試驗1.3.4醇溶液提取工藝條件的研究1.3.5醇溶液提取最佳提取工藝的考察1.3.5.1響應面試驗設計1.3.5.2提取工藝的驗證性試驗1.3.6水溶液提取工藝條件的研究1.3.6.1藥材平均吸水量的考察1.3.6.2水提取工藝條件的考察1.3.6.3提取工藝的驗證性試驗一、藥學評價第12頁/共44頁1.4濃縮、干燥方法的確定藥材提取后，藥液與藥渣采用120目濾布趁熱濾過分離；減壓濃縮法，濃縮至相對密度1.05～1.15（80℃）；采用噴霧干燥法干燥。1.5成型工藝條件的確定制粒方法、輔料、顆粒性質(zhì)進行考察，最終確定最佳成型工藝。取板藍根飲片，加入水1.5倍量，浸泡1h后，用70%乙醇（液料比=12：1），提取1次，時間為1h，濾過，藥渣進行水提，每次加水8倍量，提取2次，每次1.5h，濾過，合并醇提水提的濾液，濾液減壓濃縮至相對密度1.05～1.1（580℃），噴霧干燥，加入糊精適量，干法制粒，干燥，整粒，即得。1.6工藝流程圖1.7包裝材料選擇——聚丙烯藥品包裝用復合膜袋1.8規(guī)格的確定——1.5g/袋1.9七批小試樣品試驗研究——板藍根配方顆粒的制備工藝、成品質(zhì)量穩(wěn)定1.10三批中試樣品試驗研究——板藍根配方顆粒的制備工藝具有可行性及合理性。一、藥學評價第13頁/共44頁2板藍根配方顆粒質(zhì)量標準的研究采用薄層色譜（TLC）法對板藍根配方顆粒有效成分表告伊春和腺苷進行了鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對腺苷、鳥苷、尿苷、表告依春進行了含量測定，對板藍根配方顆粒的質(zhì)量標準進行進一步的提高及完善。2.1質(zhì)量標準起草說明2.1.1藥品名稱2.1.2藥材來源2.1.3性狀——本品為淺黃棕色至棕褐色的顆粒；稍有清香氣，味微苦。2.1.4鑒別——表告依春、腺苷的鑒別。2.1.5檢查——粒度、水分、溶化性、裝量差異、重金屬、砷鹽、微生物限度2.1.6浸出物的測定2.1.7含量測定質(zhì)量標準：板藍根配方顆粒每袋含板藍根分別以其4種成分計，尿苷不少于0.1mg，鳥苷不少于0.1mg，表告依春不少于0.2mg，腺苷不少于0.1mg。一、藥學評價第14頁/共44頁3板藍根配方顆粒初步穩(wěn)定性的研究3.1考察內(nèi)容

樣品的性狀、鑒別、含量測定、水分、粒度、溶化性及微生物限度檢查。3.2考察方法

本藥品為顆粒劑，試驗方法采用加速試驗和長期試驗同時進行。3.3考察時間

長期穩(wěn)定性試驗：0月、3月、6月，共3次。加速穩(wěn)定性試驗：0月、1月、2月、3月、6月，共5次?！鞍逅{根配方顆?！辟A存條件為：密封“板藍根配方顆?！庇行跒椋?8個月一、藥學評價第15頁/共44頁1板藍根顆粒的藥效學研究——對甲型流感病毒小鼠的作用1.1動物：SPF級雌性BALB/c小鼠，80只，4～6周齡(體重18～20g)1.2分組：小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、達菲組（陽性對照組）、板藍根組4組。1.3劑量：板藍根組的給藥量為4.67g/(kg·d)(參照臨床劑量)，達菲組的給藥量為0.03g/(kg·d)。1.4方法1.4.1鼠的感染性:將小鼠乙醚吸入麻醉后，106TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）病毒液通過滴鼻途徑感染小鼠，每只小鼠的接種劑量為50μL，建立甲型流感病毒小鼠模型，對照組小鼠經(jīng)鼻腔滴入等量的生理鹽水。通過小鼠肺組織的PCR、肺組織病理結(jié)果可證實甲型H1N1病毒小鼠模型的成功建立。1.4.2給藥:板藍根組攻毒2h后灌胃給藥200μL、達菲組攻毒2h后灌胃給藥200μL，正常對照組及模型組灌胃給予生理鹽水200μL，每日1次，連續(xù)用藥5d。二、藥理研究第16頁/共44頁1.5觀察與檢查1.5.1觀察指標:用于觀察板藍根對感染小鼠肺組織的保護作用的小鼠共觀察14d，記錄小鼠的死亡數(shù)及生存天數(shù)，并計算存活率及延長生命率。用于觀察板藍根對甲型H1N1流感病毒感染小鼠死亡的保護作用的小鼠在第5天安樂，取肺組織留做病理檢查。1.5.2病理學檢查:無菌取小鼠的肺，福爾馬林溶液中固定24h，脫水，石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下下觀察其病理變化。1.6結(jié)果1.6.1板藍根顆粒對甲型H1N1流感病毒感染小鼠存活率的影響

實驗結(jié)果提示，板藍根可明顯降低甲型H1N1流感病毒感染小鼠的死亡率，與模型組比較差異顯著(P<0.05)，提示板藍根對甲型H1N1流感病毒感染的小鼠有保護作用（表1）。1.6.2板藍根顆粒對甲型H1N1流感病毒感染小鼠平均生存天數(shù)及延長生命率的影響實驗結(jié)果提示，板藍根可明顯可延長小鼠的存活天數(shù)，與模型組比較差異顯著，提示板藍根甲型H1N1流感病毒感染的小鼠有保護作用(表2)二、藥理研究第17頁/共44頁1.6.3病理學檢查

空白對照組動物肺臟均未見明顯病理改變。陽性對照(模型)組動物感染甲型H1N1病毒第5天后肺臟呈彌漫性肺炎改變；陽性藥(達菲)組部分動物(4例/10例)肺臟病變范圍較模型組小，病變程度與模型組基本一致，其余動物(6例/10例)與模型組病變范圍與程度基本一致；板藍根顆粒組部分動物(2例/10例)肺臟病變范圍較模型組小，病變程度與模型組基本一致，但其數(shù)量較陽性藥(達菲)組少，其余動物(8例/10例)與模型組病變范圍與程度基本一致。具體病變范圍結(jié)果見表3二、藥理研究第18頁/共44頁1.7討論板藍根組可明顯延長甲型H1N1病毒感染小鼠的存活天數(shù)，提高存活率，與模型組比較差異顯著(P<0.05)，提示板藍根顆粒對甲型H1N1病毒感染致肺部病變具有減輕作用。二、藥理研究第19頁/共44頁2板藍根抗病毒成分表告依春在大鼠體內(nèi)的藥代動力學2.1動物：SD大鼠,雌雄各半,體重250～300g2.2分組：板藍根溶液組2.3劑量：表告依春6.8mg/kg2.4方法2.4.1血漿中表告依春的測定2.4.1.1色譜條件2.4.1.2血漿樣品處理2.4.1.3血漿中表告依春的工作曲線制備2.4.1.4回收率和精密度試驗2.4.2動物試驗

SD大鼠6只,禁食12h,可自由飲水,給藥劑量按表告依春6.8mg/kg進行給藥。灌胃體積1mL/100g體重。給藥前及給藥后0.083,0.25,0.5,0.75,1,2,3,4,6,8,10,12,15h經(jīng)眼球后靜脈叢取血0.3mL,置肝素化試管中,離心取血漿0.1mL進行分析。給藥4h后腹腔補充生理鹽水1mL/100g體重。二、藥理研究第20頁/共44頁二、藥理研究2.4.2

數(shù)據(jù)處理用矩量法求算藥代動力學參數(shù),即AUC用梯形面積法計算,tmax和cmax用實測值進行計算,用末端相濃度(3個點)對時間直線回歸后求得末端消除速率常數(shù)λZ,從而計算t1/2。并用t檢驗進行統(tǒng)計。第21頁/共44頁3毛細管電泳法研究板藍根水提物抗流感病毒的作用機制顯微鏡檢判定板藍根不同處理方式下的紅細胞經(jīng)流感病毒侵染后的形態(tài)學差異,通過毛細管電泳結(jié)合顯微鏡鏡檢、血凝滴度指標進一步闡述板藍根抗流感病毒的生化機制。結(jié)果:經(jīng)過板藍根保護過的細胞,能阻止病毒對細胞的吸附,推測其可能是通過與細胞膜的作用來保護細胞。結(jié)論:板藍根通過結(jié)合到細胞膜上而起到保護細胞的作用,有效抑制了流感病毒對細胞的結(jié)合,從而達到抗病毒的目的。二、藥理研究結(jié)論：板藍根顆粒對感冒有一定的治療效果。第22頁/共44頁三、毒理評價急性毒性、長期毒性、特殊毒性（致畸、致癌、致突變）、局部用藥毒性、過敏試驗、刺激性試驗、溶血試驗藥物依賴性試驗第23頁/共44頁三、毒理評價1板藍根多糖的毒性試驗1.

1材料1.1.

1板藍根多糖的提取按照常規(guī)水煮醇沉法進行提取,使用前用雙重蒸餾水配制成1ml含多糖0．067g，高壓滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.

1.

2試驗動物清潔級昆明小白鼠。體重18～22g，鼠齡為6～8周。雌雄各半。1.2方法1.2.1急性毒性實驗及免疫器官指數(shù)的測定將板藍根多糖用雙蒸水配制成5個濃度，選取30只小白鼠(體重為20±2g)分成6組，每組五只，第六組為空白對照組，注射生理鹽水，其余五組分別用上述不同濃度的板藍根多糖腹腔注射，每只各2ml，相同飼養(yǎng)生活條件，飼養(yǎng)兩周時間，觀察小白鼠的活動情況，對參試小白鼠進行稱重，采血檢測紅細胞、白細胞數(shù)。采血完畢后，即進行第一頸椎脫臼致死，打開腹腔，觀察肝、肺、脾的形態(tài)學變化，并取出其免疫器官脾臟，用濾紙吸干血液后稱重，計算出脾臟和體重之間的比值(即為脾臟指數(shù))。通常用脾臟指數(shù)來反映機體的免疫功能，脾臟指數(shù)低則表示機體的免疫能力低下，反之則表示免疫功能增強。同時，采集肝臟、肺臟和脾臟制作組織切片，觀察這些內(nèi)臟器官的組織學變化。第24頁/共44頁三、毒理評價所有小白鼠全部存活，且均未出現(xiàn)異常。紅細胞數(shù)無明顯變化白細胞數(shù)雖有所變化，但差異不顯著第25頁/共44頁三、毒理評價板藍根多糖對機體臟器的影響各組的小白鼠均未出現(xiàn)出血、充血等病理現(xiàn)象，隨機抽取肺臟、肝臟、脾臟等樣本制作切片均無病理變化，說明該濃度范圍內(nèi)板藍根多糖對機體無明顯毒副作用。第26頁/共44頁三、毒理評價板藍根多糖能夠有效地提高小鼠脾指數(shù)，說明板藍根多糖可以明顯提高小白鼠機體的免疫功能。第27頁/共44頁三、毒理評價小白鼠接受板藍根多糖注射后，在此濃度范圍內(nèi)，濃度越高，E－玫瑰花環(huán)形成率也越高。血液中T－淋巴細胞的比率也就越高，免疫功能越強。第28頁/共44頁三、毒理評價1.2.1玫瑰花環(huán)形成試驗淋巴細胞懸液的制備:抓取小白鼠取血，每毫升加20IU肝素(200IU/mL肝素生理鹽水溶液)抗凝。取抗凝血1mL，加入Hanks＇液1mL，混勻后加在1mL淋巴細胞分離液上，2500r/min，離心10min，吸出細胞懸液，用Hanks＇液洗滌2次，棄上清，將沉積細胞用pH7．4含10%小牛血清和HanKs液配成1×106～2×106個的細胞懸液。紅細胞懸液的制備:新鮮采集的綿羊血液用生理鹽水洗滌、配成1%的綿羊紅細胞懸液。淋巴細胞與紅細胞的作用:取0．1mL淋巴細胞懸液與0．1L綿羊紅細胞懸液，置37℃水浴5min，500r/min，離心5min，置4℃冰箱1－2h。制片觀察:取淋巴細胞與紅細胞作用后的細胞懸液1滴放置玻片上，瑞－姬染色3min，顯微鏡觀察。凡一個T淋巴細胞吸附3個或3個以上綿羊紅細胞的花結(jié)即為一個Et－玫瑰花環(huán)，計200個淋巴細胞數(shù)，求出Et－玫瑰花環(huán)結(jié)合率。第29頁/共44頁三、毒理評價2板藍根對試驗性小鼠遺傳毒性的影響2.1材料與方法2.1.1藥品2.1.2實驗動物昆明種小白鼠雌雄各半,體重18～20g。ICR小鼠:雄性,體重18～22g。2.1.3板藍根水煎液的制備取干燥板藍根10g,粉碎后放入500ml去離子水,浸泡30min;燒杯中煮沸30min,收集藥液;再反復煎煮2次,收集3次藥液,一起過濾去渣,沸騰水浴濃縮至10ml,使藥液每毫升相當于生藥量1g。4℃冰箱保存待用。2.1.4實驗方法2.1.4.1小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗方法昆明種小鼠隨機分為陰性對照組(生理鹽水,腹腔注射);陽性對照組(30mgkg環(huán)磷酰胺,腹腔注射);中草藥水煎液誘變組(分成人臨床常用劑量的5、10、20倍組,灌胃給藥)。每組4只動物,雌雄各半。第30頁/共44頁三、毒理評價將中草藥水煎液按所需劑量稀釋成0.1ml只小鼠,各中草藥水煎液誘變組灌胃給藥,灌胃后36h頸椎脫臼法處死小鼠。陰、陽對照組分別腹腔注射生理鹽水、環(huán)磷酰胺(0.1ml只小鼠),注射后24h頸椎脫臼法處死小鼠。各組動物參照改良Jagetia方法制片:常規(guī)方法取股骨骨髓腔細胞,制成小牛血清細胞懸液,常規(guī)涂片,空氣晾干。甲醇固定,10%Giemsa染色。蒸餾水沖洗,干后鏡檢。每只動物觀察2000個嗜多染紅細胞,觀察含微核的嗜多染紅細胞數(shù),計算其千分率。2.1.4.2

小鼠精子畸形實驗方法ICR小鼠陰、陽對照組同微核試驗;中草藥水煎液誘變組取10、2.5、0.5倍人臨床常用劑量。每組6只雄性動物。將中草藥水煎液按所需劑量稀釋成0.1ml只小鼠,各中草藥水煎液誘變組灌胃給藥;同時陰、陽對照組分別腹腔注射生理鹽水、環(huán)磷酰胺(0.1ml只小鼠)。隔日給藥,連續(xù)3次。首次給藥4周后頸椎脫臼法處死小鼠。各組動物參照Wyrobek方法制片:分離附睪,剪碎,濾除組織碎片,制成生理鹽水懸液,常規(guī)涂片。氣干后甲醇固定5min,2%伊紅染色60min。蒸餾水沖洗,干后鏡檢。高倍鏡下觀察精子形態(tài),每只動物檢查首尾完整的精子1000個,按無鉤、無定型、香蕉形、胖頭和多頭多尾分別記數(shù)畸形精子數(shù)及總的精子畸形百分率。第31頁/共44頁三、毒理評價2.2實驗結(jié)果2.2.1板藍根的小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結(jié)果從表1可見,板藍根各劑量組誘發(fā)的微核千分率與陰性對照(生理鹽水)組相比,均具非常顯著性差異(P<0.01)。各劑量組之間未見顯著性差異,,未表現(xiàn)出明顯的劑量-反應效應。第32頁/共44頁三、毒理評價2.2.2板藍根的小鼠精子畸形實驗結(jié)果從表2可見,板藍根各劑量組誘發(fā)的精了畸形百分率與陰性對照(生理鹽水)相比,均具非常顯著性差異(P<0.01),且多頭多尾精子所占比例明顯增高。各劑量組之間未見顯著性差異,未表現(xiàn)出明顯的劑量-反應效應。各劑量組誘發(fā)的精子畸形類別及百分率與陽性對照(CP)組相比均無明顯差異。第33頁/共44頁四臨床研究第34頁/共44頁三、臨床研究1臨床應用1.1呼吸系統(tǒng)疾病的應用。板藍根在臨床上多用于治療病毒性感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、流行性腮腺